INDICE
RESUMEN ...4 ABSTRACT ...6 ABREVIATURAS ...7 1. INTRODUCCION ...9 1.1 SINTESIS DE ADN ...91.1.1 Mecanismo de replicación en organismos superiores ...9
1.1.2 Estrés replicativo ... 11
1.1.3 Horquilla de replicación atascada vs horquilla de replicación colapsada ...13
1.2 LESIONES EN EL ADN ...13
1.2.1 Lesiones generadas en una sola de las cadenas de ADN (cis-aductos) ...14
1.2.2 Lesiones generadas entre ambas cadenas del ADN (trans-aductos) ...15
1.2.3 Rupturas en la doble cadena del ADN ...16
1.3 RESPUESTAS A DAÑO EN EL ADN ...18
1.3.1 Mecanismos de chequeo de Fase S ...18
1.3.2 Mecanismos de Tolerancia al daño ...20
1.3.3 Mecanismos de reparación del ADN ... 20
1.4 ANEMIA DE FANCONI ...34
1.4.1 Aspectos clínicos de la enfermedad ...34
1.4.2 Relación de la FA con la luz UV ...36
2. HIPOTESIS DE TRABAJO ...37 2.1 OBJETIVO GENERAL ...38 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...38 3. MATERIALES Y METODOS ...39 3.1 CULTIVO CELULAR ... 39 3.2 TRANSFECCION ...40 3.2.1 Transfección de siRNAs ...40
3.2.2 Transfección del plásmido GFP-Pol ... 41
3.3 AGENTES GENOTOXICOS ...41
3.3.1 Radiación Ultravioleta (UV) ... 41
3.3.3 Bleomicina ...43
3.3.4 Cisplatino ...44
3.4 SECUENCIAS DE siRNA...44
3.5 ANALISIS DE PROTEINAS POR INMUNOTINCION ...45
3.5.1 Inmunotinción ...45
3.5.2 Microscopía ...45
3.6 ANALISIS DE PROTEINAS POR WESTERN BLOT ...46
3.7 ENSAYOS DE VIABILIDAD CELULAR Y CLONOGENICO ...46
3.7.1 Ensayo clonogénico ...46
3.7.2 Ensayo de viabilidad ...47
3.8 ANALISIS DEL CICLO CELULAR...48
3.8.1 Citometría de flujo ...48
3.8.2 Incorporación de análogos de bases ...48
3.9 ENSAYO DE MICRONUCLEOS (MN) ... 50
3.10 ANALISIS DE ABERRACIONES CROMOSOMICAS ... 51
3.11 ANALISIS DEL INTERCAMBIO ENTRE CROMATIDES HERMANAS (SCE) ... 51
3.12 ELECTROFORESIS EN GEL DE CAMPO PULSANTE (PFGE) ...52
3.13 PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL... 53
3.14 ANALISIS ESTADISTICO ... 53
4. RESULTADOS ...54
4.1 FANCD2 SE ACTIVA FRENTE A RADIACIÓN UV PERO NO ES ESENCIAL PARA LA SOBREVIDA ...54
4.2 FANCD2 PRESERVA LA ESTABILIDAD GENÓMICA DESPUÉS DE RADIACIÓN UV ...57
4.3 FANCD2 NO EVITA LA ACUMULACIÓN DE DSBS DESPUÉS DE IRRADIACIÓN CON LUZ UV ...62
4.3.1 Relación de FANCD2 con procesos que previenen la formación de DSBs ...62
4.3.2 FANCD2 no previene la acumulación de DSBs ...66
4.4 FANCD2 INTERVIENE EN LOS PROCESOS QUE REPARAN LOS DSBs GENERADOS DURANTE LA REPLICACION ...72
4.4.1 FANCD2 promueve el proceso de HRR, luego de irradiación con UV ... 72
4.4.2 FANCD2 disminuye el reclutamiento de 53BP1, proteína involucrada en el proceso de NHEJ ...73
4.4.3 NHEJ es el proceso responsable de la acumulación de aberraciones
cromosómicas generadas en células deficientes para FANCD2 e irradiadas con UV ..78
5. DISCUSIÓN ...83
5.1 SE FORMAN DSBs DESPUÉS DE LA RADIACIÓN CON LUZ UV Y ÉSTOS REQUIEREN DE FANCD2 PARA SU CORRECTO PROCESAMIENTO ...85
5.2 EXISTE UNA CONTRIBUCIÓN DIFERENCIAL DE FANCD2 A LA REPLICACIÓN DE ADN DAÑADO POR LUZ UV Y DAÑADO POR AGENTES QUE GENERAN TRANS-ADUCTOS. ...87
5.3 FANCD2 PROTEGE LA INTEGRIDAD DE LOS CROMOSOMAS ...89
6. CONCLUSIONES GENERALES ...92
RESUMEN
La Anemia de Fanconi (FA) es un desorden autosómico recesivo caracterizado por hipersensibilidad a los enlaces covalentes generados entre las cadenas opuestas del ADN (trans-aductos). Los pacientes con FA presentan mutaciones en alguno de los genes involucrados en la vía de Fanconi (vía FA), mecanismo que resuelve los trans-aductos mencionados. FANCD2, es una de las proteínas centrales de la vía FA y se sabe que es esencial para reparar un corte en la doble cadena del ADN (DSBs - del inglés, double strand break) generado como consecuencia del colapso de una horquilla de replicación que se encuentra con un trans-aducto. Si bien lesiones distintas a los trans-aductos pueden inducir colapso replicativo, la contribución de FANCD2 en la resolución de un DSB generado en una horquilla de replicación, por un daño distinto al mencionado, todavía no ha sido reportada. Llamativamente FANCD2 se activa frente a radiación con luz UV pero su relevancia fisiológica en ese contexto no es demasiado clara hasta el momento. Dicha radiación genera enlaces covalentes en una misma cadena del ADN (cis-aductos), por ende, resulta un agente genotóxico óptimo para estudiar la función de FANCD2 más allá de los trans-aductos. Además, el 60% de los pacientes con FA presentan hipo- o hiper-pigmentación de la piel y manchas café_au_lait, fenotipos ampliamente asociados a fallas en los sistemas que se activan en respuesta a la radiación con UV.
En el presente trabajo de tesis se muestra por primera vez que, en oposición a lo que ocurre frente a agentes que causan trans-aductos, la ausencia de FANCD2 no modifica la cantidad de DSBs que se generan cuando una horquilla de replicación activa se encuentra con un daño provocado por luz UV. Mostramos que FANCD2 es esencial para proteger a dichos DSBs de un procesamiento aberrante, previniendo la acumulación de micronúcleos y la fusión entre cromosomas no homólogos y promoviendo eventos de recombinación homóloga asociados a la replicación. Vimos, también, que FANCD2 no es necesaria para la activación del chequeo del ciclo celular después de UV. Además, y en oposición al efecto generado por los trans-aductos, las señales de tolerancia al daño y la sobrevida después de UV, no se vieron afectadas por la ausencia de FANCD2. Podemos
corto plazo, sí lo es para garantizar la estabilidad cromosómica durante el estrés replicativo generado por la radiación UV.
ABSTRACT
Here we show that irradiation with low doses of UV light causes modest accumulation of replication-coupled double strand breaks (DSBs), i.e. collapsed forks. Remarkably, the Fanconi Anemia protein FANCD2 is central to prevent the aberrant processing of UV-triggered DSBs and the generation of micronuclei and chromosome fusions but is dispensable to modulate cell death. Specifically, FANCD2 promotes homologous recombination-dependent repair of UV-triggered DSBs, thus preventing their aberrant processing by non-homologous end joining. Hence, the homologous recombination-dependent tumor suppressor function of FANCD2 is not restricted to inter-strand crosslinks but instead applies to replication-coupled DSBs that arise from a broader range of genotoxic stimuli.
ABREVIATURAS
PCNA: antígeno nuclear de células proliferantes RFC: factor de replicación C
RPA: proteína de replicación A UV: ultravioleta
MMC: Mitomicina C
CPD: dímero de pirimidina ciclobutano 6,4PP: 6,4 pirimidina-pirimidona
DSBs: corte en la doble cadena del ADN RI: radiación ionizante
ADNsc: AND simple cadena DDR: respuesta a AND dañado Chk1: quinasa de chequeo 1
ATR: proteína relacionada con ATM y Rad3 TLS: síntesis de ADN por Traslesión
Pol: polimerasa
MMR: de reparación de bases mal apareadas BER: reparación por escisión de bases
NER: reparación por escisión de nucleótidos
GG-NER: reparación por escisión de nucleótidos del genoma global
TC-NER: reparación por escisión de nucleótidos acoplado a la transcripción HR: recombinación homóloga
NHEJ: unión de extremos no homólogos
MRN: complejo formado por MRE11, Rad50 y Nbs1
DNA-PKcs: subunidad catalítica de la quinasa dependiente de ADN Vía FA: Vía de Fanconi
FA: Anemia de Fanconi
FAN-1: Nucleasa 1 asociada a la Anemia de Fanconi
FAAP20/FAAP24: Proteína de 20/24kDa asociada a la Anemia de Fanconi siRNA: ARN de interferencia pequeño
Bleo: Bleomicina MN: micronúcleos
SCE: intercambio entre cromátides hermanas PFGE: electroforesis en gel de campo pulsante IF: inmunofluorescencia
1.
INTRODUCCION
En el presente capítulo de la tesis se pretende introducir conceptos que permitan comprender los resultados experimentales y las conclusiones a las que se llegan en este trabajo. Para ello, en la primera parte de esta sección, se describirán el mecanismo de replicación del ADN en organismos superiores, el estrés al que puede ser sometido el genoma y los diferentes tipos de lesiones que pueden encontrarse sobre el mismo. Luego se explicarán los procesos que pueden activarse en una célula en respuesta a daño al ADN, haciendo especial hincapié en los eventos de reparación. Finalmente, se presentará el eje central de nuestro trabajo; la Anemia de Fanconi, haciendo especial enfoque en los procesos moleculares involucrados con dicha enfermedad, los conocimientos actuales sobre el tema y aquellos aspectos relevantes que consideramos necesarios profundizar.
1.1 SINTESIS DE ADN
La replicación del ADN es un proceso altamente regulado que asegura la correcta propagación del material genético de una célula. El desafío del proceso de replicación, que ocurre durante la fase S del ciclo celular, es copiar el ADN lo más fielmente posible ya que cualquier error de copiado será transmitido a las células hijas y perpetuará en las siguientes generaciones, pudiendo dar lugar a mutaciones que alteren la estabilidad genómica celular.
1.1.1 Mecanismo de replicación en organismos superiores
En mamíferos, la síntesis de ADN se inicia en múltiples sitios (se estiman que son alrededor de 104-106 (1), llamados orígenes de replicación y es un proceso bidireccional. Estos orígenes se encuentran agrupados formando zonas (clusters) de iniciación. Orígenes adyacentes se activan a distintos tiempos durante la fase S del ciclo celular y son replicados en un orden espacial y temporal definido (1). Cada origen de replicación debe ser licenciado y activado por mecanismos que no serán discutidos en la presente tesis, para mayor información recomendamos el trabajo de Jones RM & Petermann E (2012) Biochem J 443(1):13-26 (2). Una vez disparado un origen, se forma una horquilla de
replicación bidireccional, donde el ADN parental y el naciente son rodeados por un complejo multiproteico, el replisoma. La activación de un origen es acompañada de la entrada a la fase S del ciclo celular.
El replisoma incluye, entre otras proteínas, a la helicasa MCM/CDC45, el complejo formado por la primasa/polimerasa , que se encarga de iniciar la síntesis de ADN, la proteína de unión a ADN simple cadena RPA, la plataforma deslizante PCNA (del inglés, Proliferating Cell Nuclear Antigen) indispensable para el cargado de las polimerasas replicativas ε y δ en la cromatina y para asegurar una replicación altamente procesiva y el factor de replicación C (RFC, del inglés, replication factor C), necesario para abrir y cargar el anillo de PCNA sobre el ADN (3).
Las horquillas de replicación son estructuras complejas que aseguran la duplicación semiconservativa del ADN (Fig. 1.1). La acción de las polimerasas está precedida y acoplada a la apertura de la doble hélice por parte de las helicasas que presentan a la maquinaria de replicación dos cadenas moldes. La elongación se produce a partir del extremo 3’-OH libre, con lo cual el sentido de incorporación de los nucleótidos es en dirección 5’-3’, generándose una replicación semi-discontinua. La hebra de ADN que es presentada al replisoma en sentido 3’-5’ mantiene una elongación continua y coincide con el sentido de replicación de las polimerasas replicativas, en este caso, llevado a cabo por la polimerasa ε, a esta hebra se la denomina cadena líder. La segunda hebra es presentada en dirección 5’-3’por lo que la replicación es más compleja y se lleva a cabo mediante la formación de fragmentos discontinuos en dirección 3’-5’, fragmentos de Okasaki, a esta hebra de la denomina retrasada y la polimerasa que se encarga de la síntesis es la polimersas δ (4, 5). Debido a que cada fragmento de Okasaki debe iniciar de novo el proceso de replicación, es necesaria la acción de la primasa/polimerasa y la ligación de los fragmentos retrasados por parte de la Ligasa1. La nucleasa RNAasaH remueve los cebadores de RNA insertados por la polimerasa y la nucleasa FEN1 procesa los extremos 5’ de los fragmentos de Okasaki para que la Ligasa1 pueda unirlos.
Este complejo modelo de replicación busca asegurar la síntesis continua de ADN, evitando el retraso innecesario de horquillas activas que podrían desacoplar la maquinaria de replicación y generar consecuencias deletéreas para la célula.
Fig. 1.1: Replicación del ADN en eucariotas superiores. Una horquilla de replicación está
conformada por la helicasa MCM (del inglés, Mini-Chromosome Maintenance) que se encarga de abrir la doble hélice del ADN para iniciar la replicación; proteínas de unión a ADN simple cadena (RPA) que protegen de la acción de nucleasas a las regiones del ADN que van quedando al descubierto a medida que pasa la helicasa; la primasa/polimerasa (Pol ) que sintetiza los primers de RNA y los primeros fragmentos de ADN para iniciar los fragmentos de Okasaki; la polimerasa encargada de sintetizar la mayor fracción de los fragmentos de Okasaki (Pol δ); la polimerasa de la síntesis de ADN en la cadena líder (Pol ε); la plataforma deslizante para las polimerasas replicativas, encargada de la procesividad de las mismas y de la coordinación del proceso de maduración de los fragmentos de Okasaki (PCNA). Además de estas proteínas, en una horquilla se encuentran las nucleases encargadas de remover los primers (RNAasa H, DNA2 y FEN1) y la ligasa responsable de unir los fragmentos de Okasaki procesados en una hebra de ADN continua.
1.1.2 Estrés replicativo
Es fundamental que la información genética se transmita fielmente a las células hijas, para asegurar el mantenimiento de la estabilidad genómica. Para ello, la duplicación
del ADN durante la fase S del ciclo celular debe ser completa y exacta. Sin embargo, el genoma se encuentra constantemente expuesto a fuentes de estrés endógeno y exógeno que ponen en riesgo la correcta replicación y transmisión de la información. La progresión de las horquillas de replicación se encuentra en peligro contaste debido a este factor, lo que puede generar el arresto de la replicación o, más grave aún, el colapso replicativo con la consecuente ruptura de la doble hélice (6). Se denomina, entonces, estrés replicativo a aquel estímulo que genera una disminución en la velocidad de progresión de horquillas replicativas activas, ocasionando atascamientos transitorios (arresto) o permanentes (colapso) en las horquillas de replicación (el concepto de horquilla atascada y colapsada será explicado en la sección 1.1.3) (7). Por lo tanto, es esencial una adecuada coordinación entre los procesos de replicación y de reparación del ADN, a fin de asegurar una síntesis correcta bajo condiciones de estrés.
Las fuentes que causan estrés replicativo son aquellas que alteran la estructura del ADN e interfieren con la maquinaria replicativa. Las barreras replicativas más comunes incluyen complejos de ADN-proteínas que pueden frenar el avance del replisoma, estructuras secundarias del ADN (por ejemplo repeticiones de secuencias en tándem y sitios G-cuádruplex del ADN) (8), daño al ADN, lesiones de origen endógeno (producto del metabolismo propio de una célula) o exógeno. El daño al ADN puede dividirse en tres tipos: (a) alteraciones restringidas a una sola de las cadenas del ADN; normalmente son modificaciones sobre las bases nitrogenadas y entre los agentes genotóxicos que las generan se encuentran la radiación Ultravioleta (UV) y el metil metanosulfonato; (b) enlaces covalente generados entre bases de las cadenas opuestas del ADN, las drogas Cisplatino y Mitomicina C (MMC) generan este tipo de lesión; (c) rupturas de la doble cadena del ADN, evento que ocurre, por ejemplo, tras la exposición a Camptotecina (innibidor de la Topoisomera II) o a radiación ionizante. Las diferentes lesiones que se generan en el ADN imponen distintas barreras a la replicación. Las lesiones de tipo (b) y (c) deben ser reparadas antes de continuar con la replicación. Las lesiones de tipo (a) sin embargo, pueden ser usadas como molde para la replicación y esto ocurre a través del proceso de síntesis de ADN por Traslesión (este mecanismo se discutirá en la sección 1.3.2 de la introducción).
