Ingeniería de dominios tipo Ig

El desarrollo de técnicas de manipulación de DNA ha permitido la ingeniería de numerosas proteínas. Entre éstas encontramos los denominados “scaffolds” proteicos, que son estructuras polipeptídicas con una gran estabilidad conformacional y que toleran modificaciones en su secuencia, lo que las convierte en candidatas ideales para la generación de nuevos ligandos con

aplicaciones en investigación y medicina. El desarrollo de esta tecnología comenzó con la observación de que las inmunoglobulinas están compuestas por regiones altamente conservadas que definen la estructura del dominio Ig y por regiones hipervariables o complementarity determining regions (CDRs) que determinan la especificidad de reconocimiento del antígeno (Nygren y Skerra, 2004; Skerra, 2000a). Sin embargo, la complejidad estructural de los anticuerpos dificulta enormemente su manipulación y expresión en sistemas sencillos como los organismos procarióticos o los bacteriófagos. Por este motivo se han utilizado fragmentos de anticuerpos, con estructura tipo Ig en los cuales se mantienen las propiedades de unión del anticuerpo del que provienen, al mismo tiempo que se simplifica su estructura (Better et al., 1988; Plückthun, 1996; Skerra y Plückthun, 1988). Además, se han utilizado otras estructuras diferentes de los anticuerpos para la generación de proteínas con nuevas capacidades de unión. Entre otras encontramos inhibidores de proteasas (Stoop y Craik, 2003), estructuras basadas en α-hélices (Sandstrom et al., 2003), enzimas como la tiorredoxina (Chakraborty et al., 2006; LaVallie et al., 1993), lipocalinas (Schlehuber y Skerra, 2005; Skerra, 2000b) y repeticiones de dominios ankyrina (Binz et al., 2006; Kohl et al., 2003; Mosavi et al., 2002) o de polipéptidos ricos en leucina (Stumpp et al., 2003).

Para que una proteína pueda ser utilizada como scaffold proteico además de poseer una estabilidad y tamaño adecuados, se deben cumplir varios requisitos: i) poseer regiones estructurales diferenciadas que permitan por un lado el plegamiento de la proteína y por otro el reconocimiento del antígeno, ii) contener un núcleo hidrofóbico que permita adoptar un plegamiento energéticamente favorable, iii) poseer un centro activo o bolsillo de unión accesible, separado espacialmente del núcleo hidrofóbico e implicado en el reconocimiento (preferiblemente) de diferentes antígenos. Estos sitios de unión frecuentemente se localizan en bucles de la superficie de la proteína y debido a su mayor flexibilidad, comparada con estructuras secundarias definidas como las hélices α o las hojas β, les permiten tolerar pequeñas modificaciones (Skerra, 2000a). Además es crítico para la elección adecuada de los residuos a

mutar el disponer de información estructural de la proteína (Nygren y Skerra, 2004).

La idea de utilizar el dominio N-terminal de FimH como un nuevo scaffold proteico surgió con la observación de que dicho dominio cumple todos los requisitos inicialmente requeridos para la generación de nuevos scaffolds estructurales. Debido a su pequeño tamaño (~15 kDa), sus características estructurales (dominio tipo Ig formado por hojas β con bucles expuestos hacia el exterior) y la disponibilidad de información estructural gracias a la resolución del cristal del complejo FimC-FimH (Choudhury et al., 1999), pensamos que podría ser un candidato óptimo para la generación de adhesinas recombinantes con nuevas capacidades de unión. La ventaja de emplear el dominio N-FimH como un nuevo scaffold proteico frente a otros previamente utilizados reside en que la proteína FimH se ensambla en fimbrias tipo 1 de forma natural en cepas de E. coli y en otras enterobacterias, por lo que podríamos expresar las nuevas variantes de FimH en bacterias de manera sencilla. De esta forma podríamos redirigir el tropismo bacteriano hacia células presentadoras de antígeno o células tumorales que expresen determinados antígenos reconocidos por las variantes recombinantes de FimH. Esto supondría un gran potencial terapéutico para el desarrollo de cepas vacunales o para la detección de, por ejemplo, antígenos tumorales in vivo.

Para la selección de variantes desde una genoteca de N-FimH mutado decidimos utilizar la técnica de phage display, ya que permite seleccionar variantes con alta afinidad frente a una estructura biológica concreta. La selección inicial de los residuos a mutar en el dominio N-FimH (apartado 2.2 de Resultados) se realizó en base a la información estructural proporcionada por la resolución del cristal del complejo FimC-FimH (Choudhury et al., 1999). Se seleccionaron únicamente residuos contenidos en tres de los bucles expuestos hacia el exterior de la proteína, que comprendían los residuos G14 a G16 (bucle 1), D47 a T51 (bucle 2) y N136 a D140 (bucle 3), manteniendo intactos aquellos residuos que forman estructuras secundarias definidas (hojas

β y hélice α) para mantener el correcto plegamiento de la proteína (Figura 22). Estos bucles generaban una superficie nueva de interacción en N-FimH. Sin embargo, los resultados obtenidos con la genoteca inicialmente construida (genoteca α) mostraron que el dominio N-FimH no se fusionaba de forma estable a pIII en la cápsida del fago M13. Pensamos que quizá entre los residuos seleccionados para la mutagénesis en la genoteca α se encontraban algunos de los que dependía el correcto plegamiento de la proteína, por lo que decidimos analizar la estabilidad de N-FimH realizando la mutagénesis de forma individual en los tres bucles seleccionados o bien en combinaciones de los distintos bucles (apartado 2.3 de Resultados). Las genotecas construidas de esta forma (genotecas A, B, C, D, E, F, G, H, I, J) nos mostraron que el dominio N-FimH tolera completamente las mutaciones introducidas en el bucle 1, y parcialmente aquellas introducidas en los bucles 2 y 3. Sin embargo, no se toleran adecuadamente combinaciones de los distintos bucles que contienen las mutaciones. Para explorar si este dominio tolera mutaciones en residuos diferentes se construyeron nuevas genotecas con variaciones en las regiones inicialmente seleccionadas para la mutagénesis (genotecas K, L, M, N, Ñ, O, P, Q). Las genotecas K y L demostraron tolerar adecuadamente las mutaciones introducidas en 7 y 5 residuos respectivamente, obteniéndose niveles del dominio N-FimH mutado similares al silvestre en la cápsida del bacteriófago. Sin embargo, para la búsqueda de variantes de FimH con nuevas especificidades de unión decidimos utilizar la genoteca Ñ, ya que aunque presenta un menor nivel de presentación en el fago posee mutaciones en 10 residuos en 3 bucles contiguos en la estructura, lo que podría favorecer la generación de nuevas especificidades de unión al aumentar el número de residuos aleatorizados y la superficie de interacción. Los resultados obtenidos en los procesos de selección o biopanning frente a diferentes antígenos proteicos y en diferentes condiciones experimentales fueron negativos, ya que no obtuvimos variantes con unión específica a ninguno de los antígenos ensayados. Entre las posibles causas que explicarían este resultado está el que las variantes tengan una afinidad baja por los antígenos, lo que impediría que sean aisladas mediante la tecnología de phage display. Este problema

podría solucionarse mediante la expresión de las variantes contenidas en la genoteca en la superficie bacteriana (bacterial display) bien ensambladas en fimbrias tipo 1 o fusionadas a proteínas de la ME (p. ej. autotransportadores, Omps) lo que aumentaría el número de copias de cada variante en la célula, pudiendo favorecer la unión a los antígenos.