FANCD2 no previene la acumulación de DSBs

Teniendo en cuenta que nuestros resultados de la sección 4.3.1 indicaron que FANCD2 no estaría involucrada con procesos que podrían generar DSBs, decidimos evaluar directamente la relación de FANCD2 con dichos cortes. Para ello se analizaron los niveles de DSBs. En primera instancia se evaluó la fosforilación activadora de la histona H2AX (H2AX – Serina139), ya que la misma permite el ensamblaje de complejos de reparación a la doble cadena del ADN y, por ende, es un reconocido marcador de DSBs

(96, 97). La figura 4.8A muestra el patrón de expresión de dicha proteína luego de UV y en ausencia de FANCD2, se utilizó la droga cisplatino como control positivo ya que la misma induce un importante aumento de los DSB y, por ende, un aumento de la expresión de H2AX. La organización focal de H2AX después de radiación UV no se vio afectada por la falta de FANCD2, tampoco observamos cambios al evaluar el porcentaje de células con focos de H2AX (Fig. 4.8B, Fig. 4.9A y Fig. 4.9C - panel izquierdo) ni el número de focos por células (Fig. 4.8). Por último se decidió cuantificar la intensidad total de H2AX en dichas muestras y este parámetro tampoco se vio afectado (Fig. 4.8D).

Fig. 4.8: La falta de FANCD2 no aumenta la acumulación de H2AX después de radiación UV. A)

Paneles representativos que muestran la intensidad de H2AX y la tinción con DAPI en células U2OS transfectadas con siRNA control y para D2. El tratamiento con cisplatino se utilizó como control positivo y se muestra en el último panel derecho. B) Cuantificación del número de células con focos de H2Ax y C) del número de focos de H2AX/célula D) y de la intensidad total de H2AX luego de radiación UV (5J/m2). La intensidad de H2Ax y los focos/célula se cuantificaron utilizando el software ImageJ. Los valores son representativos de 3 experimentos independientes.

Cabe destacar que estos resultados son opuestos a los obtenidos frente a MMC. La inducción de trans-aductos en células deficientes para FANCD2 generó un marcado aumento del número de células con reclutamiento a las factorías de replicación de H2AX (Fig. 4.9B y Fig. 4.9C - panel derecho).

Fig. 4.9: La falta de FANCD2 aumenta la acumulación de DSBs después de MMC. A)

Cuantificación del número de células con focos de H2AX 24 horas post radiación UV (5J/m2) y B) 24 horas post tratamiento con MMC (50ng/mL), en células PD20 y su control reconstituido con FANCD2; PD20+D2. C) Paneles representativos de los experimentos cuantificados en las figuras 8A y 8B que muestran la expresión de H2AX y la tinción con DAPI de células PD20 y su control reconstituido con FANCD2; PD20+D2, 24 horas post irradiación con UV (5J/m2) y 24 horas post tratamiento con MMC (50ng/mL). Los valores son representativos de 2 experimentos independientes.

Dado que los focos de H2AX también se pueden formar en ausencia de DSBs (12), consideramos necesario evaluar marcadores más específicos de DSBs tales como las fosforilaciones de la quinasa ATM en la Serina 1981 y del factor KAP1 en la serina 824 (57,

98). KAP1, proteína que coordina el ensamblado de un complejo multiprotéico que remodela la cromatina, es fosforilado por ATM en respuesta a estrés genómico (99). Observamos que la fosforilación de ATM no aumentó sino que disminuyó en las muestras en las que FANCD2 se encontraba ausente de forma transitoria o permanente (líneas U2OS transfectadas con siRNA para FANCD2 o PD20, respectivamente), lo que fue recapitulado cuando se evaluó la fosforilación de KAP1 (Fig. 4.10A-B).

Fig. 4.10: La falta de FANCD2 no aumenta la acumulación de marcadores de DSBs después de radiación UV. A)

WB mostrando los niveles de ATM, H2AX y KAP1 fosforilados en células U2OS transfectadas con siRNA control y D2 a los tiempos y las dosis de luz UV indicados. B) WB mostrando los niveles de ATM y KAP1 fosforilados en células PD20 y PD20+D2 a los tiempos y las dosis de luz UV indicados.

También evaluamos la activación de H2AX a través de western blot, para corroborar los resultados obtenidos en los ensayos por inmunofluorescencia. Como puede verse en la figura 4.9A, la fosforilación activadora de H2AX (H2AX) aumentó proporcionalmente a la dosis de UV pero dicho incremento no se vio afectado por la falta de FANCD2. Si nos centramos en la dosis de 5J/m2, observamos que los niveles de H2AX aumentaron modestamente con respecto a los controles no irradiados y que no existieron cambios significativos tras la falta de FANCD2. Nuestros resultados concuerdan con un estudio reciente del grupo de Vaziri donde muestran tinción negativa para Túnel en células deficientes en FANCD2 (100). Colectivamente, estos datos sugieren que la falta de FANCD2 no cambia los niveles de acumulación de DSBs ni antes ni después de la

irradiación UV. Para reafirmar esta conclusión evaluamos la formación de DSBs a través de una electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE del inglés, pulsed field gel electroforesis), técnica que permite evaluar doble cortes en el genoma entero de un organismo. No se observaron diferencias significativas entre las células U2OS control y las muestras en las que FANCD2 se encontró ausente, a 6 y 24 horas post irradiación con UV (Fig. 4.11A-B). Resultados similares fueron obtenidos al evaluar la línea PD20 y su par reconstituida (Fig. 4.11C). Si bien podría considerarse que la técnica de PFGE no es suficientemente sensible para detectar pequeñas cantidades de DSBs, al evaluar la formación de cortes frente a MMC, pudimos corroborar que nuestro sistema fue correctamente seteado y, más importante aún, que FANCD2 previene la acumulación de DSBs generados por esta droga (Fig. 4.11D).

Colectivamente, los resultados de las Fig. 4.8-4.11 sugieren que FANCD2 no está involucrada en la formación de DSBs después de irradiación con luz UV.

Fig. 4.11: FANCD2 no está involucrada en la acumulación de DSBs después de radiación UV. A)

Electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) mostrando los niveles de DSBs en células U2OS transfectadas con siRNA control y para D2, 6 horas y B) 24 horas post irradiación, con las dosis indicadas de UV. Los paneles inferiores muestran la cuantificación de 3 experimentos independientes, relativizados respecto a su control. C) PFGE mostrando los niveles de DSBs en células GM00637, PD20+D2 y PD20, 24 horas post irradiación con las dosis indicadas de UV. D) PFGE mostrando los niveles de DSBs en células GM00637, PD20+D2 y PD20, 24 horas tratamiento con las dosis indicadas de MMC. En todos los PFGE se utilizó Bleomicina (Bleo) como control positivo.

4.4 FANCD2 INTERVIENE EN LOS PROCESOS QUE REPARAN LOS DSBs GENERADOS