En lo que concierne al presente trabajo, el tipo de barrera replicativa que nos interesa estudiar es la generada por las lesiones en el ADN. Por ello, en la sección 1.2 se profundizará sobre los diferentes tipos de daños que se pueden generan en el ADN.
1.1.3 Horquilla de replicación atascada versus horquilla de replicación colapsada Es importante dejar en claro que los términos “atascamiento” y “colapso” replicativo son eventos fisiológicamente distintos. Cuando una horquilla de replicación se encuentra con una lesión (independientemente de la naturaleza de la misma) se produce una pausa en la síntesis de ADN. Esta pausa puede ser transitoria o permanente y este factor es lo que diferencia a una horquilla atascada de una colapsada. El atascamiento de una horquilla de replicación supone un obstáculo en el movimiento del replisoma, si bien se desconoce el tiempo a partir del cual una horquilla se considera atascada, se ha comprobado que la misma puede estar bloqueada durante varios minutos (9). Es un evento frecuente que, durante la síntesis de ADN, una horquilla de replicación se detenga. Sin embargo, la mayoría de estas horquillas pueden reasumir la replicación sin alterar la estabilidad genómica ya que existen mecanismos auxiliares a la replicación que las estabilizarán hasta que el daño sea reparado (los mecanismos auxiliares a la replicación serán detallados en la sección 1.3).
Por otro lado, una horquilla de replicación colapsa cuando el replisoma (formado por las polimerasas, las helicasas y demás proteínas auxiliares) se desacopla del sitio de síntesis de ADN. Para que ocurra un colapso debe existir un desacoplamiento en la maquinaria de reparación, lo que genera asimetría y tensión en la horquilla (producto del desenrollamiento de la doble hélice del ADN por parte de las helicasas, sin continuidad de síntesis) (10). Esta tensión puede generar cortes en la doble cadena y derivar en la pérdida del material genético y la muerte celular en algunos casos (11, 12).
1.2 LESIONES EN EL ADN
Como se mencionó anteriormente, es importante que la célula pueda lidiar con los daños que se generan en su ADN, a fin de asegurar una correcta propagación del material genético. Dentro de estas lesiones haré hincapié en aquellas relevantes para el presente
trabajo de tesis; lesiones generadas por la luz UV, aquellas que producen enlaces covalentes entre cadenas de ADN opuestas y las dobles rupturas en el ADN.
1.2.1 Lesiones generadas en una sola de las cadenas de ADN (cis-aductos)
Existe un amplio espectro de lesiones que se originan en una de las cadenas de ADN, muchas de ellas producto del estrés metabólico interno. Dentro de las fuentes exógenas que generan lesiones en una hebra del ADN se encuentra la radiación con luz UV.
La radiación UV se define como la región del espectro electromagnético comprendida entre los rayos X y la luz visible. El espectro UV se subdivide en UV Extremo (hasta 200nm de longitud de onda) y UV Cercano (hasta 380nm aproximadamente). A su vez la radiación UV Cercana se divide en UVA (320-380nm), UVB (280-320nm) y UVC (220-280nm). La luz UV es un importante agente genotóxico, siendo UVC la de mayor energía y, por ende, la de mayor poder mutagénico. El principal tipo de lesión que genera en el ADN este agente genotóxico es la formación de dímeros entre pirimidinas adyacentes. Dependiendo del tipo de enlace covalente que se genere entre ambas bases, se pueden obtener; dímeros de pirimidinas en anillos de ciclo-butano (CPD) los cuales conforman el 80% de las lesiones y fotoproductos pirimidina-pirimidona (6,4PP) que corresponden al 20% de las lesiones restantes (Fig. 1.2). Si bien ambos tipos de lesiones distorsionan a la doble hélice, los 6,4PP lo hacen en mayor proporción, por ende, son más fáciles de detectar por la maquinaria de reparación y se remueven en un lapso de tiempo relativamente corto (6 horas aproximadamente) (13). Por el otro lado, los CPDs causan deformaciones sutiles en el ADN, lo que hace que sea una lesión extremadamente peligrosa y mutagénica. De hecho, 48 horas post irradiación, se puede observar que aún no fueron removidas el 50% de las lesiones. En células en replicación activa esto implica una alta probabilidad de que muchas horquillas de replicación se encuentren con este daño inmediatamente después de la irradiación con UV y hasta en ciclos de replicación sucesivos.
La radiación UV es una fuente que genera casi exclusivamente cis-aductos sobre el ADN, lo que diferencia a este agente genotóxico de la mayoría de las demás fuentes que
producen una mezcla de daños sobre el ADN. Como las distintas barreras replicativas desencadenaran distintos mecanismos de respuesta celular, el análisis de respuestas globales dificulta la interpretación de resultados. Por esto, la luz UV es un agente muy favorable para el análisis de lesiones sobre una sola de las cadenas de ADN. Este agente genotóxico fue el elegido para evaluar la respuesta celular frente a daño en el ADN, en el presente trabajo de tesis, los motivos de tal elección se detallan en la sección 2.
Fig. 1.2: Lesiones generadas por la luz UV.
Esquema representativo de los daños generados en el ADN por la luz UV, dímeros de pirimidinas en anillos de ciclo-butano (CPD) y fotoproductos pirimidina-pirimidona (6,4PP).
1.2.2 Lesiones generadas entre ambas cadenas del ADN (trans-aductos)
Los trans-aductos son enlaces covalentes que se generan entre bases de ADN que se encuentran en las cadenas opuestas de la doble hélice. Este tipo de lesiones constituye un bloqueo absoluto para la replicación de ADN ya que evitan la separación de las hebras de ADN parentales. Por ende, si este daño no es reparado, resulta extremadamente tóxico principalmente para células que se encuentran en división. Una detención prolongada de la síntesis de ADN en estas lesiones, desencadena el colapso de las horquillas atascadas y la célula muere (14).
Los trans-aductos se generan cuando dos grupos reactivos, presentes en una única molécula alquilante, reaccionan con bases que residen en las cadenas opuestas del ADN (Fig. 1.3). Los sitios target donde suelen generarse los enlaces covalentes suelen ser el N2 y el N7 de guaninas. Existen varias drogas que producen este tipo de daño en el ADN, como se detallará en la sección de Materiales y Métodos, la Mitomicina C (MMC) es una de ellas (14). Estudios recientes demuestran que el estrés propio de una célula puede
CPD 6,4PP
U
generar aldehídos que, al interaccionar con el ADN, generan este tipo de lesiones también (15). Otra fuente endógena de trans-aductos es el ácido nitroso que se genera en el estómago como consecuencia de la ingesta de alimentos que contienen nitritos.
Fig. 1.3: Trans-aducto generado entre ambas cadenas de la doble hélice del ADN.
Esquema representativo de un trans-aducto generado por reacción del N7 de guaninas
que se encuentran en bases presentes en las cadenas puestas del ADN y la droga Mitomicina C (MMC).
1.2.3 Rupturas en la doble cadena del ADN
De las diferentes lesiones que pueden generarse en el ADN, probablemente la más peligrosa sea la generación de cortes en la doble cadena (DSBs, del inglés, double strand breaks). Los DSBs se generan cuando las hebras complementarias de la doble hélice del ADN se rompen simultáneamente (16). Los DSBs pueden producirse a partir de fuentes exógenas que entran en contacto con la célula o como consecuencia de procesos metabólicos propios del organismo (fuentes endógenas).
