Evaluación de efluentes

A partir de los resultados obtenidos se demuestra que existen diferencias significativas entre las yeguas viejas y jóvenes subfértiles, tanto en la cantidad de cultivos bacteriológicos positivos como en el número de citologías positivas. Los resultados demuestran que en las yeguas viejas hay 2,6 y 2,5 veces más chances de encontrar un cultivo bacteriológico y una citología positiva, respectivamente. Estos resultados concuerdan con lo reportado en cuanto a la susceptibilidad de la yegua vieja a contraer endometritis (Troedsson et al., 2001; Pycock, 2006). Esto puede deberse principalmente por la mayor susceptibilidad de las yeguas viejas a la endometritis post-coital. En condiciones normales, luego del coito o una inseminación artificial, el lumen uterino de la yegua se contamina con microorganismos y residuos. Incluso se ha demostrado que los espermatozoides sin contaminación bacteriana inducen una respuesta inflamatoria uterina (Troedsson, 1995). En la mayoría de las yeguas, ésta endometritis transitoria se resuelve espontáneamente dentro de las 24 a 72 horas para que el ambiente uterino sea compatible con la vida embrionaria y fetal. Es importante considerar esta endometritis una reacción fisiológica para eliminar el exceso de esperma, plasma seminal, y los residuos inflamatorios del útero antes de que el embrión descienda desde el oviducto en el lumen uterino 5,5 días después de la fertilización.

Sin embargo, si la endometritis persiste después de 4 a 5 días en el diestro, además de ser incompatible con la supervivencia embrionaria, la liberación de PGF2α desencadena la luteólisis prematura, como consecuencia ocurre una rápida disminución de las concentraciones plasmáticas de progesterona y el retorno al estro. Estas yeguas se conocen como susceptibles a endometritis persistente y esta condición se da más frecuentemente en yeguas viejas (Allen y Pycock, 1988). Sin

103 embargo, existen reportes que mencionan la presencia de yeguas jóvenes susceptibles a endometritis post-coital (con una edad entre 5 y 11 años) (Fumuso, et. al. 2003).

Muchas de estas yeguas susceptibles a endometritis, tienen algunas características comunes: 1) las muestras de biopsias endometriales revelan cambios degenerativos glandulares y fibrosis estromal (endometrosis) como una consecuencia inevitable del envejecimiento, 2) presencia de fluido uterino, 3) un cuello uterino anormalmente cerrado, que no se relaja adecuadamente durante el estro de modo que el líquido no puede drenar y se acumula en el lumen uterino. En muchos casos, este fluido es negativo para el crecimiento bacteriano y para la presencia de neutrófilos. Una vez que la yegua es servida por un padrillo o inseminada, la acumulación de líquido se agrava a causa de un mal drenaje linfático y el deterioro en la fuerza de las contracciones del miometrio lo cual es agravado por el cuello del útero cerrado. La cantidad de fluido intrauterino varía individualmente entre las yeguas, pudiendo ser desde unos pocos mililitros a más de un litro en casos extremos. Como ya se mencionó, esta condición es más frecuente en yeguas de edad avanzada, sin embargo también puede darse en yeguas jóvenes, aunque los resultados de este trabajo demuestren que la incidencia de endometritis en las yeguas jóvenes subfértiles es estadísticamente inferior a lo ocurrido en yeguas viejas. Por tanto, la subfertilidad observada en las yeguas jóvenes no estaría relacionada con una mayor probabilidad de desarrollar una endometritis.

6. Biopsias endometriales

Los cambios endometriales son una de las causas que origina la muerte embrionaria temprana. La presencia de PMN y/o MN es indicador de enfermedad endometrial. En el caso de los PMN se presentan en la forma aguda de la enfermedad, mientras que en los MN se encuentran en la forma crónica. Esta situación suele desarrollarse en respuesta a cualquier perturbación dentro del útero (tanto normal [por ejemplo, una preñez] y anormal [por ejemplo, endometritis infecciosa]). Sin embargo, la inflamación crónica no parece afectar la fertilidad, ya que las yeguas viejas con inflamación crónica pueden mantener el desarrollo embrionario temprano (Ball et al., 1987). En un trabajo realizado por Ball et al., 1989 se transfirieron blastocistos morfológicamente normales en el útero de yeguas receptoras jóvenes (patología mínima) y viejas (patología extensa, de carácter degenerativo). Las tasas de supervivencia de embriones (55% y 45 % en el día 12) y las tasas de

104 pérdida de embriones entre los días 12 y 28 (9 y el 11%) no fueron significativamente diferentes para las yeguas receptoras jóvenes y viejas, respectivamente. Estos resultados indicaron que la patología uterina (fibrosis periglandular y la inflamación crónica) presente en úteros de las yeguas viejas no resultó en una mayor incidencia de pérdida embrionaria temprana. Por lo tanto, parece que otros factores son responsables de las mayores tasas de pérdida embrionaria observada en yeguas de edad avanzada.

Los resultados de esta tesis demuestran que no existen diferencias significativas en cuanto al número de PMN presentes tanto en el estrato compacto como esponjoso en los dos grupos de yeguas. Sin embargo, se observaron diferencias significativas en el número de MN presentes en el estrato compacto y esponjoso entre los dos grupos de estudio. En ambos estratos se halló mayor cantidad de MN en el grupo de yeguas viejas que en las yeguas jóvenes subfértiles lo que coincide con endometritis crónica. La mayor incidencia de esta afección en yeguas viejas según lo reportado por otros autores (Kenney, 1978; Gordon, 1978; Doig 1981) en cuanto a la mayor incidencia de endometritis crónica en yeguas viejas con respecto a las yeguas jóvenes subfértiles, no explicaría las causas de la subfertilidad, ya que este factor se da solo en el grupo de yeguas viejas y lo reportado por Ball indica que no afecta las tasas de pérdidas y de supervivencia embrionaria, a pesar que no evaluó los macrófagos a nivel endometrial.

