FANCD2 disminuye el reclutamiento de 53BP1, proteína involucrada en el

Como se comentó anteriormente, existe una compleja regulación en la elección de la vía de reparación de un DSB, que involucra preponderantemente a HR o NHEJ (104). En el apartado 4.4.1 vimos que FANCD2 promueve el reclutamiento de Rad51 al ADN y permite el SCE, es decir, estamos frente a una proteína que promovería el proceso de HRR frente a UV. Nos preguntamos entonces, si FANCD2 tendría algún tipo de relación inversa con la vía de NHEJ, evento que se contrapone a la HR. Para ello evaluamos si la ausencia de FANCD2 afectaba el reclutamiento a factorías de replicación de una proteína que es reclutada a DSBs que ya están comprometidos con una resolución dependiente de NHEJ; 53BP1 (105, 106). Evaluamos, entonces, la colocalización de 53BP1 con las factorías de replicación que presentaron reclutamiento de H2AX (H2AX). Opuesto a lo que ocurrió con Rad51, la organización nuclear de 53BP1 (que colocaliza con los focos de H2AX) aumentó en muestras irradiadas con UV en células deficientes para FANCD2 (Fig. 4.13A). Este incremento en el número de células con focos de 53BP1, cuando FANCD2 se encontró ausente, fue menor al obtenido luego de tratamiento con MMC (para permitir una comparación más fácil, los porcentajes de células con focos de 53BP1 luego de UV y MMC se muestran como barras superpuestas y ambas columnas comienzan desde 0% - Fig. 4.13B). En base a este último ensayo podemos decir que, si bien ambos agentes genotóxicos (la radiación UV y la MMC) inducen un aumento en el reclutamiento de 53BP1, la generación de trans-aductos genera una respuesta más marcada al comparar las muestras en las que FANCD2 se encontró ausente con las control (comparar relación respecto al control, 1.9 vs 2.5 a 4 horas y 2.5 vs 3.0 a 24 horas, Fig. 4.13B).

Fig. 4.12: FANCD2 facilita el reclutamiento de Rad51 al ADN dañado por UV y activa el intercambio entre cromátidas hermanas. A) Esquema representativo e imagen del reclutamiento

de Rad51 a las regiones sub-nucleares irradiadas con UV (visualizadas por tinción con H2AX). B) Reclutamiento de Rad51 a las regiones nucleares dañadas en células U2OS transfectadas con siRNAs control y D2. C) Reclutamiento focal de Rad51 en células PD20 y PD20D2 después de irradiación con UV (5J/m2). D) Panel representativo del intercambio entre cromátidas hermanas, las flechas rojas muestran los intercambios. E) Cuantificación del SCE en células U2OS transfectadas con siRNA control y D2 luego de irradiación con UV (1,5 J/m2). Los resultados mostrados son promedio de 3 experimentos hechos de forma independiente.

Fig. 4.13: La ausencia de FANCD2 aumenta el reclutamiento de 53BP1 al ADN dañado por UV y, en mayor proporción, luego de MMC. A) Organización focal de 53BP1 y H2AX en células control y tratadas con UV (5J/m2) transfectadas con siRNA control o D2. B) Organización focal de 53BP1 después de irradiación con UV (5J/m2- columnas negra y púrpura) y después del tratamiento con MMC (40 ng/mL - columnas rayadas), en células U2OS transfectadas con siRNA control y D2. Los porcentajes de células con focos de 53BP1 en las muestras irradiadas con UV y en las muestras tratadas con MMC se expresan a partir del 0,00 (%). Por debajo del gráfico se muestra el aumento relativo al control (siD2/siLuc) para cada tiempo (valores en negro para UV y en gris para MMC).) Se muestran diferencias significativas para el tratamiento UV (para MMC, *** p <0,001 en 24h). Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes.

Nuevamente quisimos poner en contexto del ciclo celular el fenotipo observado y reforzar, así, el vínculo entre la fase S del ciclo, la generación de DSBs y FANCD2. Evaluamos, entonces, que relación existía entre las células que reclutaron 53BP1 a su ADN y aquellas que resultaron positivas para EdU (es decir, aquellas que se encontraban replicando su ADN). Para ello agregamos EdU inmediatamente después de irradiar con luz UV y analizamos el reclutamiento a factorías de replicación de 53BP1 (ver esquema Fig. 4.14A). Los resultados mostraron que el reclutamiento de 53BP1 al núcleo se dio exclusivamente en aquellas células que transitaban la fase S al momento de la irradiación, células EdU positivas (comparar Fig. 4.14B y C), lo que sugiere que FANCD2 prevendría eventos de NHEJ acoplados exclusivamente a la replicación. En dicho experimento también se analizó el número de focos de 53BP1 por célula y, si bien no se obtuvieron

diferencias estadísticamente significativas, se pudo ver un leve incremento de este parámetro cuando FANCD2 fue eliminado transitoriamente de las células U2OS (Fig. 4.14B, panel derecho).

