I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las técnicas para el acondicionamiento y esterilización de materiales y equipos más empleados en un laboratorio de microbiología industrial.
2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el análisis microbiológico. 3) Justificar la importancia de los métodos de esterilización para el control microbiológico de los
alimentos.
II. MARCO TEÓRICO
El acondicionamiento de los materiales así como la esterilización de los mismos es el primer paso en el control microbiológico de los alimentos, pues de él dependerá el éxito del análisis.
2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR
El calor actúa desnaturalizando y coagulando las proteínas.
2.1.1.- ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
Se requiere temperaturas elevadas y un periodo más prolongado de calentamiento que la esterilización con vapor. Su uso está limitado primariamente a la esterilización de material de vidrio y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor.
El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco debido a la desecación en general, lesión por oxidación y efectos tóxicos de los niveles de electrólitos. En ausencia de agua, disminuye el número de grupos polares de la cadena peptídica y se requiere más energía para abrir las moléculas, de allí la aparente mayor estabilidad del organismo.
Se emplea el horno o estufa de esterilización, en la que se aplica una temperatura de 160-170ºC durante 1 hora.
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de kolhe, espátulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar rápidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.
b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriológico u horno Pasteur, donde se esteriliza el material a temperaturas de 170º-180ºC por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar material de vidrio.
2.1.2 ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas partes del recipiente de esterilización, el vapor debe conservarse a una presión de 1000g/cm3 sobre
la presión atmosférica para obtener una temperatura de 121ºC. Se produce también rupturas de cadena única en el ADN, y la pérdida de la viabilidad de las células expuestas a calor leve puede correlacionarse con la introducción de estas rupturas. La lesión de ADN parece ser enzimática, como resultado de activación o liberación de una nucleasa.
El calor produce también una pérdida de la integridad funcional de la membrana y filtración de pequeñas moléculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosómico y aparentemente es resultado de la degradación de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el tratamiento con calor. Existe también degradación del ARN ribosómico y la pérdida de viabilidad de las células expuestas a temperaturas elevadas.
a) Por Ebullición. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100ºC) por 15-35 minutos. b) Vapor de agua sin Presión. Se coloca el material a esterilizar a la acción del vapor de agua y a temperatura no mayor de 100ºC; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta. Se utiliza para materiales termolábiles como es el caso de algunos medios de cultivo.
c) Vapor de agua con Presión. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presión y 121ºC por 15- 20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurización o tindalización.
c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilíndrica, paredes
resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de:
♠ Caldera de material resistente, fondo cóncavo cubierta de una camisa metálica cilíndrica.
♠ Dispositivos para la instalación de la fuente calorífica (gas, electricidad o vapor de agua).
♠ Orificios superiores para purga de gases de combustión.
♠ Tapa con válvula de seguridad, espita, manómetro.
♠ Canastilla para colocar el material a esterilizar.
2.2 ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN
Consiste en hacer pasar las sustancias líquidas o gaseosas a esterilizar a través de membranas porosas que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilización de sustancias termolábiles. El material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.
Poseen efectos letales y mutagénicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente bactericida en la región espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, éste método presenta muchas dificultades técnicas.
III. MATERIALES Y EQUIPO
- Material de vidrio: pipetas, palcas Petri - Erlenmeyer, tubos de ensayo
- Papel craff, algodón, gasa, tijeras - Mechero de Bunsen
- Horno Pasteur de aire caliente - Autoclave
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
4.1 PREPARACIÓN DE MATERIAL A ESTERILIZARa) Preparación de tubos matraces
- Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilización deben llevar sus tapones de algodón respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos ni cortos, preparados según el método siguiente:
- De acuerdo al tapón a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodón de fibra, extendida, rectangular
- Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
- Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud. - Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para dársele la forma de cono
truncado, con el diámetro a la medida del recipiente a taponar, el tapón debe entrar en el recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.
Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel sólo la zona de las bocas.
Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodón, se cubre con papel kraft y se amarra con hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo - Rotular la fecha de preparación.
b) Preparación para proteger las pipetas
- En el extremo de succión de cada pipeta introducir una porción de algodón con auxilio de una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado.
- Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos, en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver toda la longitud de la pipeta girándose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal de la boquilla se remata con una torsión para protegerla y se rompe el resto de papel sobrante.
- Anotar con un lápiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilización.
- Cortar papel kraft tamaño adecuado para cubrir íntegramente las placas petri completas. - Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa poniéndose esta en el centro,
se envuelve la placa tomándose dos extremos opuestos del papel, dándose una vuelta alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan en triángulos, rematándose con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa, dándosele una apariencia de paquete de regalo.
4.2 ESTERILIZACIÓN CON CALOR SECO
El procedimiento de esterilización por aire caliente sólo se puede emplear con utensilios de vidrio o metal.
a) Procedimiento para la esterilización en horno
- Ponga el termostato a l75ºC y encienda el horno. - Si hay un ventilador verifique que esté funcionando.
- Vigile el termómetro. Cuando la temperatura llegue a l75ºC. sígase calentando durante 60 minutos más.
- Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60ºC. Abra la puerta del horno.
- El papel empleado para envolver deberá de haber tomado un color marrón oscuro, si el color del papel es amarillo pálido indicará que el horno no se ha calentado bastante. Si el papel se ha ennegrecido indicará que el horno se ha calentado demasiado.
4.3 ESTERILIZACIÓN CON CALOR HÚMEDO a) Procedimiento para la esterilización con autoclave
- Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cerciórese que el agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje.
- Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden añadir indicadores de la esterilización, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen al lograrse la temperatura adecuada.
- Cierre la tapa de la autoclave, cerciorándose de que la arandela de goma se encuentra en su surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo demasiado.
- Abrir la válvula de salida del aire. - Inicie el calentamiento de la autoclave.
- Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicará que todo el aire ha sido expulsado de la autoclave.
- Cierre a continuación la válvula de salida del aire. Apriétense los sujetadores de la tapa del autoclave y reduzca la temperatura ligeramente.
- Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120ºC se deberá regular el calor para conservarla. Y esperar por 15 minutos.
- Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.
- Cuando la temperatura descienda a menos de 80ºC abra la válvula de salida de aire para igualar las presione dentro y fuera del autoclave.
- Deje enfriar la autoclave y a continuación retire cuidadosamente la canasta con los utensilios estériles.
V. CUESTIONARIO
1. ¿Qué método de esterilización utilizó en la práctica, cite algunos ejemplos?
2. ¿Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control microbiológico, por qué?
3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el autoclave.
4. Compare la resistencia al calor de las células vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a que se debe tal diferencia.
5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilización.