Mutagénesis dirigida de N-FimH y genotecas en phage display

La introducción de aminoácidos al azar en los residuos seleccionados para la mutagénesis de N-FimH se realizó con oligonucleótidos degenerados (SGS- DNA) con una secuencia NN(C/G/T).

La estrategia general que se siguió para introducir los tres grupos de mutaciones en FimH se describe a continuación (Figura 15). En primer lugar se realizaron dos reacciones de PCR (PCR-1 y PCR-2). La PCR-1 se realizó con un oligonucleótido degenerado que amplifica desde 5´ y un oligonucleótido no degenerado para 3´ (Tabla 4). La PCR-2 se realizó con otra pareja de oligonucleótidos, ambos degenerados (Tabla 4). Para estas PCRs 10 ng del vector pFH35 se utilizaron como molde en una reacción de 50 µl; 20 mM Tris- HCl pH 8,8; 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100, 1

mM de cada dNTP; 0,5 µM de mezcla de oligonucleótidos específica para cada genoteca y 1 unidad de Vent DNA polimerasa (New England Biolabs). La amplificación se realizó con 30 ciclos de 94 ºC 1 min, 60 ºC 1 min, 74 ºC 1 min 30 seg. Con los productos de ambas PCRs hicimos una PCR de ensamblaje (Figura 15). Este tipo de PCR no utiliza oligonucleótidos como cebadores de la polimerasa, sino las regiones de homología entre los dos fragmentos presentes en la mezcla de reacción y que sirven de cebadores para la polimerización de DNA. Esta reacción de PCR (25 ciclos de 94 ºC 1 min, 55 ºC 2 min, 72 ºC 2 min) se realizó en 25 µl que contenían un tampón Taq de alta fidelidad (10 mM Tris-HCl pH 8,3; 50 mM KCl; 0,001% gelatina; 4 mM MgCl2; 1

mM de cada dNTP), 30 ng de cada fragmento de DNA y 5 unidades de Taq polimerasa (Roche). Finalmente, realizamos una PCR para amplificar el producto de fusión de la PCR anterior (Figura 15), usando 1 µl de este producto como molde de DNA en 50 µl (20 mM Tris-HCl pH 8,8; 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton X-100, 1 mM de cada dNTP

y 1 unidad de Vent DNA polimerasa) conteniendo 0,5 µM de mezcla de oligonucleótidos SfiFH-Back y NotFH-For, que introducen las dianas SfiI y NotI

en los extremos, lo que nos permitirá clonar las moléculas de N-FimH mutadas en el vector de phage display.

FIGURA 15. Estrategia general para la construcción de genotecas en phage display mediante

mutagénesis dirigida del dominio N-FimH. Los oligonucleótidos degenerados se representan con flechas en zig-zag y los que introducen dianas en los extremos con flechas partidas. El dominio N-FimH se representa en azul, con rectángulos del mismo color en las regiones donde se iban a introducir mutaciones, y líneas en zig-zag una vez introducidas. Se recuadra en naranja la región de hibridación de los productos de PCR.

En aquellas genotecas en las que no se introdujeron mutaciones en la región central de N-FimH, no hizo falta realizar una PCR de ensamblaje, sino que se realizó una única PCR inicial (Tabla 4) usando un oligonucleótido degenerado para la introducción de las mutaciones junto con uno de los oligonucleótidos que introducen SfiI o NotI en los extremos. El producto de esta reacción fue amplificado en una reacción de PCR con los oligonucleótidos SfiFH-Back y NotFH-For como en la estrategia general.

En la Tabla 4 se muestran los oligonucleótidos empleados en las reacciones de PCR iniciales (PCR-1, PCR-2 o PCR única) en la construcción de genotecas de N-FimH en phage display. En la Tabla 5 se muestran las secuencias de los oligonucleótidos empleados en la construcción de estas genotecas.

Tabla 4. Oligonucleótidos empleados en reacciones de PCR para la

construcción de genotecas de N-FimH en phage display.

