SIEMBRA DE MICROORGANISMOS I OBJETIVOS
TECNICA DE LOS TRES GIROS
Se rotula la placa en forma análoga al caso anterior. Se toma inóculo con el asa de platino y se siembra por estría la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa unos 90º y volveremos a sembrar una segunda vez. Así sucesivamente hasta completar toda la siembre (girando de nuevo la placa 900) ésta técnica no es muy utilizada.
Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a una temperatura de 45 a 50ºC) en el tubo, en el tubo se adicionará la cantidad de inóculo que oscila entre 0,1 a 0,4 y se homogenizará la muestra en el tubo mediante el vibrador.
Una vez, constituida la muestra, se vierte ésta en la placa Petri estéril y se dejará solidificar, la mezcla también se podría realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenización en este caso es más difícil. Esta técnica es utilizada, por ejemplo, para la determinación de CMI (concentración mínima inhibitoria) de un antibiótico frente a determinados microorganismos.
c. SIEMBRA POR DISEMINACIÓN (CON ASA DE DIGRASKY).
Consiste en adicionar al medio sólido, un inóculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml según los casos con una pipeta graduada estéril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky también estéril. Esta técnica se puede utilizar para el recuento de células viables, antibíogramas, etc.
2.6. SIEMBRA DEL INÓCULO EN TUBO
a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SÓLIDO INCLINADO
Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra adecuada. Se añade al tubo desde el fondo de la superficie de ésta realizando movimientos ascendentes en zig - zag hasta completar toda la superficie del medio. Este método es utilizado para conservar cepas durante largos períodos, así como para la realización de ciertas pruebas bioquímicas como la prueba de ureasa.
b. SIEMBRA POR PICADURA
Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones también puede hacerse con asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo hasta el fondo de esta y en posición central. Esta técnica se utiliza para la siembra de medios de cultivo semisólidos ej. medio de oxidación - fermentación de Hugh-Leiffson.
c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA
Consiste en la utilización de las dos técnicas anteriormente descritas. Este método se lleva a cabo cuando elmedio es sólido y está inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y posteriormente la siembra por estría ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato entre otras.
2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA CELULARES
El empleo de microorganismos en Biotecnología se fundamente en la obtención de cultivos puros, que están constituidos por una única especie microbiana. La mayoría de las aplicaciones en biotecnología conlleve el uso de cultivos puros.
La mayoría de los métodos de obtención de cultivos puros se basa en algún método de dilución. El método más útil y práctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las células individuales queden separadas una de otras. Cada célula aislada crece ahora para formar una colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las células que componen la colonia son la progenie de una única célula original.
Existen varios métodos para confirmar la pureza de un cultivo:
1. Repitiendo la operación de aislamiento; una colonia aislada procedente de un aislamiento en placa inicial debería dar lugar al repetir la operación a colonias todas del mismo tipo, y cuya morfología concuerda con la del aislamiento inicial.
2. El examen microscópico de los organismos procedentes de una colonia deberían mostrar un único tipo celular. Los métodos diferenciales de tinción Gram, son útiles pare establecer que la colonia una mezcla de tipos microbianos diferentes.
Es necesario emplear una técnica aséptica para transferir los cultivos puros y para mantener la esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando asépticamente, el biotecnólogo tome prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la contaminación o de las soluciones con microorganismos no deseados.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
Material de Vidrio - Tubos de ensayo (16 x 125) (13 x 100) - Placas petra - Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml - Erlenmeyer Equipos - Estufa 37ºC - Autoclave Otros materiales - Gradillas - Mechero Bunsen - Asas de siembra - Algodón - PinzasReactivo y Medios de cultivo
- Medios de cultivo
Agar Mc Conkey
Agar nutritivo
Agar Saboraud
Agar TSI, LIA (tubos pico de flauta)
Agar SIM (tubos fondo)
Caldo SIM
IV. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS
4.1. SIEMBRA DE UNA MUESTRA LÍQUIDA CON EL ASA DE DIGRASKY
Muestra: Inóculo de un cultivo puro Medio de cultivo: Agar nutritivo
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4.2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA
Muestra: Microorganismos
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey Medio de cultivo: Agar EMB Medio de cultivo: Agar nutritivo Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características
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4.3. TÉCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES
Muestra: Muestra fermentada y de microorganismos Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey Medio de cultivo: Agar EMB Medio de cultivo: Agar nutritivo
Propósito: Obtener colonias aisladas para observar sus características
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V. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen?
2. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia?
3. ¿Por qué debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia?
4. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a ser inoculado.
5. Cuando tomas un inóculo de un tubo con agar inclinado. ¿por qué es necesario tocar una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
6. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de siembra?
7. ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación?