Líneas celulares

La generación, amplificación y titulación de los stocks de baculovirus recombinantes se realizaron en células de insecto Spodoptera frugiperda Sf9 adherentes mantenidas en cultivo en medio TC100 (Gibco) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS, Sigma), 2 mM de L-glutamina (Sigma) y antibióticos, 100 µg/ml de una mezcla de antibióticos penicilina-estreptomicina (Sigma) y 25 µg/ml de gentamicina (Sigma). La expresión de proteína recombinante se hizo en células de insecto Hi5 en suspensión, mantenidas en medio Express Five (Gibco) con 8 mM de L-glutamina y antibióticos. Ambas líneas celulares se cultivaron a 27ºC.

Para el trabajo con ECTV, tanto en la generación de virus recombinantes, como en la titulación de los stocks o la obtención de sobrenadantes de células infectadas con este virus, se utilizaron células BS-C-1 (células de epitelio renal de mono verde africano) que se crecieron a 37ºC, 95% de humedad relativa (HR) y 5% CO2 en

medio Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco) suplementado con 10% de FCS, 2 mM de L- glutamina y antibióticos.

Las líneas celulares, L929 (fibroblastos de ratón) y RAW267.3 (macrófagos de ratón) se mantuvieron en cultivo a 37ºC, 95% HR y 5% CO2 en medio DMEM (Gibco) suplementado con 10% FCS, 2 mM de L-

glutamina y antibióticos. Estas células se utilizaron, respectivamente, para experimentos de citotoxicidad y los estudios de la actividad del tmTNFα.

Para los ensayos relacionados con el análisis de las uniones a GAGs se utilizaron las líneas derivadas de ovario de hámster, CHO-K1 y sus mutantes para la expresión de GAGs en superficie, CHO-618 (mutación en la enzima galactosiltransferasa) y CHO-745 (mutación en la enzima xilosiltransferasa). Estas líneas se crecieron en medio DMEM: F12-HAM (Gibco), 1:1 (v/v), debidamente suplementado con 10% de FCS, 2 mM de L- glutamina y antibióticos, a 37ºC, 95% HR y 5% CO2.

Las células MOLT4 (linfocitos T humanos), A20 (linfoma B de ratón) y MonoMac1 (monocitos humanos) usadas en los ensayos de quimiotaxis, se crecieron en medio RPMI 1640 (MP Biomedicals) suplementado con 10% FCS, 2 mM de L-glutamina y antibióticos, a 37ºC, 95% HR y 5% CO2.

3.2 Virus

Para la expresión de proteína recombinante, el gen correspondiente se introdujo mediante recombinación en el genoma del baculovirus de la polihedrosis múltiple nuclear de la polilla Autographa califórnica, bajo el promotor de la polihedrina.

Para los experimentos de la patogénesis de mousepox, se utilizó la cepa Naval.Cam del virus ectromelia (ECTV Naval.Cam). La secuencia completa del genoma de este virus puede consultarse en www.poxvirus.org. ECTV Naval.Cam se aisló, tras tres rondas de plaqueo consecutivas, de una placa de lisis en monocapa de células BS-C-1 infectadas con una preparación del bazo de un ratón infectado con el virus original, ECTV Naval, cedido por Mark Buller (University of St. Louis, USA). ECTV Naval.Cam mostró la misma DL50 que ECTV

3.3 Citoquinas

Las citoquinas utilizadas en esta tesis se obtuvieron principalmente de las casas comerciales Peprotech y R&D Systems. Los viales se reconstituyeron en una solución de PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4

10mM y KH2PO4 2 mM) con 0,1% BSA a una concentración de 10 µM, a no ser que el fabricante aconsejase

otras condiciones. Las citoquinas se guardaron a -80ºC en alícuotas de 1 µM de un sólo uso. Por lo general, los productos de Peprotech se emplearon para ensayos de unión mientras que los de R&D Systems se utilizaron en ensayos de actividad y cálculo de afinidades. Para los ensayos de unión se utilizaron todos los TNFSFLs murinos y humanos comercialmente disponibles y un grupo reducido de CKs de ratón. En la Tabla 2 se detallan las citoquinas utilizadas, junto a sus receptores celulares.

3.4 Clonajes

El compendio de las construcciones realizadas, así como los oligonucleótidos utilizados en cada caso, se enumeran en las Tablas 3 y 4, respectivamente.

nombre común nombre sistemático receptores nombre común nombre sistemático receptores

TNFSFLs CKs

TNFβ/LTα TNFSFL1 TNFR1,TNFR2, HVEM I-TAC CXCL11 CXCR3, CXCR7 TNFα TNFSFL2 TNFR1, TNFR2 SDB1α CXCL12α CXCR4, CXCR7 LTβ (α1β2) TNFSFL3A LTβR, HVEM SDF1β CXCL12β CXCR4, CXCR7 LTβ (α2β1) TNFSFL3B LTβR, HVEM BCA1 CXCL13 CXCR5

OX40L TNFSFL4 OX40 BRAK CXCL14 desconocido CD40L TNFSFL5 CD40 MIP3α CCL20 CCR6 FasL TNFSFL6 Fas SLC CCL21 CCR7 CD27L TNFSFL7 CD27 MDC CCL22 CCR4 CD30L TNFSFL8 CD30 MPIF-2 CCL24 CCR3 4-1BBL TNFSFL9 4-1BB TECK CCL25 CCR9 TRAIL TNFSFL10 DCR1, DCR2, DR4, DR5 CTACK CCL27 CCR10 RANKL TNFSFL11 RANK MEC CCL28 CCR10 TWEAK TNFSFL12 FN14

APRIL TNFSFL13A BCMA, TACI BAFF TNFSFL13B BCMA, TACI, BAFFR LIGHT TNFSFL14 HVEM, LTβR, DR3 TL1A/VEGI TNFSFL15 DR3

Tabla 2. Listado de las citoquinas utilizadas. Se indican los TNFSFLs y las CKs utilizadas para el desarrollo de esta tesis. El nombre común de cada citoquina se acompaña de su nombre sistemático y sus receptores celulares conocidos.

Tabla 3. Listado de las construcciones generadas. Se indica, de izquierda a derecha, el nombre de la construcción, el gen de clonaje con el nombre del virus y la cepa que lo codifica entre paréntesis y el número de acceso al GenBank. Además, se muestra el nombre de la proteína codificada en cada caso y el vector de origen de donde se extrajo el gen. La última columna indica el vector en el que se clonó cada gen.

Gen GenBank Proteína Vector de origen Vector de destino pSP3 E6 (ECTV Naval) AJ567693 CrmD_ECTV pMS1 (Saraiva and Alcami, 2001) pFastBac1

pSP4 E6 (ECTV Naval) AJ567693 CrmD163 pMS1 pFastBac1

pSP5 E6 (ECTV Naval) AJ567693 CrmD181 pMS1 pFastBac1

pSP6 E6 (ECTV Naval) AJ567693 CRD-CrmD pMS1 pFastBac1

pSP8 K3R (CPXV Elephantpox) AJ272008 CrmE_CPXV pMS3 (Saraiva and Alcami, 2001) pFastBac1

pSP9 CPXV191 (CPXV Brighton Red) AAM13631 CrmC_CPXV pRA112 (Alejo et al., 2006) pFastBac1

pSP10 CPXV005 (CPXV Brighton Red) AAA60952 CrmB_CPXV pAH21 pFastBac1

pSP11 CPXV221 (CPXV Brighton Red) AAM13659 CrmD_CPXV DNA viral pFastBac1

pSP12 G2R (VARV Bangladesh 1975) AAA60933 CrmB_VARV pRA107 (Alejo et al., 2006) pFastBac1

pSP21 E6 (ECTV Naval) AJ567693 Mut4 pMS37 pMS30

pSP24 --- --- CrmC-SECRET pSP22 pFastBac1

El gen E6 de ECTV Naval que codifica para la proteína CrmD (1-320), se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del vector pMS1 utilizando los oligonucleótidos 5´CrmD34 y 3´CrmD33 incorporando las dianas de BamHI y XhoI en 5´ y 3´, respectivamente. Así, se subclonó sin su péptido señal (21-320) en el vector pFastBac1, previamente digerido con BamHI y XhoI, de forma que el gen quedó en fase de lectura con el péptido señal de la melitina en 5´ y con los tags V5 y 6xHis en 3´ para facilitar su purificación por cromatografía de afinidad. El plásmido resultante de la ligación se nombró pSP3. La misma estrategia se siguió para el clonaje en este vector de las dos versiones cortas del dominio C-terminal de CrmD, CrmD163 (CrmD163-320) y CrmD181 (CrmD181−320), utilizando el mismo molde, los oligonucleótidos 5´CrmD36 y 5´CrmD31, respectivamente y el 3´CrmD33 en ambos casos, generándose así los plásmidos pSP4 y pSP5, respectivamente.

Igualmente, para el clonaje de la forma corta del dominio N-terminal de CrmD, CRD−CrmD (CrmD21-151), en el vector pFastBac1, se utilizaron los oligonucleótidos CrmD34 y CrmD87 para extraer el gen por PCR del molde pMS1. Tras la ligación del producto de PCR en el vector digerido con BamHI y XhoI se obtuvo el plásmido pSP6.