Fig. 4.14: Los focos de 53BP1 generados en células deficientes en FANCD2 se producen en la fase S del ciclo celular. A) Esquema del protocolo de trabajo empleado para los ensayos cuantificados

en las figuras 14B y C. Células U2OS transfectadas con siRNA control y D2 fueron irradiadas con UV (5J/m2) e incubadas con EdU (10M) durante 30 minutos inmediatamente después de la radiación. B) Imagen representativa de una célula EdU (+) (rojo) que presenta múltiples focos de 53BP1 (verde) (panel izquierdo). Porcentaje de células EdU () que contienen más de diez focos de 53BP1, 24h post radiación UV (panel medio). Número de focos de 53BP1 por célula (panel derecho). C) Imagen representativa de una célula EdU (-) que presenta múltiples focos de 53BP1 (panel izquierdo). Porcentaje de células EdU (-) que contienen más de diez focos de 53BP1, 24h

post radiación UV (panel medio). D) Protocolo de trabajo utilizado para el ensayo cuantificado en la Fig. 14E. Células U2OS transfectadas con siRNA control y D2 fueron irradiadas con UV (5J/m2) e incubadas con Edu (10M) en los últimos 10 minutos previos a la fijación. D) Imagen representativa de una célula EdU (-) que presenta escasos focos de 53BP1 (verde) (panel izquierdo). Porcentajes de células EdU (-) que contienen cuerpos nucleares de 53BP1, 24h después de la radiación UV (panel medio). Numero de focos de 53BP1 por célula (panel derecho).

Podemos decir, entonces, que se observó un aumento de 53BP1 (ya sea un aumento del porcentaje de células que reclutan dicha proteína a su ADN o un aumento del número de focos de 53BP1 presentes en las factorías de replicación) cuando FANCD2 se encontró ausente y que dicho incremento ocurrió principalmente en células que se encontraban sintetizando ADN al momento de la irradiación con luz UV.

La proteína 53BP1 también participa en la protección de sitios frágiles del ADN, rol que lleva a cabo en fase G1 y que le ha sido asignado hace relativamente poco tiempo (107, 108). Las estructuras que forma 53BP1 en dicho contexto se deben a una mala segregación de los cromosomas, se visualizan como un número reducido de focos de gran tamaño, presentes en G1 y se denominan cuerpos nucleares (107, 108). Teniendo en cuenta esta función de 53BP1 independiente de su reclutamiento a sitios de DSBs, consideramos necesario analizar si el aumento en los niveles de 53BP1 observados en ausencia de FANCD2 en nuestro contexto de trabajo, se debían a la presencia de dichas estructuras nucleares. Para evidenciar estas estructuras de 53BP1 incorporamos EdU por un corto lapso de tiempo, y previo a la finalización de los ensayos, y nos focalizamos en las células EdU (-) (ver esquema Fig. 4.14D). En estos experimentos pudimos ver que el porcentaje de células con cuerpos nucleares se vio inalterado al eliminar FANCD2, luego de irradiación con UV (Fig. 4.14E) y el mismo resultado se obtuvo al analizar el número de focos de 53BP1/célula en dichas muestras. Corroboramos que se trataban de las estructuras que deseábamos evaluar ya que, en promedio, se cuantificaron 2 focos/célula (Fig. 4.14E gráfico derecho). Estos resultados demuestran que los focos de 53BP1 que aumentan en ausencia de FANCD2 son aquellos generados en fase S y asociados a DSBs y no los originados como consecuencia de una mala segregación de los cromosomas.

4.4.3 NHEJ es el proceso responsable de la acumulación de aberraciones cromosómicas generadas en células deficientes para FANCD2 e irradiadas con UV

El aumento del reclutamiento a factorías de replicación de 53BP1 en células en las que FANCD2 no se encontró presente nos llevó a profundizar sobre un posible rol protector de esta proteína de la vía FA frente al proceso de NHEJ. Como se mencionó en la sección 1.3.3.4 de la introducción, el proceso de NHEJ es un mecanismo mutagénico que reconoce DSBs y los resuelve independientemente de homología en sus secuencias. Por ende, podría suponerse que la sobreactivación de esta vía podría ser los responsables de la inestabilidad genómica observada en ausencia de FANCD2. Para seguir estudiando el rol de FANCD2 en la elección de la vía de reparación de un DSBs después de irradiación con UV, se evaluó la regulación negativa y transiente de uno de los componentes centrales del proceso de NHEJ; XRCC4 (109). XRCC4 facilita la interacción entre el DSB y la ligasa involucrada en el procesamiento de dicho corte, con lo cual, desempeña un rol fundamental en dicho mecanismo de reparación del ADN. La falta de XRCC4 (Fig. 4.15A-B) no tuvo efecto sobre la acumulación de anormalidades cromosómicas (Fig. 4.15C-F), sobre los niveles de DSBs (Fig. 4.16A-B), sobre la supervivencia celular (Fig. 4.16C) ni sobre el número de células con reclutamiento focal de 53BP1 (Fig. 4.16D), tanto antes como después de la irradiación con UV.