Dentro de las fuentes exógenas se encuentra principalmente la Radiación Ionizante (RI), energía suficientemente alta como para liberar electrones de los átomos, producir ionización y romper enlaces químicos en moléculas orgánicas. Se estima que este agente genotóxico produce 35 DSBs en una célula diploide en fase G1 (con una dosis de 20 Gy) (17). Debido a que la RI rompe la doble cadena del ADN directamente, este agente genera DSBs en una célula, independientemente de la fase del ciclo celular en la que se encuentre la misma (ver Fig. 1.4A). Distinto es lo que sucede con ciertos agentes genotóxicos que ocasionan DSBs de manera indirecta, los DSBs pueden también generarse como consecuencia indirecta de distintos eventos replicativos. Por ejemplo, para resolver los trans-aductos mencionados en el ítem 1.2.2, la célula lleva a cabo un
colapso “programado” de su horquilla de replicación, con la consecuente generación de un DBS [6]. Por otro lado, las lesiones que se generan sobre una sola de las cadenas del ADN pueden bloquear la progresión de la polimerasa en la hebra líder y generar el desacople entre el complejo replicativo y las helicasas. Esto último produce ADN simple cadena, estructura que puede llegar a desestabilizar la horquilla de replicación y causar un DSB. De hecho, en esta tesis se discutirán datos que indican que la radiación UV provoca acumulación de DSBs asociados a la replicación, causados a partir de la lesión primaria (cis-aducto). Regiones de ADN simple cadena también son candidatas a formar estructuras secundarias como hairpins y estructuras cruciformes que pueden ser reconocidas y clivadas por complejos enzimáticos y, así, generar doble cortes. Es importante destacar que los DSBs generados en una horquilla de replicación (cortes generados por el colapso replicativo) son topológicamente distintos a los generados por la RI, los problemas en una horquilla de replicación darán lugar a la creación de un solo
extremo de un DSB (ver Fig. 1.4B) (17).
Debido a la gravedad que representan los DSBs, la célula ha desarrollado un complejo sistema para detectarlos y repararlos, tema que será detallado en la siguiente sección.
Fig 1.4: Diferentes tipos de DSBs que puede sufrir el ADN. A) Ciertos agentes genotóxicos como
genera un DSB “directo” o independiente de la replicación. B) Pueden inducirse doble cortes en el ADN como consecuencia indirecta del encuentro de una lesión con una horquilla de replicación activa. Si la hebra líder se encuentra con el daño, probablemente se bloquee la progresión de la polimerasa y se generará ADN simple cadena (ADN sc), estructura sumamente inestable que inducirá a un corte en la horquilla replicativa. Como puede observarse en la figura, este DSB contiene solamente un extremo y es, entonces, distinto al generado en la figura 1.4 A.
1.3 RESPUESTAS A DAÑO EN EL ADN
Como puede observarse a partir de la sección anterior (1.2), una célula puede llegar a enfrentarse con un gran número de lesiones en su ADN y, lo que es más importante aún, no todas representarán igual complejidad al momento de ser eliminadas. Resulta vital, entonces, poder lidiar con las lesiones en el ADN a fin de mantener la estabilidad genómica y evitar la muerte celular. Es por ello que los organismos han desarrollado una compleja red que se activa en respuesta a daño al ADN (DDR, del inglés, DNA Damage Response). Los mecanismos que auxilian a la replicación han evolucionado desde levaduras hasta los seres humanos. Dentro de esta intrincada red se encuentran los mecanismos de reparación del ADN, procesos que promueven la remoción de la lesión lo más eficientemente posible, los mecanismos de chequeo del ciclo celular, que se encargan de estabilizar a las horquillas atascadas y enlentecer la progresión a través de la fase de replicación del ciclo celular (fase S) o bloquear a las células fuera de S para generar una ventana temporal en la cual se pueda remover la lesión y evitar que ésta sea transmitida a la progenie y los mecanismos de tolerancia al daño genómico, procesos que utilizan el ADN lesionado como molde para la síntesis, evitando el atascamiento de las horquillas replicativas.
1.3.1 Mecanismos de chequeo de Fase S
Los mecanismos de chequeo del ciclo celular son eventos que aseguran una eficiente duplicación del ADN y su correcta segregación a las células hijas. Los mecanismos de chequeo se activan como consecuencia de acumulación de daño al ADN en todas las fases del ciclo celular. El tipo de respuesta que genere este sistema dependerá del tipo de lesión que se produzca en el ADN y de la fase del ciclo en que se
encuentre la célula. Sin embargo, como mecanismo general, el chequeo crea una ventana de tiempo para permitir que se repare el ADN dañado. De existir un daño persistente en el ADN, este mecanismo puede disparar señales de apoptosis para evitar la propagación de un genoma lesionado (18, 19). Por lo tanto, el sistema de chequeo contribuye con el mantenimiento de la integridad genómica. Los mecanismos de chequeo que se conocen son los que se activan en G1, G2/M, M y en fase S. Por cuestiones de espacio y, teniendo en cuenta que el presente trabajo estudia eventos involucrados con la replicación del ADN, solo se describirá el mecanismo de chequeo de la fase S.
Tanto las barreras físicas como las lesiones propiamente dichas, son estructuras que generan el bloqueo de las polimerasas y el consecuente frenado de la síntesis de ADN. Como mencionamos anteriormente, el desacople entre las helicasas y las polimerasas aumenta los niveles de ADN simple cadena (ADNsc). Estas estructuras de ADNsc son protegidas por la proteína RPA y esta asociación favorece la activación del chequeo. La activación de Chk1 (quinasa de chequeo 1) por medio del complejo ADNsc-RPA se encuentra precedida por la activación de ATR (proteína relacionada con ATM y Rad3). Luego de la activación de ATR, la activación de Chk1 constituye el principal evento en respuesta al arresto de una horquilla. ATR fosforila a Chk1 en las serinas 317 y 345, existe consenso de que la fosforilación S354 es esencial para un eficiente chequeo y para la sobrevida celular pero existen controversias en cuanto al rol de la fosforilación en la S317 (20). Si bien Chk1 se localiza tanto en el núcleo como en el citoplasma, ATR lo activa en el núcleo y existe una correlación inversa entre la cantidad de Chk1 unida al ADN y la extensión del daño genómico.
Una vez activada, Chk1 (a) controla el disparo de orígenes para reducir el número de horquillas que puedan encontrarse con una lesión y (b) estabiliza horquillas que se encontraban elongando, para que puedan mantener la habilidad de re-iniciar la replicación una vez que la lesión haya sido removida (20). En cuanto al rol de Chk1 en la estabilización de horquillas, es importante destacar que este evento es esencial ya que, fallas en la estabilización pueden generar el colapso replicativo con la consecuente generación de DSBs. Existen varias líneas de evidencias que indican que Chk1 colabora
con la estabilidad de las horquillas interaccionando con el proceso de síntesis de ADN por Traslesión, proceso que será descripto en la sección 1.3.2.
Como se comentó anteriormente, en el presente trabajo se utilizó la radiación UV como agente inductor de lesiones en el ADN. Es altamente probable que varias horquillas de replicación se encuentren con los CPDs provocados por la luz UV mientras se está sintetizando ADN y que esto genere el atascamiento de dichas horquillas. Es aquí donde se activa el mecanismo de chequeo de ATR-Chk1, con la finalidad de estabilizar a las horquillas y evitar su colapso.
Para una revisión más detallada de los mecanismos de chequeo del ciclo celular en fase S y de las funciones que presenta Chk1 en dicho contexto, puede consultarse la siguiente revisión que expone y desarrolla claramente los últimos avances en el campo (20).
1.3.2 Mecanismos de Tolerancia al daño
Se sabe que la radiación UV induce la activación del proceso de síntesis de ADN por Traslesión (TLS, del inglés, DNA Traslesion Synthesis). TLS es un proceso que se activa en la fase S del ciclo celular y permite la síntesis de ADN dañado. Las polimerasas replicativas (Pol δ y Pol ε) poseen sitios activos altamente específicos que son incapaces de reconocer y alojar a bases dañadas, por este motivo, existen polimerasas especializadas que las reemplazan. Estas polimerasas especializadas presentan sitios activos más laxos que les permiten alojar bases dañadas, como los cis-aductos generados por la radiación con luz UV, por ejemplo (21). Sin embargo, estas polimerasas son menos procesivas que las polimerasas replicativas y no presentan actividad de lectura de prueba 3’5’ (21-23). Esta última particularidad las hace propensas a introducir errores, por lo que, su actividad debe ser rigurosamente controlada. Las polimerasas involucradas en el proceso de TLS frente a radiación con luz UV pertenecen a la familia Y de polimerasas (que incluye a Pol , Pol , Pol y REV1). La polimerasa extensora también participa del proceso de TLS frente a UV pero pertenece a la familia B (de la cual forman parte las polimerasas replicativas δ, ε y ) (24). Dentro de las polimerasas de TLS, la polimerasa (Pol ) es particularmente importante ya que evolucionó para promover la síntesis de
ADN a través de un CPD sin cometer errores ya que reconoce a esta lesión y ubica a dos adeninas en oposición (como se mencionó anteriormente, los CPD son dímeros de pirimidinas formados por la unión covalente entre dos timinas adyacentes) (25, 26).
Como se explicó anteriormente, para que se lleve a cabo el proceso de TLS es necesario que se produzca un intercambio de las polimerasas replicativas por las polimerasas de TLS en la horquilla de replicación. Cuando la polimerasa replicativa de alta procesividad se encuentra con un daño en el ADN a través del cual no puede sintetizar, se produce un intercambio de polimerasas in situ donde la polimerasa replicativa es reemplazada por la polimerasa de TLS. Una vez superada la lesión, por medio de un mecanismo que no se conoce con demasiado detalle, se genera nuevamente el intercambio inverso entre estas polimerasas. Este evento ocurre por intermedio de la plataforma deslizante PCNA. PCNA, que es necesaria para la procesividad de las polimerasas de eucariotas, se monoubicuitina en respuesta a radiación con luz UV y a otros agentes genotóxicos (27). Visto que las polimerasas de TLS tienen uno o más sitios de unión a ubicuitina, la interacción de las polimerasas de TLS con PCNA se ve favorecida por esta modificación post-traducccional de PCNA (ver fig. 1.5). Es importante destacar que el proceso de TLS evita el bloqueo permanente (o colapso) de una horquilla de replicación, frente a una lesión. Si bien existe un riesgo mutagénico al activar TLS (mutaciones puntuales), el riesgo es mayor si el bloqueo persiste y se produce un colapso de la horquilla seguido por la formación de DSB y el riesgo de muerte celular asociado a su reparación inadecuada.
Fig. 1.5 Esquema del proceso de TLS: A) Durante la replicación del ADN las cadenas nacientes son
sintetizadas por las polimerasas replicativas, unidas al factor de procesividad PCNA. B) Cuando la horquilla de replicación activa se encuentra con una lesión en una de las cadenas (como los cis-aductos producidos por la luz UV), se atasca. C) El atascamiento de la horquilla replicativa induce la ubicuitinación de PCNA, lo que promueve el reclutamiento de polimerasas más permisivas. D) Las polimerasas de TLS utilizan el ADN dañado como molde para que continúe la replicación. En una etapa posterior, se producirá el cambio reverso de la polimerasa de TLS por la polimerasa replicativa, restaurando el proceso original.
1.3.3 Mecanismos de reparación del ADN
En promedio, una célula presenta espontáneamente 30.000 lesiones al ADN por día (28). Si a este número se le suman los daños generados como consecuencia de la exposición de los organismos a agentes genotóxicos externos, la cantidad de lesiones aumenta considerablemente. Por este motivo, los organismos han desarrollado diferentes mecanismos de reparación del ADN, tendientes a evitar la propagación de las lesiones y la consecuente generación de mutaciones. A continuación se detallan los procesos de reparación de ADN presentes en humanos, haciendo especial hincapié en aquellos procesos involucrados en el presente trabajo de tesis.
1.3.3.1 Reparación de bases mal apareadas
Una importante fuente de lesiones al ADN es la que deriva del metabolismo propio de una célula. Errores en la replicación y en otros eventos propios del organismo pueden incorporar incorrectamente nucleótidos y generar un mal apareamiento de las bases. Cabe destacar que, si bien el mal apareamiento de bases no es una lesión en sí, es un evento que puede llegar a generar mutaciones debido a la alteración de la secuencia del genoma.
El mecanismo de reparación de bases mal apareadas (MMR, del inglés, mismatch repair) corrige bases mal apareadas o aquellas deleciones/inserciones de nucleótidos que ocurren durante la replicación. El mecanismo comienza cuando el complejo MutS (formado por MSH2-MSH6) reconoce bases mal apareadas o “loops” formados como consecuencia de deleciones/inserciones de unos pocos nucleótidos, o cuando el complejo
MutS (formado por MSH2-MSH3) reconoce “loops grandes” producto de deleciones/inserciones de 2-10 nucleótidos. Más del 80% del MSH2 presente en la célula se encuentra unido a MSH6 formando MutS . A continuación se unen, MutL (MLH1/PMS2) y MutL (MHL1/PMS1) quienes interaccionan con factores de replicación como PCNA, RFC, la exonucleasa EXO I y las polimerasas ε y δ. Se cree que PCNA ayuda a localizar a MutS y MutL en la región de daño, sobre la hebra hija recién sintetizada (ya que se elimina la base sobre la hebra nueva y se conserva la base de la hebra parental). PCNA también es esencial para realizar un corte hacia el extremo 3’ del mal apareamiento. Después de efectuado dicho corte, MutL hace un corte hacia el extremo 5’ (EXO I también realiza cortes en el extremo 5’). RPA se une al ADNsc para protegerlo de degradación y finalmente, se re-sintetiza ADN por medio de la acción de las polimerasas replicativas (29, 30).
1.3.3.2 Reparación por escisión de Bases
La reparación por escisión de bases (BER, del inglés, Base Excision Repair) es, probablemente, el mecanismo de reparación del ADN más utilizado por una célula. Factores endógenos y exógenos a un organismo pueden producir alteraciones en las bases de los nucleótidos y generar, de esta manera, lesiones en el ADN. El proceso de BER se inicia por la acción de glicosilasas que reconocen específicamente los diferentes tipos de daños que pueden generarse sobre una base. Estas glicosilasas clivan los enlaces N-glicosílicos que unen a las bases con la cadena azúcar fosfato del ADN. Actualmente existen 11 glicosilasas humanas que reconocen y eliminan un amplio rango de bases dañadas. A continuación, el sitio abásico (AP, apurínico/apirimidínico) es procesado por una endonucleasa (APE1 en humanos), la cual cliva el enlace fosfodiéster que se encuentra en el extremo 5’ del sitio AP. Esto genera un corte que presenta un grupo OH en el extremo 3’ y un grupo fosfato en el extremo 5’. En el proceso clásico de BER la ADN polimerasa β, usando su actividad AP liasa, remueve el grupo fosfato presente en el extremo 5’ y, simultáneamente, incorpora un nucleótido al extremo 3’. Para finalizar el proceso de reparación, el complejo de ligasas XRCC1-DNA III une los extremos del ADN (30).
1.3.3.3 Reparación por escisión de nucleótidos
La reparación por escisión de nucleótidos (NER, del inglés, Nucleotide Excision Repair) es el principal mecanismo de reparación encargado de remover lesiones abultadas en el ADN. Entre las lesiones que remueve NER encontramos los dímeros de pirimidinas generados por la luz UV, agente que se utilizó en el presente trabajo como inductor de daño al ADN. Este proceso involucra la participación de 20-30 proteínas que reconocen el daño, abren la doble hélice del ADN en la región de la lesión y escinden parte de la cadena que presenta el daño. A continuación, el gap que queda es utilizado como molde para la síntesis de ADN y finalmente los extremos son ligados.
En primera instancia el daño es reconocido por el complejo formado por XPC/HHR23B. El siguiente paso implica la apertura de la doble hélice del ADN en la región donde se encuentra la lesión, proceso que es orquestado por XPA. XPA coordina a la maquinaria de reparación alrededor de la lesión, una vez que el complejo XPC/HHR23B ha localizado y abierto a la doble hélice. La apertura de la doble hélice es un proceso dependiente de ATP y llevado a cabo por TFIIH. TFHII es un complejo formado por nueve subunidades (dos de sus subunidades son las helicasas XPB y XPD). Probablemente RPA se una al ADNsc que se genera, para estabilizarlo e impedir su ruptura o degradación (se une a 30 nucleótidos, aproximadamente). Luego de la apertura de la doble hélice y de la demarcación de la lesión, un oligonucleótido formado por 24-32 nucleótidos es escindido, proceso llevado a cabo por las endonucleasas XPG (que cliva hacia el extremo 3’ del complejo) y por ERCC1/XPF (que escinde en el extremo 5’). En principio, tanto XPG como XRCC1/XPF pueden cortar el ADN en la hebra no dañada pero se sabe que ERCC1/XPF actúa de manera coordinada con RPA (que se encuentra unida a la hebra no dañada) y solo se producen cortes en la cadena donde se encuentra la lesión. RPA también interacciona con XPG pero ese contacto no es suficiente para generar la especificidad por la hebra dañada, se cree que TFIIH está involucrada en el posicionamiento de esta endonucleasa. El último paso involucra la síntesis de ADN en la región que ha sido eliminada (evento que requiere de RPA, PCNA y de las polimerasas δ y ε, entre otras proteínas de la replicación) y la ligación de la nueva hebra sintetizada (llevada a cabo por la ADN Ligasa I) (31).