Un procedimiento similar se siguió para clonar en el vector pFastBac1 los otros vTNFRs, CrmE de CPXV cepa Elephantpox, CrmC, CrmD y CrmB de CPXV cepa Brighton Red y CrmB de VARV cepa Bangladesh 1975. Los genes correspondientes se amplificaron por PCR a partir de construcciones preexistentes en el laboratorio (Tabla 3), mediante una pareja de oligonucleótidos que añadiesen la diana BamHI en 5´y XhoI en 3´para posteriormente clonarlos en el pFastBac1 de la misma manera que lo anteriormente explicado. Las construcciones resultantes se denominaron pSP8, pSP9, pSP10, pSP11 y pSP12, respectivamente (Tabla 3). Todas estas construcciones clonadas en el vector pFastBac1 se utilizaron para la generación de baculovirus recombinantes.

La construcción pSP24, para la expresión mediante baculovirus de una proteína CrmC fusionada al dominio SECRET de CrmD, se generó extrayendo por PCR el gen correspondiente del plásmido pSP22, que contenía esta fusión clonada en el vector pMS30. Para ello se utilizaron los oligonucleótidos 5´CrmC-Sp BamHI y CrmD33 y pSP22 como molde. Seguidamente se subclonó el producto de PCR en el vector pFastBac1 en las dianas BamHI y XhoI. No se detalla el clonaje de pSP22 ya que para esta tesis sólo se utilizó como molde de esta PCR.

Los mutantes puntuales de CrmD se realizaron utilizando el kit Quik Change Lightning Site-Directed Mutagenesis

Kit (Agilent Technologies). Este kit permite realizar mutaciones dirigidas siguiendo un protocolo sencillo.

Brevemente, tomando como molde el vector pSP3 (CrmD en pFastBac1) en el que se encuentra clonado el

Oligonucleótido Secuencia Vector

CrmD27 CGGAATTCCGATTTAATAACATTCGATTATATAG! pMS37 CrmD28 CCTGCAGCTCTGTAATGATGGACGTTATTTC! pMS37 CrmD31 CGCGGATCCGAATTCAATTCGAGTATATAGGAAGCAGCAGTAC! pSP5 CrmD33 GCGCTCGAGGCATCTCTTTCACAATCATTTGG! pSP3 CrmD34 GCGGGATCCGATGTTCCGTATACACCCATTAATGGG! pSP3 CrmD36 GCGGGATCCTTTAACAGCATAGATGTAGAAATTAATATGTATCC! pSP4 CrmD87 GCGCTCGAGGCACATATTACATCTCCTTTAGATG! pSP6

5´CrmE-Sp BamHI GGCGGATCCATGAAATGTGAACAAGGTGTCTC! pSP8

3´CrmE-Sp XhoI GGCCTCGAGGCTCTTGTCATTGGTTTACATTGATCAG! pSP8

5´CrmC-Sp BamHI CCCGGATCCGATATACCTACTTCGTCACTGCC! pSP9 3´CrmC-Sp XhoI GCGCTCGAGGCATTACATTTAGATAGTTTGCATGG! pSP9 5´CrmB CPXV-Sp BamHI CGCGGATCCGATATAACACCGCATGAACCATCC! pSP10 3´CrmB CPXV-SP XhoI GCGCTCGAGGCTAAAAAGTGGGTGGGATACTGGG! pSP10 5´CrmD CPXV-SP BamHI GCGCGGATCCGATGTTCCTTATGAACACATTAATGG! pSP11 3´CrmD CPXV-SP XhoI GCGCTCGAGGCATCTCTTTCACAATCATTTGGTGG! pSP11

5´CrmB VARV-Sp BamHI GCGGGATCCGCACCGTATACACCACCCAATGG! pSP12

3´CrmB VARV-Sp XhoI GCGCTCGAGGCTAAAAAGCGGGTGGGTTTGG! pSP12

Tabla 4. Oligonucleótidos. Listado de oligonucleótidos utilizados, indicando el nombre, la secuencia y la construcción final resultante de la ligación del producto de PCR. En la secuencia se subrayan los sitios de restricción incorporados en cada oligonucleótido: BamHI (GGATCC), XhoI (CTCGAG), EcoRI (GAATTC) y PstI (CTGCAG).

gen diana, se realizó una PCR con dos oligonucleótidos complementarios que contienen la mutación deseada. De esta manera se copió todo el vector incorporando la mutación. A continuación, se digirió con la enzima DpnI el DNA original que, por encontrarse metilado, es susceptible a la digestión y se transformaron bacterias ultracompetentes XL1Gold. Finalmente, se comprobó la incorporación de la mutación por secuenciación del DNA extraído de colonias individuales. En la Tabla 5 se muestra la lista de oligonucleótidos utilizados para la generación de los mutantes puntuales de CrmD. Siguiendo este mismo protocolo, se obtuvo el mutante N77F (Mut4) sobre el plásmido pMS37 que contiene el gen E6 (CrmD) de ECTV cepa Naval acompañado de sus regiones genómicas flanqueantes. Como resultado de la mutación se generó el plásmido pSP21 que fue utilizado para la obtención de un virus ECTV recombinante que expresase la proteína Mut4.