Formación del huevo e infección con salmonelas

El sistema reproductor de la gallina (Figura 1.3 A) se divide en dos regiones: ovario y oviducto izquierdo. El ovario y oviducto derecho, si bien existen en el ave joven, se atrofian durante la maduración del aparato reproductor y no son funcionales en el ave adulta (Howard et al., 2012). El ovario en la gallina adulta presenta numerosos folículos en distintas etapas de desarrollo. Cada folículo está formado por capas concéntricas de tejido que rodean al oocito o yema. Estas capas desde adentro hacia afuera son: una capa perivitelina acelular, una capa monocelular llamada granulosa, una capa basal, dos tecas (interna y externa) con células intersticiales, una capa de tejido conectivo y un epitelio superficial. El oviducto, se extiende desde las proximidades del ovario hasta su desembocadura en la cloaca. En él se distinguen varios segmentos (Asensio, 2009):

Capítulo 1 Introducción General 25 1. Infundíbulo: es el primer segmento del oviducto, tiene forma de embudo y es

una zona muy fina, casi transparente.

2. Magnum: es el segmento más largo, posee células y glándulas secretoras.

3. Istmo: está claramente diferenciado del segmento anterior, por ser más pequeño y menos plegado.

4. Útero o glándula de la cáscara: destaca el espesor de sus paredes musculares y numerosos pliegues en distintas direcciones.

5. Vagina: une el útero con la cloaca.

Figura 1.3. Partes del aparato reproductor de la gallina (A) y estructura del huevo (B) (Jonchère et al., 2010)

Durante la formación del huevo, en el ovario maduran los óvulos y se acumulan las proteínas de la yema. Después de la ovulación la yema ingresa al oviducto donde se irán depositando secuencialmente la clara, las membranas de la cáscara y la cáscara en el magnum, el istmo y el útero, respectivamente. La gallina produce entonces una estructura cerrada, completamente autosuficiente y biológicamente aséptica que asegura el desarrollo extrauterino del embrión (Jonchère et al., 2010). Por lo tanto, el huevo necesita de un

Capítulo 1 Introducción General 26 sistema de defensa, tanto físico como químico que limite la contaminación microbiana durante el desarrollo del embrión (Howard et al., 2012).

Dentro de las defensas físicas del huevo, se encuentran la cutícula, la cáscara y las membranas de la cáscara. La cutícula, es una capa proteica, secretada sobre la cáscara inmediatamente antes de la oviposición, siendo la primera defensa física del huevo. La cáscara posee entre 7.000 a 17.000 poros y representa una de las barreras más visibles a la contaminación externa. Por debajo de la cáscara, se encuentran las membranas externa e interna de la cáscara (Figura 1.3 B). Estas membranas están totalmente unidas excepto en la zona de la cámara de aire, la cual se forma luego de la oviposición, al separarse ambas membranas.

Entre las defensas químicas del huevo, se encuentran en la clara la lisozima, la ovotransferrina y el ovomucoide, entre otros. La lisozima rompe los enlaces N- acetilneuramina y N-acetilglucosamina de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y también es capaz de formar poros en la pared celular de las bacterias Gram-negativas (Kang et al., 2006). La ovotransferrina es un agente quelante que secuestra el hierro de la clara y, de esta manera, no queda disponible para las bacterias. El ovomucoide es una proteinasa inhibidora que impide que las bacterias utilicen las proteínas de la clara. Por último, la membrana vitelina, que rodea a la yema, mantiene su integridad y evita que la clara y yema se mezclen, lo que debilitaría las defensas del huevo al permitir el paso de los nutrientes y un exceso de hierro hacia la clara (Howard et al., 2012).

Existen dos rutas posibles para la contaminación del huevo por Salmonella. En la ruta transovárica o transmisión vertical, la membrana de la yema o de la clara se contamina directamente como resultado de la infección de los órganos reproductivos (ovarios u oviductos), antes de la formación de la cáscara. En la transmisión horizontal, la salmonela penetra a través de la cáscara (Messens et al., 2006), desde el intestino colonizado o las excretas durante o después de la oviposición. Mientras que los serotipos de Salmonella

aislados de la cáscara de huevo son diversos, la contaminación interna en huevos intactos está dominada por S. Enteritidis (Gantois et al., 2009).

1.5.1. Contaminación del huevo antes de la oviposición.

La deposición de S. Enteritidis dentro de los huevos en formación es consecuencia de la colonización de los tejidos reproductivos. La localización inicial de la bacteria dentro del huevo está determinada por la región del tracto reproductivo involucrada en la infección. Aunque se ha documentado una relación epidemiológica única entre S.

Capítulo 1 Introducción General 27 Enteritidis y la contaminación del contenido de huevo, otros serotipos son capaces de colonizar el tracto reproductivo y llegar al interior del huevo, como por ejemplo S. Heidelberg (Gast et al., 2011a). Gantois et al. (2008) compararon la capacidad de colonización del tracto reproductivo de gallinas de postura por parte de los serotipos S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Heidelberg, S. Virchow y S. Hadar. Estos autores encontraron que los distintos serotipos colonizan los órganos reproductivos en diferentes grados, siendo S. Enteritidis y S. Typhimurium los serotipos con mayor capacidad de infección. Sin embargo, una alta frecuencia de infección no siempre está relacionada a una alta frecuencia de contaminación del contenido de huevo (Gast et al., 2011b).

Ensayos experimentales de inoculación oral indican que las salmonelas pueden interactuar con los componentes celulares de los folículos preovulatorios. Los microorganismos transportados por la sangre pueden depositarse cerca de la membrana basal de las células de la teca. Desde ese lugar, la bacteria penetra la membrana basal y la yema invadiendo después las células de la granulosa o migrando entre las células y atravesando la capa perivitelina (Gast y Holt, 2001). Está demostrado que S. Enteritidis interactúa con las células granulosas de una manera específica, invadiendo y multiplicándose en estas células; desde ese lugar las bacterias pueden llegar a la yema, atravesando la membrana perivitelina (De Buck et al., 2004). Cogan et al. (2004) demostraron que las fimbrias son las encargadas de unirse a la membrana vitelina para alcanzar la yema. Existen niveles altos de nutrientes disponibles para las bacterias en los folículos ováricos, por lo que se esperaría una extensa multiplicación bacteriana en este sitio. Dicha multiplicación resultaría inevitablemente en una degeneración folicular. Sin embargo, este fenómeno no es común en infecciones naturales de gallinas de postura, por lo que se considera que la colonización de Salmonella en los folículos no sería una fuente importante de contaminación del huevo, pero este tema se encuentra aún en debate (Gantois et al., 2009).

La infección del oviducto puede ocurrir de manera ascendente desde la cloaca o desde la vagina, con una consecuente infección del istmo y del útero, raramente alcanzando el oviducto superior. Por otro lado, antes de la formación de la cáscara puede ocurrir que, los huevos en formación se contaminen por una infección descendente desde los tejidos del ovario (De Buck et al., 2004). Por lo tanto, dependiendo del sitio de colonización endógena, Salmonella puede incorporarse tanto a la clara como a la cáscara y sus membranas. Si bien Salmonella ha sido aislada de la clara y de la yema, la mayoría de los autores concuerdan que la clara es siempre la que está más frecuentemente contaminada, lo

Capítulo 1 Introducción General 28 que sugiere que el magnum del oviducto es un sitio frecuente de colonización (Gantois et al., 2009).

La interacción entre S. Enteritidis y el oviducto juega un rol principal en la contaminación del huevo. S. Enteritidis invade las células tubulares glandulares del oviducto por interacción de las fimbrias tipo I y los residuos de manosa presentes en las secreciones del tejido. Gantois et al. (2008) demostraron, mediante un estudio in vitro, que otros serotipos de Salmonella poseen la misma capacidad de invasión, por lo que no es una característica única de S. Enteritidis. Por otro lado, estos autores mostraron que tanto S. Enteritidis como S. Typhimurium y S. Heidelberg sobreviven en la clara de huevo durante 24 horas a 42ºC. Este es el tiempo promedio para la formación natural del huevo en el oviducto. En cambio, S. Virchow y S. Hadar fueron mucho más susceptibles a la actividad antimicrobiana de la clara.

1.5.2 Contaminación del huevo después de la oviposición

Algunos autores afirman que la contaminación fecal después de la oviposición es la principal forma de contaminación de los huevos (Gantois et al., 2009). Otros (De Buck et al., 2004) señalan que la contaminación fecal es menos probable en una gallina sana. Sin embargo, este tipo de contaminación es crítica en relación con la higiene del galpón, el manejo y transporte de los huevos.

Después de la oviposición, el huevo está expuesto a una variedad de áreas contaminadas y una mayor contaminación depende de la presencia de un alto grado de materia orgánica húmeda, incluyendo las excretas, que actúan como una barrera de protección y aporte de nutrientes para la sobrevivencia y desarrollo de Salmonella sobre la cáscara. Además, el huevo queda expuesto a una temperatura corporal menor que la del ave, creando de ese modo una presión negativa, lo que permitiría a las bacterias penetrar más fácilmente tanto la cáscara como las membranas, primero a través de los poros que carecen de la protección de la cutícula. A medida que la cuticula se seca y se contrae, los poros quedan más expuestos al pasaje de las bacterias (Howard et al., 2012).

En la etapa inicial de la contaminación horizontal, las bacterias se encuentran localizadas entre la cáscara y las membranas; estas últimas actúan como filtros y representan sólo una barrera temporal para el pasaje hacia el interior del huevo (Messens et al., 2006).

Distintas especies bacterianas parecen tener diferente capacidad para penetrar la cáscara del huevo (Messens et al., 2006). De Reu et al. (2006) compararon la capacidad de penetrar la cáscara de siete especies bacterianas aisladas de contenido de huevo. Estos

Capítulo 1 Introducción General 29 autores encontraron que Pseudomonas sp., S. Enteritidis y Alcaligenes sp. tienen mayor capacidad para penetrar la cáscara.

La contaminación en el lugar de envasado es un factor importante en la contaminación externa de la cáscara (Messens et al., 2006). Viora et al. (1993) encontraron que 50 de 100 muestras de maples, que habían sido utilizados en las granjas, estaban contaminadas con S. Enteritidis. Soria (2012) investigó la presencia de Salmonella en 452 muestras de maple, encontrando sólo 5 muestras positivas; los serotipos encontrados fueron S. Muenchen, S. Westhampton, S. Agona, y S. Enteritidis.

Una vez dentro del huevo, las bacterias enfrentan un ambiente desfavorable, ya que la clara es rica en lisozima y carece de hierro disponible debido a la presencia de la ovotransferrina (Guard-Peter, 2001). Por otro lado, también existen anticuerpos maternales, que son transferidos al huevo y posteriormente al embrión en desarrollo. La IgY es la principal inmunoglobulina en la yema de huevo, mientras que la IgA e IgM se encuentran principalmente en la clara (Kaspers et al., 1996). Se ha sugerido que al pasar el tiempo, los huevos tienen una pérdida parcial de la integridad de la membrana vitelina y como consecuencia ocurre el paso de nutrientes hacia la clara. Esto desencadena la quimiotaxis de Salmonella hacia la membrana vitelina con la subsecuente invasión en la yema. Una vez allí, puede producirse un rápido crecimiento de la bacteria (Van Immerseel

et al., 2010).

Debido a la baja incidencia de contaminación del huevo en condiciones naturales y a la labor intensiva que implica examinar un gran número de huevos, no se dispone de suficientes estudios para establecer definitivamente cuál es el principal sitio de contaminación. Sin embargo, es razonable sugerir que debido a que Salmonella Enteritidis puede ser aislada de todos los sitios del tracto reproductivo de las gallinas, es posible que con este serotipo, en particular, la contaminación pueda provenir de cualquier parte del aparato reproductor de la gallina (Gantois et al., 2009).