Existen 2 mecanismos de NER, el descripto en el párrafo anterior se denomina Reparación por escisión de nucleótidos del genoma global (GG-NER, del inglés, Global Genome), que remueve lesiones ubicadas en cualquier región del genoma. Y, por otro lado, las lesiones presentes en la hebra que contiene a los genes que se transcriben activamente son reparadas por la Reparación por escisión de nucleótidos acoplada a la transcripción (TC-NER, del inglés, Transcription Couple).
Fig. 1.6: Modelo de TC-NER y GC-NER. El reconocimiento del daño ocurre por medio del complejo
XPC/HR23B (especifico para GG-NER) o por la ARN polimerasa y las proteínas CSA y CSB (para la vía de TC-NER). A continuación, las proteínas RPA, XPA y TFIIH generan la apertura de la doble hélice en la región que rodea a la lesión. Esto permite la escisión de la región del ADN que contiene el daño, evento llevado a cabo por las endonucleasas ERCC1/XPF y XPG. Por último, se sintetiza ADN en dicha zona. (Adaptado de (31)).
Ambos procesos son esencialmente iguales a excepción del paso inicial de reconocimiento de la lesión. Como mencionamos, en el proceso de GG-NER la lesión es reconocida por XPC/HHR23B, mientras que en la vía de TC-NER, la detención de la ARN polimerasa en el sitio de la lesión es la señal necesaria para atraer a la maquinaria de NER.
Las proteínas CSA y CSB interaccionan con la ARN polimerasa y están involucradas con el reconocimiento del daño (Fig. 1.6) (31).
1.3.3.4 Reparación de cortes en la doble cadena del ADN
Como detallamos en la sección 1.2.3 los cortes en la doble cadena del ADN son lesiones que pueden generarse por distintos agentes genotóxicos, como así también, por cuestiones propias de la célula y su metabolismo. Debido a que los DSBs representan un alto peligro para la estabilidad genómica y para la sobrevida, las células han desarrollado mecanismos que permiten repararlos. Las principales vías que resuelven un DSB son la reparación por Recombinación Homóloga (HR, del inglés Homologous Recombination) y la reparación por Unión de Extremos no Homólogos (NHEJ, del inglés non-homologous end joining). La elección del mecanismo que resuelva el doble corte depende de la fase del ciclo celular en la que se encuentre la célula al momento de reparar el daño. NHEJ está presente en todas las fases del ciclo celular pero es particularmente usado en las fases G0 y G1 mientras que HR predomina en fase S/G2, lo que hace a este último mecanismo altamente responsable de la fidelidad de la trasmisión de la información genética (32). Experimentos hechos con mutantes para HR y NHEJ establecen que estos mecanismos pueden competir por la reparación del mismo DSB pero también se postula que colaboran en la resolución de diferentes lesiones (29), por ende, la relación entre estos eventos no se conoce con claridad aún y es un campo que está siendo ampliamente estudiado.
Reparación por Recombinación Homóloga
La reparación por HR es un mecanismo de reparación de DSBs altamente fiel, presente en todos los organismos. Esta vía se activa en las fases S/G2, cuando el ADN ya se ha replicado ya que permite la reparación utilizando como secuencia molde a la cromátide hermana recién sintetizada. Permite resolver DSBs “directos”, como así también, aquellos generados por el colapso replicativo de una horquilla (ver Fig. 1.4).
El proceso de HR comienza con la resección de los extremos del DSB por medio del complejo formado por MRE11, Rad50 y Nsb1 (MRN) y otras nucleasas que generan ADNsc con extremo 3’. Este ADNsc es cubierto por RPA para remover estructuras secundarias y,
a continuación, BRCA2 media el intercambio de RPA por Rad51 para formar un nucleofilamento proteico que invadirá a la cromátide hermana para buscar la secuencia homóloga. Después de la invasión, y una vez encontrada la secuencia homologa, se produce la extensión del ADN. A continuación, el segundo extremo del DSB es capturado formándose uniones Holliday que serán resueltas dando lugar a productos con intercambio (crossover) o sin intercambio (non-crossover) entre las cromátides (Fig. 1.7) (29). Existen modelos de resolución de HR alternativos al mencionado, que no involucran uniones Holliday. Por razones de espacio y por considerarlos irrelevantes para el entendimiento del presente trabajo, esos mecanismos serán obviados en esta introducción. Para mayores detalles se pueden consultar las siguientes revisiones (29, 33, 34)
Reparación por unión de extremos no homólogos
El proceso de NHEJ es un mecanismo relativamente más simple que HR. En este caso, los extremos de un DSB se unen al heterodímero formado por Ku70 y Ku80, el cual recluta a la subunidad catalítica de la quinasa dependiente de ADN (DNA-PKcs del inglés, catalytic subunit of the DNA dependent protein kinase). Si es necesario, los extremos del DSB son procesados por nucleasas (por ejemplo, Artemis) o por polimerasas que sintetizan pequeños fragmentos de ADN (como Pol μ o Pol λ), para crear extremos compatibles. Este último evento hace que se pierdan o ganen fragmentos de ADN, lo cual convierte al mecanismo en un proceso mutagénico que altera la secuencia original. Finalmente, el complejo de ligación formado por la ADN ligasa IV y por XLF/XRCC4 unen los extremos (Fig. 1.7) (29).
Fig. 1.7 Reparación de rupturas en la doble cadena. Los cortes en la doble cadena (DSB, del inglés
double strand break) se reparan principalmente por medio de los procesos de Unión de Extremos No Homólogos (NHEJ, del inglés non-homologous end joining) o por medio de la reparación por Recombinación Homóloga (HR). NHEJ liga extremos de ADN que previamente se han procesado, por este motivo, este mecanismo suele perder información genética y se vuelve un evento mutagénico. Los extremos del ADN se unen al heterodímero Ku70/Ku80 el cual orquesta la actividad de las proteínas que se unirán a continuación. DNA-PKcs es la siguiente proteína en
incorporarse y posteriormente recluta a Artemis. Artemis (y/o el complejo MRN) procesa los extremos del DSB que serán unidos por medio de distintas polimerasas y por el complejo de ligasas formado por XRCC4/XLF/Lig4. En contraste con NHEJ, HR es un mecanismo libre de errores que utiliza la cromátide hermana, presente solo en las fases S y G2 del ciclo celular, como molde para la reparación del DSB. HR se inicia con la resección de los extremos del DSB, evento que involucra al complejo MRE11-Rad50-Nbs1 (MRN) y a otros factores accesorios que incluyen nucleasas. El complejo MRN también recluta a ATM que fosforila a H2AX y a proteínas involucradas en el chequeo del ciclo celular. El ADNsc, que se genera producto de la resección de los extremos, se une a RPA quien a continuación es reemplazado por Rad51. Rad51 promueve la invasión del ADNsc a la cromátide hermana que utilizará como molde. Se generan, entonces, uniones Holliday que serán disueltas y se restaura la horquilla de replicación.
1.3.3.5 Reparación de trans-aductos
Como se detalló en la sección 1.2.2, los trans-aductos son enlaces covalentes generados entre bases que se encuentran en las cadenas opuestas de la doble hélice. Debido a que este tipo de lesión impide tanto la replicación como la transcripción, los trans-aductos necesitan ser removidos durante todas las fases del ciclo celular. El principal mecanismo que repara este tipo de lesiones está acoplado a la replicación y se denomina Vía de Fanconi (vía FA) (35, 36). En ausencia de horquillas de replicación activas que “censen” la lesión el mecanismo encargado de eliminar los trans-aductos es el proceso de TC-NER (37).