Como se mencionó en la introducción, NHEJ es un proceso que resuelve DSBs generados independientemente de la replicación (62). Debido a que la falta de XRCC4 no generó efecto sobre las células irradiadas con luz UV, podemos decir que el tipo de daño provocado por dicho agente genotóxico no es un DSB directo, sino que el mismo se genera como consecuencia indirecta de problemas asociados a la replicación.

Fig. 4.15: Las aberraciones cromosómicas causadas por la radiación con UV, en células deficientes en FANCD2, se revierten al inactivar el proceso de NHEJ. A) PCR Cuantitativa en

tiempo real de células U2OS transfectadas con los siRNAs indicados y en B) las líneas PD20, PD20+D2, PD20+D2O y PD20+D2 K561RO, para evaluar la regulación negativa de XRCC4. Las muestras se normalizaron usando GAPDH como control. B) Acumulación de MN en células U2OS

binucleadas, transfectadas con los siRNAs indicados C) y D) breaks y exchanges cromatídicos en células U2OS transfectadas con los siRNAs indicados. Se analizaron dos experimentos independientes obteniéndose resultados similares en ambos casos.

La eliminación simultáneamente de XRCC4 y FANCD2 generó iguales niveles de DSBs, que las muestras deficientes en FANCD2 y que las muestras control (Fig. 4.16A-B), lo que refuerza la idea de que la falta de FANCD2 no contribuye con el aumento en los niveles de DSBs. La supervivencia celular tampoco se vio afectada por la ausencia simultánea de ambas proteínas (Fig. 4.16C). Por otro lado, el número de células con reclutamiento a factorías de replicación de 53BP1 aumentó modestamente ante la ausencia de FANCD2 y de XRCC4 (Fig. 4.16D), lo que sugiere un retardo, igualmente modesto, en el procesamiento de los DSBs presentes en estos focos.

Distintos fueron los resultados que se obtuvieron al evaluar los parámetros que determinan la integridad cromosómica, en las muestras deficientes para FANCD2y XRCC4 e irradiadas con UV. En células U2OS, encontramos que la eliminación conjunta de XRCC4 y FANCD2 fue suficiente para evitar, no sólo la formación de MN reportada en ausencia de FANCD2, sino también todas las aberraciones cromatídicas reportadas anteriormente (Fig. 4.16C y Fig. 4.16E-F, respectivamente). Del mismo modo, la eliminación de XRCC4 revirtió la acumulación de MN en las líneas PD20 y PD20+D2 K561R (Fig. 4.16D). Si la inestabilidad genómica observada en ausencia de FANCD2 se vio disminuida/eliminada en ausencia de un componente esencial para el proceso de NHEJ (XRCC4), podemos decir que dicho proceso es el responsable de la inestabilidad mencionada. En otras palabras, la falta de FANCD2 permite que actúe el mecanismo de NHEJ y que éste resuelva (de forma aberrante) los DSBs generados como consecuencia del encuentro de una horquilla de replicación activa con una foto-lesión en el ADN.

Fig. 4.16: El reclutamiento de 53BP1 al ADN dañado y la formación de DSBs no se vieron alterados cuando se inhibe el proceso de NHEJ en muestras deficientes para FANCD2. A) PFGE

que muestra los niveles de formación de DSBs 24h y B) 6h post irradiación con UV en U2OS transfectadas con los siARN indicados. Los paneles inferiores muestran la cuantificación de 3 ensayos hechos independientemente. D) Ensayo clonogénico en células U2OS transfectadas con los siARN indicados. E) Organización focal de 53BP1 en células U2OS transfectadas con los siRNAs indicados e irradiadas con 5J/m2 de luz UV. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes.

En conjuntos, estos resultados demuestran que los DSBs acoplados a replicacióny generados independientemente de un trans-aducto, requieren de FANCD2 para proteger la integridad cromosómica frente a NHEJ.

Además, en contraste a lo que ocurre en ausencia de FANCD2 frente a un trans-aducto, la elección de la vía de reparación de un DSBs es irrelevante para la supervivencia celular pero importante para la estabilidad genómica de las células irradiadas con UV.