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Las líneas celulares de Cercopithecidae son fundamentalmente resistentes a los aminoglicósidos

RESULTADOS

4. Estudio evolutivo de la mutación patológica m.1494C>T en el mt-rRNA 12S

4.3. Las líneas celulares de Cercopithecidae son fundamentalmente resistentes a los aminoglicósidos

La ausencia de efecto fenotípico en parientes maternos, que presentaban la mutación m.1494C>T en homoplasmia, sugería que la mutación tenía penetrancia incompleta y que requería de otros factores para que se

En este sentido, se ha encontrado que los aminoglicósidos desencadenan la pérdida de audición en individuos que portan esta mutación (Zhao, Li et al. 2004; Rodriguez-Ballesteros, Olarte et al. 2006; Wang, Li et al.

2006; Zhu, Qian et al. 2006; Han, Dai et al. 2007; Yuan, Chen et al. 2007). El efecto de los aminoglicósidos se ha confirmado a su vez en distintas líneas celulares. De esta forma, cuando se cultivó con aminoglicósidos, los tiempos de doblaje de las líneas celulares mutantes fueron más altos que los de las wild-type (Zhao, Li et al. 2004; Zhao, Zhao et al. 2005).

Las posiciones equivalentes a m.1555 y m.1494 en el rRNA bacteriano (16S rRNA) se encuentran formando un par bases Watson-Crick, unión que resulta importante para la interacción con los aminoglicósidos. El mt-rRNA 12S humano wild-type carece de este apareamiento de bases, pero este se reconstruye con la mutación m.1494C>T (Hobbie, Akshay et al. 2008).

Por todo esto, decidimos analizar el efecto de los aminoglicósidos en la función OXPHOS de las especies Cercopithecidae. Para ello obtuvimos fibroblastos primarios a partir de un explante de piel de Macaca nemestrina (macaco de la tribu de los Papioni) y una línea celular de Cercopithecus aethiops (cercopiteco de la tribu de los Cercopithecini). Primero, confirmamos el origen de las especies y la presencia de la mutación m.1494C>T por secuenciación. En la siguiente figura (Fig. 3.12) podemos ver las secuencias de un fragmento del gen MT-RNR1 de estas especies.

Fig.3.12. Electroferograma de un segmento del gen MT-RNR1 (12S rRNA) de células de macaco y de cercopiteco. Se han marcado las posiciones m.1474, m.1494, m.1496.

Como se puede apreciar en la figura, la posición m.1474 sirve para diferenciar entre las dos especies Cercopithecidae, la línea celular de Macaca nemestrina tiene la variante m.1474G, y la de Cercopithecus aethiops la m.1474A. Por otro lado, pudimos comprobar que las dos especies portan la mutación m.1494C>T. Además de en esta familia de primates, esta mutación solo se ha descrito en el topo marsupial (Notoryctes typhlops), en el koala (Phascolarctos cinereus), en la rata-topo de Ehrenbergs (Nannospalax ehrenbergi), en los elefantes asiáticos y africanos (Elephas maximus, Loxodonta africana), en las dos especies extintas, mastodonte (Mamut americanum) y mamut lanudo (Mamuthus primigenius) y en los humanos mutantes (Homo sapiens), sin embargo podemos diferenciar las especies de Cercopithecidae de estas otras mencionadas, porque la variante m.1496C que como podemos observar, esta presente en nuestras dos líneas celulares, y no se ha encontrado en las otras especies previamente comentadas.

Un análisis con la herramienta Blast, de estos segmentos del gen MT-RNR1, confirmó el origen Cercopithecidae de estas líneas celulares. La secuencia de la primera línea celular tuvo un 97% de homología con una secuencia previamente descrita de Macaca nemestrina nemestrina. La secuencia de la segunda línea celular tuvo un 98% de homología con una secuencia ya descrita de Cercopithecus aethiops.

Se había descrito que líneas celulares linfoblastoides inmortalizadas y cíbridos transmitocondriales de la línea de osteosarcoma 143B, que portaban la mutación m.1494C>T, mostraron una disminución en su tasa de crecimiento, cuando fueron incubadas con 2 mg/ml del aminoglicósido paromomicina (Zhao, Li et al. 2004; Zhao, Zhao et al. 2005). Además, otras líneas celulares que portaban la otra mutación causante de sordera neurosensorial no sindrómica en humanos, la mutación m.1555A>G, también se vieron afectadas por este aminoglicósido (Guan, Fischel-Ghodsian et al. 2001; Giordano, Pallotti et al.

2002; Pacheu-Grau, Gomez-Duran et al. 2011). Por todo esto, decidimos analizar el efecto de los aminoglicósidos en la síntesis de proteínas mitocondrial en nuestras líneas celulares, utilizando para ello 2 y 4 mg/ml de paromomicina.

Primero analizamos la producción de subunidades OXPHOS codificadas en el mtDNA. Para ello, realizamos experimentos de síntesis mitocondrial de proteínas en nuestras líneas celulares en ausencia y presencia de 2 y 4 mg/ml de paromomicina. En resultado de dichos experimentos puede observarse a continuación (Fig.3.13).

Fig. 3.13. Síntesis mitocondrial de proteínas en líneas celulares Cercopithecidae. A. Gel de síntesis mitocondrial de proteínas. - , + y ++ indican ausencia y presencia de 2 y 4 mg/ml de paromomicina respectivamente. A la izquierda de la figura se indica el nombre del polipéptido equivalente a cada banda resuelta del gel. B. Control de carga con azul de Coomassie.

No hubo diferencias en la carga total de proteínas en el gel, según la tinción con azul de Coomassie. En ambas líneas celulares pudimos observar una disminución en la síntesis de subunidades OXPHOS codificadas en el mtDNA al añadir el antibiótico.

A continuación, estudiamos la cantidad del polipéptido p.MT-CO1, una subunidad de la citocromo c oxidasa, codificada en el mtDNA. Para ello realizamos un ensayo de Western blot, en distintas condiciones. Utilizamos la cantidad de la proteína actina, codificada en el nDNA, para normalizar los valores de p.MT-CO1. En la siguiente figura (Fig.3.14) podemos observar el resultado de estos experimentos.

Fig. 3.14. Western Blot para la proteína p.MT-CO1. –, + y ++ indican la ausencia, 2 mg/ml y 4 mg/ml de paromomicina respectivamente.

Se puede apreciar que, para la línea celular de macaco, los niveles de p.MT-CO1 eran similares en todas las condiciones. Sin embargo, en las células de cercopiteco, pudo observarse un aumento de la subunidad p.MT-CO1 al añadir el antibiótico. Estos resultados sugirieren por tanto, que los aminoglicósidos no tienen un efecto muy importante sobre la cantidad total de esta subunidad mitocondrial en estas líneas celulares. Esto nos indicaba, que quizás la mutación m.1494C>T estaba compensada de alguna manera en estas especies. Para obtener valores numéricos, cuantificamos la intensidad de las bandas del Western blot en las distintas condiciones. En la siguiente figura (Fig.3.15) podemos ver el resultado de dicha cuantificación.

Fig.3.15. Cuantificación de los experimentos de Western blot. La intensidad de la proteína mitocondrial p.MT-CO1, ha sido normalizada por la intensidad de la proteína actina, codificada en el núcleo. La intensidad normalizada de p.MT-CO1 de cada línea sin antibiótico se ha establecido como el 100%. + y ++ denotan 2 y 4 mg/ml de paromomicina respectivamente.

Tras la cuantificación, pudimos comprobar que prácticamente no había disminución en los niveles de p.MT-CO1 al añadir el antibiótico en la línea celular de macaco. En la línea celular de cercopiteco se produjo una pequeña inhibición de la cantidad de p.MT-CO1 con la dosis más baja de antibiótico, pero sin embargo se produjo un gran aumento en estos niveles, al añadir la concentración más alta de paromomicina.

En la presencia de aminoglicósidos, la conformación del rRNA se ve alterada y se pueden incorporar aminoácidos erróneos a las proteínas nacientes (Zingman, Park et al. 2007). Las subunidades catalíticas del complejo IV están codificadas en el mtDNA. Por lo tanto, para comprobar la existencia de posibles subunidades del complejo respiratorio IV anómalas y además comprobar los resultados obtenidos en el Western blot en estas células, determinamos la actividad específica y los niveles del complejo respiratorio IV,

mediante un ensayo espectrofotométrico. En la siguiente figura (Fig. 3.16) podemos contemplar estos resultados.

Fig.3.16. Actividad específica y cantidad de complejo respiratorio IV. La actividad específica y cantidad de complejo IV de cada línea sin antibiótico se han establecido como 100%. En fondo blanco se muestran los valores para la línea celular de Macaca nemestrina y en fondo negro los valores de Cercopithecus aethiops. En cada barra se indica la media ± desviación estándar (nº ensayos).

No se observaron diferencias significativas en la actividad específica ni en la cantidad de complejo respiratorio IV, en ninguna de las líneas celulares, cuando estas fueron incubadas con aminoglicósidos.

Estos resultados sugieren que las células de Cercopithecidae solo se ven afectadas por los aminoglicósidos en los ensayos de síntesis mitocondrial de proteínas. Por lo tanto, parece que la mutación m.1494C>T fundamentalmente no tiene efecto en estas células, ya que posiblemente este compensada de alguna manera.

Cuando existen defectos en el sistema de fosforilación oxidativa y se crecen las células en medio de cultivo suplementado con galactosa en lugar de glucosa, estas no pueden producir el ATP necesario para sus requerimientos

energéticos y el crecimiento celular se ve afectado. Por esta razón, crecimos estas células con distintos aminoglicósidos (paromomicina 2 y 4 mg/ml, geneticina 1 mg/ml) en medio DMEM suplementado con galactosa. Imágenes representativas de estos experimentos y su cuantificación, se pueden ver en la siguiente figura (Fig. 3.17).

Fig.3.17. Ensayos de viabilidad de células de 2 especies de Cercopithecidae y su cuantificación. A. Imágenes representativas de experimentos de crecimiento celular de

Cercopithecus aethiops en distintas condiciones. B. Imágenes representativas de experimentos de crecimiento celular de Macaca nemestrina en distintas condiciones. C. Cuantificación de los experimentos anteriores. * denota significancia estadística. % viabilidad. Cercopithecus

aethiops: Galactosa 100,0±22 (3). Paromomicina 2 mg/ml 86,5±7 (3). Paromomicina 4 mg/ml 87,9±5 (3). Geneticina 1 mg/ml 19,2±7 (3). Macaca nemestrina: Cercopithecus aethiops:

Galactosa 100,0±48 (2). Paromomicina 2 mg/ml 92,1±15 (2). Paromomicina 4 mg/ml 84,1±5 (2).

Geneticina 1 mg/ml 20,8±1 (3).

Las células de cercopiteco y de macaco no vieron inhibido su crecimiento al ser tratadas con 2 y 4 mg/ml de paromomicina. Sin embargo cuando estas células fueron crecidas con 1 mg/ml de geneticina, murieron.

4.4. Una sustitución Arginina >Leucina en la proteína MRPS12 podría