La vía FA coordina proteínas involucradas en los procesos de NER, TLS y HR para reparar trans-aductos en fase S (Fig. 1.7) (38). Cuando una horquilla de replicación activa se encuentra con este tipo de daño se atasca, iniciándose el proceso de reparación. Modelos actuales plantean una estructura en la cual dos horquillas de replicación convergen en un mismo trans-aducto aunque también es probable que una sola horquilla encuentre al daño. A continuación se producen cortes a ambos lados de la lesión, sobre una sola de las hebras del ADN. La lesión unida sobre una de las cadenas en usada como molde por el proceso de TLS para sintetizar ADN en oposición al mismo. A continuación puede actuar el mecanismo de NER y eliminar el daño. Por último, el corte efectuado en uno de los pasos iniciales genera un DSB que será reparado por el proceso de HR (37, 38).
Como puede observarse en el párrafo anterior, la resolución de un trans-aducto es un proceso complejo y la vía FA es la encargada de coordinar los eventos que se necesitan para tal fin. Algunos componentes de este mecanismo, hasta el momento se conocen 15 proteínas y 3 proteínas accesorias, han sido estudiados en profundidad mientras que para otros no se tienen conocimientos claros en cuanto a su función. FANCM es la primera proteína de la vía en actuar. Esta proteína, que presenta actividades helicasa y endonucleasa, forma un complejo junto a FAAP24 (del inglés, FA-associated protein de 24kDa) y es la encargada de reconocer al trans-aducto cuando éste es encontrado por la horquilla de replicación. El heterodímero FANCM-FAAP24 también estabiliza a la horquilla y es el encargado de reclutar a las demás proteínas del core FA. El core FA es un gran complejo conformado por 8 proteínas; FANCM, FANCA, FANCB, FANCC, FANCE, FANCF, FANCG y FANCL, esta última con actividad E3-ubicuitin ligasa. La ubicuitinación del complejo formado por FANCD2 y FANCI (complejo D2-I) es el evento clave de esta vía (se incorpora una ubicuitina en la lisina 561 de FANCD2 y otra en la lisina 523 de FANCI). La ubicuitinación de D2-I localiza a este heterodímero sobre la lesión para coordinar los eventos necesarios para que el trans-aducto sea removido (38).
Vía FA y la escisión del ADN
Se sabe que el complejo D2-I recluta a la nucleasa FAN1 (del inglés, FA associated nuclease 1) y a FANCP o SLX4, proteína encargada de reclutar y modular a las endonucleasas XPF/ERCC1, MUS81/EME1 y SLX1. El reclutamiento de estas nucleasas inicia el proceso de escisión del ADN, el primer corte es efectuado por MUS81/EME1 y el segundo por XPF/ERCC1 (aunque es posible que el complejo XPF/ERCC1 pueda realizar ambos cortes, sin necesidad de la participación de MUS81/EME1 (39). Llamativamente, la unión de FANCD2 con el ADN y su reclutamiento a factorías de replicación se ve impedida en ausencia de XPF/ERCC1, lo que indica que la escisión del ADN genera cierta estructura en el mismo que favorece la estabilización de FANCD2-Ub en el sitio donde se encuentra la lesión (40).
Vía FA y el proceso de TLS
Luego de los cortes, el trans-aducto queda unido a una sola de las cadenas del ADN y dicha lesión se usa como molde para sintetizar ADN en oposición a la misma. Se
sabe que las polimerasas de TLS Rev1 y Pol funcionan juntas para replicar a través de este daño, existen varios estudios que lo afirman. El modelo aceptado en la actualidad postula que Rev1 funciona como andamio para reclutar y coordinar la acción de Pol y otras polimerasas de TLS para tolerar la lesión. En cuanto al rol de las demás polimerasas de TLS en la resolución de trans-aductos, ha sido publicado que Pol puede catalizar el bypass de trans-aductos N2-N2 guaninas in vitro y que la falta de esta polimerasa genera inestabilidad cromosómicas luego de exposición con MMC (41). No se ha dilucidado, aún, como se lleva a cabo el reclutamiento del complejo Rev1-Pol a la horquilla atascada. Algunas líneas de evidencia establecen que ocurre por medio del core FA. En el año 2012 se descubrió una proteína; FAAP20 (del inglés, FA-associated protein de 20kDa), cuya función es conectar al core FA con Rev1 (42). Por lo tanto, el core FA controla el proceso de escisión del trans-aducto a través de la ubicuitinación de FANCD2 y el evento de TLS al reclutar a Rev1 al sitio de daño (38) .
Vía FA y el proceso de HR
Debido a la escisión de las regiones que flanquean al trans-aducto, se genera un DSB en una de las cromátides, como intermediario del proceso de reparación. Como ya mencionamos, HR es el principal mecanismo que permite resolver DSBs en las fases S/G2 y, en este caso, puede utilizar como molde la cadena homóloga restaurada por TLS. La vía FA no solo promueve el mecanismo de HR sino que también suprime NHEJ, lo que sugiere que este mecanismo dirige a los DSBs hacia el proceso de HR evitando NHEJ, para prevenir una reparación inapropiada. Varios factores de FA están involucrados en el proceso de HR. Como se detalló en la sección 1.3.3.4, uno de los principales eventos de HR es el cargado de la proteína Rad51 sobre una de las cadenas del ADN para invadir a la cromátide hermana y buscar homología en su secuencia. Se sabe que varias proteínas de la vía FA están involucradas en este proceso; FANCD1 o BRCA2 interacciona con Rad51 y promueve el cargado de esta proteína sobre el ADNsc (43, 44), BRCA1 también promueve el cargado de Rad51 a través de su interacción con FANCN y FANCD1 (45) y FANCO o Rad51C también facilita dicho evento y la resolución de las uniones Holliday (46, 47). Por último, la helicasa FANCJ actúa sobre uno de los primeros intermediarios de HR; el D-loop que se forma como consecuencia de la invasión de una de las cadenas de ADN a la cromátide hermana (48). En última instancia el complejo USP1-UAF1 remueve la
ubicuitina presente en el complejo FANCD2-FANCI y se completa el proceso de reparación de un trans-aducto.
Es importante destacar que, como se comentó en la sección en la que se detalla el proceso de TLS, las polimerasas que forman parte de esta vía pueden colocar bases incorrectas en oposición a la lesión y no presentan actividad de lectura de prueba 3’5’, lo que hace que el mecanismo de reparación de un trans-aducto dependiente de FA sea propenso a error. Esto implica que la vía FA normalmente promueve mutaciones puntuales a través de TLS pero previene eventos mutagénicos más contundentes como deleciones o inserciones (38). Por ende, la resolución de trans-aductos es siempre mutagénica, siendo la mutagénesis puntual una opción aceptada para prevenir reordenamientos cromosómicos complejos.
Fig. 1.7: Interacción de las proteínas de la vía FA para la resolución de un trans-aducto en fase S.
A) Dos horquillas de replicación convergen en un trans-aducto. B) El complejo formado por FANCM-FAAP24, junto a MHF1/2, reconoce la estructura formada por una horquilla de replicación atascada y recluta al core FA al sitio de daño. FANCM, a través de su actividad traslocasa, previene
el colapso de la horquilla y se conecta con ATR-Chk1 para iniciar el proceso de cheque del ciclo celular. C) El core FA, a través de su ubicuitin E3 ligasa, monoubicuitina a FANCD2 y FANCI y este heterodímero es reclutado al sitio de daño. D) FANCD2-Ub actúa como una plataforma que recluta a múltiples nucleasas para coordinar la escisión de las regiones que flanquean a la lesión. FANCP/SLX4, que interacciona con las nucleasas ERCC1–XPF, MUS81–EME1 y con FAN1 es la responsable de esta etapa. E) Los cortes efectuados a ambos lados del trans-aducto dejan a la lesión unida a una de las cadenas del ADN, lesión que será empleada como molde para la síntesis de ADN por medio del proceso de TLS. Las polimerasas de TLS REV1 y Pol ζ se encargan de este evento. F) Los cortes de la primera etapa generan un DSB que será reparado por HR. Las proteínas de la vía FA que se encuentran río abajo del core FA se encargan de promover la invasión dependiente de Rad51 de la cromátide hermana y de la resolución de los intermediarios recombinantes. El proceso de NER remueve el aducto. G) En última instancia el complejo USP1-UAF1 remueve la ubicuitina presente en el complejo FANCD2-FANCI y se completa el proceso de reparación de un trans-aducto.
1.4 ANEMIA DE FANCONI
La Anemia de Fanconi (FA) es una enfermedad severa que surge como consecuencia de mutaciones en alguno de los genes que codifican para las proteínas de la vía FA.
