Estudios de la síntesis mitocondrial de proteínas en cíbridos transmitocondriales tratados con linezolid

concentración intermedia de linezolid (L3) nos reafirma que es importante trabajar en un rango de concentraciones que produzcan un efecto moderado. A las concentraciones L1 y L2, el linezolid produce solo un pequeño efecto, por lo que apenas encontramos diferencias entre los genotipos mitocondriales. A pesar de encontrar diferencias significativas a las concentraciones L4 y L5, estas no son suficientes para poder afirmar que en esas condiciones las variables haplogrupo y cantidad de p.MT-CO1 son dependientes. Esto se deberá posiblemente a que la inhibición del linezolid es bastante potente a esas dosis, por lo que es probable que todas las líneas celulares estén igualmente afectadas.

9.4. Estudios de la síntesis mitocondrial de proteínas en cíbridos

Fig.3.54. Síntesis mitocondrial de proteínas de las líneas celulares del haplogrupo T tratadas con linezolid. A. Gel de síntesis de proteínas. B y L3 indican ausencia y presencia de linezolid a la dosis L3 respectivamente. A la izquierda de la figura se indica el nombre del polipéptido equivalente a cada banda resuelta del gel. B. Control de carga con azul de Coomassie.

En primer lugar, se descartó que cualquier diferencia en la intensidad de la bandas en el gel de síntesis de proteínas se debiera a diferencias en la carga total de proteínas en el gel. Podemos realizar esta observación, porque no se observaron diferencias en el control de carga teñido con azul de Coomassie.

En general, los niveles de todas las subunidades codificadas en el mtDNA de cada línea celular eran similares en ausencia o presencia de linezolid. A continuación se muestra el mismo experimento realizado con 5 líneas celulares del haplogrupo mitocondrial J1 (Fig.3.55).

Fig.3.55. Síntesis mitocondrial de proteínas de las líneas celulares del haplogrupo J1 tratadas con linezolid. A. Gel de síntesis de proteínas. B y L3 indican ausencia y presencia de linezolid a la dosis L3 respectivamente. A la izquierda de la figura se indica el nombre del polipéptido equivalente a cada banda resuelta del gel. B. Control de carga con azul de Coomassie.

No se observaron diferencias en la carga total de proteínas en el gel, según la tinción de azul de Coomassie. A simple vista, parece que en las líneas celulares de este genotipo mitocondrial se produce una inhibición en la síntesis de proteínas cuando estas se tratan con el antibiótico linezolid. Por ultimó, se realizaron los mismos ensayos con las 5 líneas celulares del haplogrupo H1 y las 5 del haplogrupo H. En la siguiente figura (Fig.3.56), se muestra el resultado del ensayo de traducción mitocondrial con 3 cíbridos del haplogrupo H1 y uno del haplogrupo H no H1, en presencia y ausencia de linezolid.

Fig.3.56. Síntesis mitocondrial de proteínas de las líneas celulares de los haplogrupos H no H1 y H1 tratadas con linezolid. A. Gel de síntesis de proteínas. B y L3 indican ausencia y presencia de linezolid a la dosis L3 respectivamente. A la izquierda de la figura se indica el nombre del polipéptido equivalente a cada banda resuelta del gel. B. Control de carga con azul de Coomassie.

No se encontraron diferencias en la carga total de proteínas para las distintas líneas celulares en presencia o ausencia de antibiótico. Algunas de las líneas celulares mostraron menos síntesis de polipéptidos mitocondriales en presencia de la dosis L3 de linezolid. Sin embargo, en algunos de los cíbridos transmitocondriales no se observaron diferencias en la traducción mitocondrial en presencia o ausencia del antibiótico. Finalmente, la siguiente figura presenta el último de los ensayos de síntesis de proteínas, con 4 cíbridos del genotipo mitocondrial H no H1 y 2 del H1 (Fig.3.57).

