Generación de una genoteca de variantes de N-FimH en phage display

genoteca Ñ con dos tipos de virus auxiliares: VCS-M13 y M13KO7ΔpIII (Hiperfago), con el objetivo de verificar la correcta fusión N-FimH-pIII. El rescate se realizó tal y como se ha descrito en Materiales y Métodos (apartado 10). Los fagos rescatados se analizaron en Western blot con anticuerpo anti- pIII-POD (Figura 26). Puesto que el título de fagos que se obtiene con el hiperfago es menor (5-10 veces) que el obtenido con VCS-M13, las muestras se equipararon cargando idéntico número de PFU por carril. Este experimento nos mostró que los niveles de fusión N-FimH-pIII en la genoteca Ñ aumentan con el hiperfago (Figura 26).

FIGURA 26. Rescate de fagos de la genoteca Ñ. Se

realizaron rescates de fagos de la genoteca Ñ con VCS- M13 o M13KO7ΔpIII como fagos auxiliares. Las muestras se analizaron en Western blot cargando idéntico número de PFU (~1010_{) con mAb anti-pIII-POD. A la izquierda se}

indican los tamaños (en kDa) de las bandas.

2.4. Generación de una genoteca de variantes de N-FimH en phage display

Realizamos un modelo 3D del dominio N-FimH para localizar las posiciones de la genoteca Ñ aleatorizadas (Figura 27). En este modelo se reemplazaron los aminoácidos que se iban a mutar al azar por alaninas. Se observa que los bucles 2 y 3 están próximos entre si en la estructura 3D, formando una superficie contigua hacia el exterior de la proteína. Además se aprecia que la mutación permanente D54A, que elimina la unión a D-manosa, se localiza en el

centro del bolsillo de unión. Existe una zona adicional donde se concentran las mutaciones del bucle 1 localizada también hacia el exterior de la proteína.

FIGURA 27. Modelo 3D del dominio N-FimH con los residuos seleccionados para la mutagénesis al azar

en la genoteca Ñ reemplazados por alaninas. Se marcan en azul los residuos que se mutaron al azar y en naranja los residuos que se mutaron a otros fijos. La mutación permanente D54A se marca en naranja. Se muestra la estructura secundaria de la proteína (izda) y la estructura a nivel de superficie (dcha). Se incluye un vídeo de este modelo 3D (Genoteca Ñ) como material suplementario en el CD que acompaña esta Tesis.

Para comprobar que la mutación permanente D54A elimina por completo la unión a D-manosa de N-FimH se realizó un ensayo de ELISA de unión de los fagos de la genoteca Ñ al antígeno mannan. En este ensayo comparamos la genoteca Ñ con fagos conteniendo N-FimH silvestre. El resultado indica que la unión a D-manosa desaparece en la genoteca Ñ, al haber introducido la mutación D54A (Figura 28). Ensayos similares de ELISA con diferentes proteínas abundantes en células eucariotas, nos mostraron que las mutaciones permanentes introducidas en la genoteca Ñ no habían generado uniones inespecíficas a ellas (datos no mostrados).

FIGURA 28. Unión de los fagos

rescatados de la genoteca Ñ a mannan. Se añadió una dilución saturante (~1013

CFU/ml) de los fagos conteniendo la genoteca Ñ o N-FimH a una placa de ELISA recubierta con mannan o BSA como control. La reacción se reveló con mAb anti-M13-POD.

Una vez realizados estos controles procedimos a escalar el proceso de construcción de la genoteca Ñ, optimizando las condiciones de PCR, digestión, ligación y transformación (Noren y Noren, 2001). Para garantizar la diversidad de la genoteca se realizaron 275 reacciones de PCR de ensamblaje que fueron mezcladas en una única reacción. Se digirieron 2 µg de esta reacción de PCR y 40 µg del vector pXylE5EGln con las enzimas SfiI/NotI. Los productos de estas digestiones una vez purificados desde geles de agarosa fueron fenolizados, precipitados y resuspendidos en agua. Se realizó una ligación en un total de 1,5 ml de reacción que contenían 3 µg del vector y 400 ng del producto de PCR. Esta ligación se fenolizó, precipitó y resuspendió en 150 µl de agua transformándose finalmente en células electrocompetentes de la cepa de E. coli DHB4, con alta eficiencia de transformación (~1010

colonias/µg DNA) mediante 150 reacciones de electroporación. Una vez obtenida la genoteca Ñ de ~7x108 _{clones se aislaron los plásmidos en conjunto}

de dicha genoteca para ser transformados a células de la cepa TG1, más adecuada para técnicas de phage display. Por último, se realizaron rescates con el virus auxiliar hiperfago en 12 grupos de la genoteca contenida en la cepa TG1 (~7x108 _{clones) para minimizar la propagación de determinadas}

variantes frente a otras. Una vez realizados los rescates se mezclaron cantidades equivalentes de los clones de los distintos grupos para obtener finalmente una genoteca de ~7x108 _{variantes de N-FimH presentadas en la}

La colección de fagos obtenida fue sometida a procesos de selección o biopanning frente a diferentes antígenos de naturaleza proteica tales como fibrinógeno, integrina α2β3, Taq polimerasa, o proteína SUMO humana. Asimismo, se emplearon diferentes técnicas para la selección de fagos. En una primera aproximación se fijaron los antígenos a placas de inmunoensayo, que una vez bloqueadas fueron incubadas con la colección de fagos procedentes de la genoteca Ñ para rescatar variantes de afinidad específica frente a estos antígenos. El resultado fue negativo, ya que no se rescataron fagos con unión específica frente a ninguno de los antígenos, a pesar de que se ensayaron diferentes condiciones de unión (cantidad de antígeno), bloqueo (diversas mezclas proteicas), lavado (presencia o ausencia de detergentes, tiempo y número de lavados) y elución (por competición frente al antígeno o por cambios a pH ácido o básico). Posteriormente realizamos una segunda estrategia en la que las proteínas de interés se conjugan a un derivado de biotina con un puente disulfuro (D-biotina) para ser fijado a las placas de inmunoensayo recubiertas con estreptavidina. Después de la incubación de los fagos y tras rondas de lavado para eliminar los fagos no unidos al antígeno, se realiza una elución con DTT que rompe el puente disulfuro formado entre el antígeno y la biotina, de forma que sólo deben eluir aquellos fagos que queden específicamente unidos al antígeno. De nuevo no obtuvimos resultados positivos de unión en ninguno de los casos. Hasta el momento no hemos sido capaces de explicar el motivo por el cual no se han conseguido rescatar fagos procedentes de la genoteca Ñ, ya que el conjunto de experimentos realizado con esta genoteca indica que las variantes de N-FimH presentadas en la superficie de fagos son estables y solubles.