Inmunohistoquímica

Para evaluar la presencia y distribución de RP en las células inmunes del endometrio, se utilizó la técnica inmunohistoquímica sobre secciones de 5 micras de tejido endometrial embebidos en parafina. Las secciones de biopsias, fueron tratadas en microondas a máxima potencia, sumergidas en citrato de sodio 0,01 M, pH= 6,0, para recuperacion antigenica. El anticuerpo primario utilizado fue anti-RP (Zymed cat # 18-0172, South San Francisco, CA, USA) diluído 1:50. Los controles negativos se realizaron remplazando el anticuerpo primario por PBS (Solución Buffer pH 7,4) y para controles positivos se utilizo tejido endometrial de yeguas en estro. Se utilizó el Sistema Universal de Dako: Compuesto del KIT Biotinilado Universal y Estreptoavidina conjugada con HRP, que utiliza DAB como cromógeno (LSAB™+ kit/HRP), y como coloración de contraste hematoxilina de Mayer.

68 Análisis de imágenes

Las imágenes fueron capturadas con una cámara Leica ICC50HD incorporada a un microscopio Leica DM500, utilizando el programa ―Leica Application Suite EZ‖. La presencia de RP, en el endometrio fue estimada por el método de doble ciego. Diez campos fueron evaluados en cada localización endometrial en lente de inmersión a 100X, por cada evaluador. Las células observadas fueron clasificadas como negativas o positivas, según la ausencia o presencia de tinción, respectivamente, y se tuvo en cuenta la localización en el endometrio. A su vez, en las células positivas se empleó una codificación adaptada de Boos et al. (1996), que clasifica la intensidad de la tinción (IT) cómo leve (IT1), moderada (IT2) o intensa (IT3), según se observe una coloración marrón clara, marrón o marrón oscuro, respectivamente.

El score de inmunorreactividad de los RP (PRIS) se calculó empleando la siguiente fórmula: PRIS = 1 x n(IT1) + 2 x n(IT2) + 3 x n(IT3) (1)

Donde n(ITn) = proporción de células (%) que exhibieron intensidad de tinción leve (IT1), moderada (IT2) e intensa (IT3).

Para el análisis estadístico, la cantidad de células inmunomarcadas fue expresada como porcentaje y analizada mediante el uso de una regresión logística mixta utilizando el GLIMMIX procedure del SAS (SAS Institute Inc., 2010). Se incluyó en el modelo al observador como efecto aleatorio y al grupo y localización en el endometrio como efectos fijos. También se evaluó la interacción entre efectos.

El PRIS fue expresado como media aritmética ± error estándar de la media (EEM) y analizado mediante el uso de un modelo lineal generalizado mixto utilizando el GLIMMIX procedure del SAS. Se asumió una distribución gamma de la variable respuesta, incluyéndose en el modelo los mismos efectos fijos y aleatorios utilizados en el análisis anterior.

Las comparaciones múltiples post hoc se realizaron empleando el test HSD de Tukey-Kramer. Para todos los análisis se fijó un nivel de significancia de α=0,05.

69 Sección Experimental II

Viabilidad celular y expresión génica en embriones de yeguas viejas y jóvenes subfértiles 1. Grado de desarrollo, integridad estructural y la viabilidad celular de los embriones

Luego de recuperados, todos los embriones fueron evaluados por su estado de desarrollo y tamaño de acuerdo al sistema propuesto por Mckinnon y Squires (1988) y Vanderwall (1996).

Durante tres temporadas fueron recolectados embriones de yeguas jóvenes subfértiles y viejas, en los días 7, 8 y 9 pos-ovulación. Cada embrión fue observado registrando su estadío en: Morula, Blastocisto Temprano, Blastocisto y Blastocisto Expandido. Dado que la variable en estudio (estadío del embrión), es una variable multinomial, la comparación entre los grupos etarios de yeguas fue realizada utilizando el procedimiento PROC GENMOD del SAS V9.3 (SAS Institute, Cary, N.Y.), en cada día pos-ovulación.

Luego de ser clasificados, los embriones obtenidos en la primera temporada se sometieron a pruebas de viabilidad embrionaria utilizando la combinación de fluorocromos Naranja de acridina (AO)/ Bromuro de Etidio (EB), para identificar células vivas y muertas respectivamente. Las muestras se observaron en un microscopio de epifluorescencia. La puesta a punto de esta combinación de fluorocromos fue realizada en embriones obtenidos de 4 ratonas previamente superovuladas y apareadas. Para esto, se colorearon un total de 40 embriones de ratón, y se ajustaron satisfactoriamente las concentraciones de ambos fluorocromos para identificar las células vivas y muertas. Posteriormente se utilizó el mismo protocolo para evaluar los embriones equinos.

Los embriones fueron colocados en 9 partes de medio Dulbecco MEM (DMEM) y 1 parte de AO (50 ug/ml) durante 4 minutos. Luego se agregó 1 parte de EB (50 ug/ ml) y se dejó actuar durante 2 minutos. A continuación fueron lavados en medio DMEM, se colocaron en portaobjetos y se fijaron con vapor de formol durante 2 min. Finalmente fueron montados con medio Pathomount® y observados en un microscopio de epifluorescencia a 40X. Se evaluaron un total de 22 embriones equinos pero desafortunadamente los resultados obtenidos durante la primera temporada de trabajo, no fueron satisfactorios con respecto a la prueba de viabilidad embrionaria con AO/ EB, ya que no permitió identificar de manera consistente las células vivas y muertas presentes en los embriones.

70 Figura 4: Embrión equino de 7 días correspondiente a una yegua joven coloreado con AO/ EB observado en

microscopio de epifluorescencia a 40x.

Luego de finalizada la temporada, se decidió optar por otra combinación de fluorocromos, compuesta por Hoescht 33452 y Propidio iodado (PI). Para poner a punto esta técnica, y evitar otra pérdida de muestras del trabajo experimental, se realizó un entrenamiento personal sobre fertilización in vitro (FIV) en bovinos en el Departamento de Química Biológica de la Universidad de Buenos Aires (UBA), y se ensayó esta combinación de fluorocromos en 50 embriones bovinos producidos in vitro y 5 embriones equinos producidos in vivo. Los embriones fueron incubados en estufa durante 15 minutos en 500 ul de PBS con 20 ul de PI (0,5mg/ml). Luego se colocaron en 500 ul de PBS con 10 ul de Hoescht 33452 (5mg/ml) y se incubaron durante 15 minutos más en estufa. Posteriormente se realizaron 3 lavados en PBS y fueron montados en portaobjetos con glicerol. Los embriones fueron evaluados con un microscopio de fluorescencia invertido con un aumento de 40x usando filtros de excitación de 330-385 nm (Hoescht) y 510-550 nm (PI).

Esta combinación mejoró la calidad de las muestras, en especial, mórulas, sin embargo cuando se implementó en embriones equinos de mayor grado de desarrollo (blastocistos, blastocistos expandidos), no fue posible realizar el conteo de las células debido a la gran cantidad existente y a la superposición de las mismas. Debido a esto, se decidió descartar este tipo de evaluación y reemplazarla por una evaluación morfológica y ultraestructural mediante microscopía confocal laser.

71 Figura 5: Blastocisto equino de 7 días de una yegua joven coloreado con tinción vital Hoescht- PI observado en microscopio de fluorescencia invertido a 40x.

Microscopía Confocal

Para el procesamiento de los embriones, primero se incubo con polilisinacada portaobjetos ON a 4°C.Luego los embriones, se montaron en portaobjetos tratados con polilisina, y una vez realizado el tratamiento de montado, se incubaron en buffer PBS con saponina al 0,1% por 30 min. Posteriormente, se incubó con el Ac ratón anti tubulina en una dilución 1:1000 (Santa Cruz BIO, Ca, USA), luego se realizaron tres lavados en buffer PBS con saponina al 0,1%, y una vez realizado esto se incubó con el Ac secundario Cabra anti ratón Alexa flúor 488 en una dilución 1:4000 (invitrogen, Ca, USA), en conjunto con Phalloidin Tri Cen dilución 1:5000 (Molecular Probes, Ca, USA) y luego se coincubó con TOPRO en dilución 1:200 (invitrogen, Ca, USA) para la tinción de núcleos. Se realizaron 2 lavados en PBS saponina y dos veces más con PBS. Finalmente se montó en un portaobjetos con 6 ulFluorsave (Molecualr probes, ca, USA). Las muestras fueron observadas en un microscopio Olympus IX81 con un módulo confocal Olympus FV1000, con objetivo 60X plan SAPO, NA 1,43, con lasers de 637nm, 543nm y 488nm.

Se logró la puesta a punto de esta coloración para embriones equinos, sin embargo no se logró completar el análisis debido a que se utilizó mayor cantidad de embriones de lo inicialmente previsto para la puesta a punta de las distintas coloraciones anteriormente mencionadas.

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