Fig.3.57. Síntesis mitocondrial de proteínas de las líneas celulares de los haplogrupos H y H1 tratadas con linezolid. A. Gel de síntesis de proteínas. B y L3 indican ausencia y presencia de linezolid a la dosis L3 respectivamente. A la izquierda de la figura se indica el nombre del polipéptido equivalente a cada banda resuelta del gel. B. Control de carga con azul de Coomassie

En este caso tampoco hubo diferencias en la carga de proteínas totales entre las distintas líneas celulares. En algunas líneas celulares se observó una inhibición en la síntesis de subunidades codificadas por el mtDNA cuando se las trató con el antibiótico. Por otro lado, en algunas líneas cíbridas no se observaron diferencias en este parámetro en ausencia o presencia de linezolid.

Con el fin de obtener valores numéricos, para valorar de una forma cuantitativa la capacidad de traducción mitocondrial de las distintas líneas celulares en ausencia o presencia de antibiótico, se densitometraron los geles de síntesis de proteínas obtenidos. Para ello, se cuantificaron las bandas correspondientes a las subunidades p.MT-ND5, p.MT-CO3 y p.MT-ND3 y se calculó la media. Estas proteínas además de pertenecer a dos complejos respiratorios distintos, estaban situadas en las partes superior, media e inferior de los geles respectivamente. Se representó el % de cambio de cada línea celular al ser tratada con antibiótico, respecto a la condición sin linezolid. En la siguiente figura (Fig.3.58) se muestra el resultado de dicha cuantificación, separado según el haplogrupo de cada línea celular.

Fig.3.58. Cuantificación de la síntesis mitocondrial de proteínas en las 20 líneas celulares con la dosis L3 de linezolid, separadas según su haplogrupo mitocondrial. Los valores de la

cuantificación son los siguientes: Haplogrupo H no H1, 98,3 ± 27 (5). Haplogrupo H1, 78,0 ± 32 (5). Haplogrupo J1, 82,3 ± 9 (5). Haplogrupo T, 105,6 ± 16 (5).

Tal y como observamos con la cantidad de p.MT-CO1, el tratamiento con linezolid parece afectar de forma diferente a los distintos haplogrupos mitocondriales. De nuevo, el haplogrupo T seguido del H no H1, parecen ser los menos afectados por este antibiótico, al mostrar una mayor tasa de síntesis de proteínas mitocondriales. Los genotipos H1 y J1 son los más afectados por el linezolid y muestran una menor síntesis de proteínas mitocondriales. Sin embargo, un análisis estadístico ANOVA reflejó que en estas condiciones las variables haplogrupo mitocondrial y síntesis de proteínas eran independientes.

Dado que, al estudiar la cantidad de p.MT-CO1 entre las distintas filogenias mitocondriales, obtuvimos una mayor diferencia entre las líneas celulares J1 y T, comparamos los valores de la síntesis de proteínas mitocondriales solo entre estos dos haplogrupos mitocondriales. A continuación (Fig.3.59), se muestra dicha representación.

Fig.3.59. Cuantificación de la síntesis mitocondrial de proteínas de las líneas celulares de los haplogrupos J1 y T. Los valores de la cuantificación son los siguientes: Haplogrupo J1, 82,3 ± 9 (5). Haplogrupo T, 105,6 ± 16 (5). * denota significancia estadística.

Las líneas celulares del haplogrupo J1 mostraron una tasa de síntesis de proteínas mitocondriales significativamente menor que las líneas celulares del haplogrupo T. Además, encontramos una correlación significativa (r= 0,67, p=

0,03) entre los valores de la tasa de síntesis proteica mitocondrial y la cantidad del polipéptido p.MT-CO1 a la dosis de linezolid L3, para estas líneas celulares.

A continuación (Fig.3.60), se muestra la representación de dicha correlación.

Fig.3.60. Correlación entre los valores de la síntesis mitocondrial de proteínas y de la cantidad del polipéptido p.MT-CO1 de las líneas celulares de los haplogrupos J1 y T.

9.5. Estudio de la cantidad del complejo respiratorio IV en cíbridos