Genoteca PCRs iniciales Oligonucleótidos empleados Genoteca α PCR-1

PCR-2 FH1-Back y FH1-For FH2-Back y FH2-For Genoteca A PCR única SfiFH-Back y FH2-For

Genoteca B PCR única SfiFH-Back y FH2-For-QN

Genoteca C PCR-1

PCR-2 SfiFH-Back y FH1-For FH2-Back y NotFH-For

Genoteca D PCR-1 PCR-2 SfiFH-Back y FH1-For FH2-Back y FH2-For Genoteca E PCR-1 PCR-2 SfiFH-Back y FH1-For FH2-Back y FH2-For-QN Genoteca F PCR única FH1-Back y NotFH-For Genoteca G PCR única FH1-Back y FH2-For Genoteca H PCR única FH1-Back y FH2-For-QN Genoteca I PCR-1

PCR-2 FH1-Back y FH1-For FH2-Back y NotFH-For Genoteca J PCR única FH1-Back y FH2-For-QN Genoteca K PCR-1 PCR-2 FH1-Back y FH1-For FH2-Back-ext y NotFH-For Genoteca L PCR-1 PCR-2 FH1-Back y FH1-For FH2-Back-red y NotFH-For Genoteca M PCR única FH1-Back y FH2-For-ext Genoteca N PCR única FH1-Back y FH2-For-red

Genoteca Ñ PCR-1 PCR-2 FH1-Back y FH1-For FH2-Back-ext y FH2-For-red Genoteca O PCR-1 PCR-2 FH1-Back y FH1-For FH2-Back-red y FH2-For-ext Genoteca P PCR-1 PCR-2 FH1-Back y FH1-For FH2-Back-ext y FH2-For-ext Genoteca Q PCR-1 PCR-2 FH1-Back y FH1-For FH2-Back-red y FH2-For-red

Tabla 5. Secuencia de los oligonucleótidos utilizados para la construcción de

genotecas en phage display.

Oligonucleótido Secuencia FH1-Back 5´-TTACCGCTATCCCTATTNNBNNBNNBTCCCCGGGTGGCA GCGCCAATGTTTATG-3´ FH1-For 5´-GATGGCAAAAGATTTGCGTCGAAAGATCCACGACCAGGT TTTGCCCCAC-3´ FH2-Back 5´-TGACGCAAATCTTTTGCCATAACNNBNNBCCGNNBNNBA TTACAGCCTATGTCACACTGCAAC-3´ FH2-Back-EXT 5´-CACGCAAATCTTTTGCCATAACGATTATCCGNNBNNBNN BNNBACAGCCTATGTCACACTGCAAC-3´ FH2-Back-RED 5´-TTCGACGCAAATCTTTTGCCATAACGATTATCCGNNBNNB ATTACAGCCTATGTCACACTGCAAC-3´ FH2-For 5´-ATCCACACAAACTGGAAATCVNNVNNVNNVNNVNNAGCG GTGTTTCGCAAAATAAGCACG-3´ FH2-For-EXT 5´-ACCACACAAACTGGAAATCATCGCTGTTATAVNNVNNVNN GTTGGTCTGTCGCAAAATAAGCACG-3´ FH2-For-QN 5´-TTTCACACAAACTGGAAATCVNNVNNVNNVNNVNNGTTGG TCTGTCGCAAAATAAGCACG-3´ FH2-For-RED 5´-TATCCACACAAACTGGAAATCATCGCTVNNVNNVNNGTTG GTCTGTCGCAAAATAAGCACG-3´ NotFH-For 5´-GAGTCATTCTGCGGCCGCAGGCACCACCACATCATTATT GGCGTAAATATTCCACACAAACTGG-3´

SfiFH-Back 5´-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTTCGC CTGTAAAACCGCCAATGGTACCGCTATCCCT-3´

Nota: N=cantidades equimolares de A,T,G,C; B=cantidades equimolares de C,G,T; V=cantidades equimolares de A,C,G.

Tras su amplificación, los fragmentos de DNA de 0,5 Kb que codificaban N- FimH se digirieron con las enzimas SfiI y NotI, se purificaron de un gel de agarosa y se ligaron en los mismos sitios del vector pXylE5EGln.