1.4.1 Aspectos clínicos de la enfermedad
La FA es un desorden caracterizado por múltiples anormalidades congénitas y hematológicas y una gran predisposición a diferentes tipos de cáncer (32). Es un trastorno recesivo, poco frecuente ya que afecta a 1:360.000 nacimientos, que se caracteriza por un aumento en el reordenamiento espontáneo de los cromosomas, tumorigénesis y muerte celular (37, 49). Los signos iniciales de FA incluyen defectos óseos, disfunción renal, baja estatura) y frecuentemente hipo- e hiper-pigmentación de la piel y manchas café_au_lait (50). En cuanto a esta última característica, el 75% de los pacientes presenta lesiones en la piel, las que muestran alteraciones en los queratinocitos y anormalidades nucleares.
Las alteraciones hematológicas son el principal problema en la FA, el 75-90% de los pacientes desarrollan fallas en la médula ósea, el riesgo de presentar leucemias
mieloides agudas es 800 veces mayor que en la población sana. Si bien no se conocen las causas exactas de los defectos hematológicos, se cree que provienen de una intolerancia de las células sanguíneas de FA al estrés oxidativo (29). Los pacientes también suelen presentar elevado riesgo de desarrollar carcinomas de células escamosas (51) (700 veces más elevado que en la población sana (52) y presentan problemas auditivos y de fertilidad (29).
No solo las células de la sangre sino todas las células derivadas de pacientes con FA son muy sensibles a los trans-aductos (37, 49), de hecho, el test diagnostico clásico que se emplea para detectar esta enfermedad radica en la hipersensibilidad de las células a agentes inductores de dichas lesiones (29). La sensibilidad de los pacientes FA a los trans-aductos ha sido el motivo por el cual los conocimientos actuales sobre esta enfermedad se centraron en estudios efectuados con drogas tales como la MMC y el cisplatino, inductores de enlaces covalentes entre las cadenas opuestas del ADN.
Actualmente no existe una cura para esta enfermedad, sí tratamientos y terapias tendientes a mejorar o atender problemas asociados con la FA. Debido a que estos pacientes suelen presentar fallas hematológicas y diferentes tipos de leucemias, gran parte de la población con FA debe recurrir a trasplantes de médula ósea. Como en todo trasplante de médula, los pacientes son sometidos previamente a un “acondicionamiento” que consiste en tratamientos quimioterapéuticos y/o radiológicos con el fin de hacer espacio en la médula para dejar sitio a la médula sana, para suprimir el sistema inmunológico del paciente y reducir la probabilidad de rechazo del injerto y/o para destruir las células cancerosas que pudiera haber en el paciente(53). Es importante destacar que, como estos pacientes presentan fallas en un mecanismo de reparación del ADN, las terapias convencionales de acondicionamiento resultan perjudiciales para su salud y deben implementarse variantes de las mismas.
Entre el 50 y el 75% de los pacientes con FA responden a un grupo de andrógenos, como la oximetalona que suelen estimular la producción de células sanguíneas por extensos períodos de tiempo. Sin embargo, estas hormonas masculinas dejan de ser
efectivas luego de un determinado plazo y, además, producen varios efectos secundarios (53).
1.4.2 Relación de la FA con la luz UV
Como acabamos de comentar, los estudios sobre la FA y los mecanismos moleculares relativos a la vía se han enfocado en el uso de drogas que generan trans-aductos. No obstante, es curioso que una de las principales características que presentan estos pacientes, la hipo/hiperpigmentación de la piel y las manchas café_au_lait, sea un defecto asociado con la piel. De hecho, existen varios reportes que indican que la vía FA se activa frente a radiación con luz UV.
Uno de los primeros reportes que relacionan la FA con la luz UV data del año 1982 y muestra que la reparación del ADN en fibroblastos provenientes de pacientes con FA se ve afectada frente a dicha irradiación. En ese trabajo se evaluó la relajación de los complejos ADN-ARN por medio de la técnica de sedimentación en gradientes de sacarosa. Si bien pudieron observar desviaciones respecto de la situación control, en ese momento no se pudo determinar las consecuencias de tales resultados (54). En los últimos años han surgido investigaciones en torno a la relación de la vía FA frente a luz UV. Se ha comprobado que FANCD2 se monoubicuitina y se recluta a factorías de replicación y, lo que es más interesante aún, que dicha activación es independiente del proceso de NER [23]. Se ha reportado, también, que la ausencia de FANCD2 disminuye el reclutamiento a factorías de replicación de Rad51 y el intercambio entre cromátides hermanas (evento que es llevado a cabo por el mecanismo de recombinación homóloga), luego de UV (55). Células deficientes en la vía FA presentan frecuencias de mutaciones puntuales espontaneas e inducidas por luz UVC similares a las células control [27] y una sensibilidad baja o nula frente a luz UV [28-31].
2.
HIPOTESIS DE TRABAJO
Al analizar la bibliografía disponible hasta el momento sobre la vía FA, su rol en la replicación del ADN y su interacción con la radiación UV, nos surgieron preguntas que derivaron en el presente trabajo de tesis.
Como mencionamos anteriormente, los pacientes con FA presentan mutaciones en alguno de los genes que codifican para las proteínas que forman parte de la vía FA (56). Como se explicó en la sección 1.3.3.5, una de las proteínas centrales de la vía FA es FANCD2, quien se une a un trans-aducto una vez que ha sido monoubicuitinada junto a FANCI por el core FA (57). De hecho, el complejo FANCD2-FANCI se une preferentemente a estructuras de ADN ramificadas, derivadas de los intermediarios que surgen durante la reparación de los trans-aductos (35, 58). FANCD2 recluta a las nucleasas que realizan los cortes en torno a la lesión (35) y coordina la activación de TLS, NER y de HR (37, 49). Como puede verse, esta proteína es crucial para la resolución de un trans-aducto. Por otro lado, las células deficientes en FANCD2 son sólo moderadamente sensibles a agentes genotóxicos como la radiación gamma o los rayos X, agentes que generan DSBs independientemente de la replicación (59-62). En efecto, FANCD2 no tiene un rol importante en la reparación de DSBs generados por enzimas de restricción (63). Estos resultados hacen suponer que FANCD2 es especialmente relevante para la resolución de DSBs acoplados a la replicación pero no para aquellos DSBs generados directamente. NNoo o obbssttaannttee,, llaa ppaarrttiicciippaacciióónn ddee FFAANNCCDD22 eenn llaa rreessoolluucciióónn ddee llooss DDSSBBss ffoorrmmaaddooss eenn uunnaa h hoorrqquuiillllaaddeerreepplliiccaacciióónnccoommooccoonnsseeccuueenncciiaaddeeuunnddaaññooddiissttiinnttooaauunnttrraannss--aadduuccttoo,,aaúúnnnnoo h haassiiddooddeemmoossttrraaddaa..
Una cuestión que nos pareció sumamente interesante fue el hecho de que ccéélluullaass
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Por otro lado, en contraste con lo que sucede con los trans-aductos, la eliminación de los cis-aductos generados por UV no requiere la coordinación de los procesos de TLS, NER y HR. De hecho, se ha demostrado que las vías de NER y TLS pueden compensarse entre ellas para remover CPDs (68). Además, en ausencia de la vía FA el proceso de NER no se encuentra alterado (69).¿Cuál sería, entonces, la relación de esta vía con los procesos que se activan de forma independiente frente a la generación de un CPD?
En base a lo mencionado, se plantearon los siguientes objetivos en el presente trabajo:
2.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar el rol de FANCD2 frente a radiación con luz UV y entender la relación de la vía FA con los mecanismos de respuesta al daño que actúan bajo dicho contexto.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Generar herramientas que permitan modular negativamente diversas proteínas del mecanismo de FA.
Estudiar cómo se ven afectados diversos marcadores de inestabilidad genómica en ausencia de FANCD2 y frente a luz UV.
Evaluar la relación de FANCD2 con determinadas proteínas de la vía de TLS y de la reparación de DSBs.
Generar herramientas que permitan testear la presencia de DSBs en nuestro sistema de estudio y evaluar si FANCD2 tiene relación con dicho tipo de lesión al ADN.
Estudiar los efectos de FANCD2 en el contexto de la fase S del ciclo celular, a fin de poder determinar si la función de esta proteína frente a UV es relevante para la síntesis de ADN.
Establecer el mecanismo mediante el cual, la vía FA puede facilitar la replicación de ADN dañado por luz UV.