7. Inmunohistoquímica

Los estrógenos y la progesterona, ejercen su acción en el endometrio a través de sus receptores (RE2 y RP) que actúan regulando el crecimiento y diferenciación del tejido al influir sobre la actividad celular (Ing et al., 1993). Además se ha demostrado en diferentes especies que estos esteroides tienen capacidad de modular la respuesta inmune. Así, concentraciones elevadas de estrógenos circulantes aumentan la migración tisular de PMN y su actividad fagocítica y altos niveles de progesterona actúan como modulador negativo de la actividad de los macrófagos, reduciendo su migración en el útero (Hunt et al., 1998; Wira et al., 2010). También se ha demostrado que en el endometrio, los esteroides sexuales participan en la producción de citoquinas y prostaglandinas por células epiteliales, del estroma e inmunes (Wira et al., 2010). Varios estudios demuestran que la cantidad de receptores de progesterona y estradiol en el endometrio de la yegua aumentan durante el estro y disminuyen durante el diestro (Bracher et al., 1991; Tomanelli et al., 1991; Watson et al.,

105 1992), lo cual está relacionado con las concentraciones plasmáticas de estas hormonas (Tomanelli et al., 1991; Aupperle et al., 2000).

En este trabajo se compararon la cantidad de células inmunomarcadas a RP y la inmunoreactividad de las mismas, en dos grupos de yeguas subfértiles de diferente grupo etario en el dia 8 post- ovulacion (diestro). Los resultados demostraron que no hay diferencias en cuanto a la cantidad de RP y su inmunoreactividad entre las yeguas jóvenes subfértiles y las viejas. Sin embargo se observó un patrón diferente de distribución de los RP entre ambos grupos. En las yeguas jóvenes subfértiles la cantidad de RP fue similar en los distintos estratos, en cambio en el grupo de yeguas viejas se encontraron mayor cantidad de receptores en el epitelio luminal en comparación con el resto de los estratos estudiados. Estos resultados se asemejan a lo reportado por Kalpokas et al., (2010) quienes detectaron una elevada inmunoreactividad de RP en el epitelio luminal y glandular del endometrio en el día 6 post-ovulación, sin embargo en este trabajo las yeguas fueron sometidas a una infusión intrauterina de iodo-povidona al 1% para evaluar el efecto de la misma sobre la expresión de receptores endometriales, por lo cual ese efecto podría ser consecuencia del tratamiento realizado. Por otro lado, los resultados de este trabajo no coinciden con lo reportado por Watson et al., (1992), quienes demostraron que durante el diestro la tinción para RE2 y RP tiende a disminuir en las células del estroma y del miometrio, mientras que la tinción en células epiteliales no fue afectada por la etapa del ciclo estral. En un trabajo de tesis de grado realizado en Área de Bioquímica de Facultad de Veterinarias de Montevideo1, se demostró que al día 7 post-ovulación (diestro) los niveles elevados de progesterona plasmática ejercieron un efecto inhibitorio sobre la expresión de RP en el epitelio luminal y el estrato esponjoso. En otro trabajo perteneciente al mismo grupo de investigación 2, que evaluó el efecto de diferentes dosis de un extracto de pared celular de

Mycobacterium phei (inmunomodulador) sobre la distribución del REα y RP en los diferentes tipos celulares del endometrio de yeguas con endometritis durante el ciclo estral, se demostró que al día 7 post ovulación en el grupo tomado como control (yeguas sin tratamiento) la mayor cantidad de RP se encontró en el epitelio glandular y la menor cantidad en el epitelio luminal. En cuanto a los estratos compacto y esponjoso se hallaron concentraciones intermedias.

Se ha reportado que existe una pérdida del RP en los epitelios uterinos inmediatamente antes de la implantación embrionaria en ovinos (Spencer y Bazer, 1995), equinos (McDowell et al., 1999), porcinos (Geisert et al., 1994) y bovinos (Robinson et al., 1999; Kimmins y MacLaren, 2001). A

106 pesar de ser la progesterona la hormona necesaria para el mantenimiento de la preñez, se ha establecido que la pérdida del RP en los epitelios es un factor clave para permitir la expresión génica de las proteínas que conforman el histotrofo como así también inducir los cambios moleculares necesarios para la implantación embrionaria (Bowen et al., 1996; Spencer y Bazer, 2004). Así, se ha determinado que la exposición del endometrio a la progesterona genera una disminución en la expresión de mucina de las células epiteliales, evento necesario para permitir la adhesión del embrión (Bowen et al., 1996).

El hallazgo en este trabajo de una mayor proporción de células inmunomarcadas a RP y con mayor intensidad en el epitelio luminal en el grupo de yeguas viejas podría sugerir alguna falla en la implantación embrionaria en yeguas de edad avanzada. Sin embargo, son necesarios otros estudios para corroborar esta cuestión.

1

Tesis de Grado: “Receptores de progesterona en tejido endometrial y en células del sistema inmune innato del endometrio de yeguas sanas y resistentes a endometritis”MCilintano Atrio Fac. de Veterinaria, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

2_{Tesis de Grado: “Efecto de un inmunomodulador sobre la distribución de receptores de estrógenos y}

progesterona endometriales en yeguas con endometritis” J. Danatrio, Fac. de Veterinaria, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay.

Sección Experimental II

Viabilidad celular y expresión génica en embriones de yeguas jóvenes subfértiles y viejas 1. Grado de desarrollo, integridad estructural y la viabilidad celular de los embriones.