4. Búsqueda de mutaciones que modifican un fenotipo de toxicidad a las
4.1. Identificación de mutaciones que interaccionan dominantemente con
dominantemente con la expresión de RNAs (CUG)
480en el ojo
de Drosophila
Generamos cromosomas recombinantes que contuvieran las dos inserciones, UAS- (CTG)480 y sevenless-GAL4 en el cromosoma 3. Las 3 líneas recombinantes que
escogimos eran sensibles a la temperatura, por lo que a 29 ºC presentaban un fenotipo de ojo muy rugoso. En condiciones experimentales normales la temperatura de cultivo fue de 25 ºC.
En primer lugar nos planteamos realizar un rastreo piloto para comprobar si el fenotipo de ojo rugoso era modificable. Para este rastreo empleamos una colección de deleciones que cubría aproximadamente el 55 % del genoma de Drosophila (colección de deleciones de Bloomington Drosophila Research Center). Esta colección estaba constituida por un total de 80 deleciones del cromosoma 2 y 86 del cromosoma 3. Identificamos 26 deleciones que modificaban visiblemente el fenotipo pero sólo actuaban como modificadores fuertes 6 potenciando y 3 suprimiendo (Tabla 4.1).
Resultados
Deficiencia Modificador Localización Genes candidatos
citogenética
Df (2L) 23C;23E3-6 Potencia dor 23C;23E3-6 glaikit
Df (2L) BSC5, w/ SM6a Potencia dor 26B01-02; 26D01-02 chickadea, slowmo, Ddr,
Pez, pickpocket7, Tiggrin
Df(2R) PC4/ CyO Potencia dor 55A; 55F scribbler, GstE1-10
Df(3L) M21, kni p/ ln T33 f19 Potencia dor 62F; 63D karst
Df(3L) AC1, roe p /TM3, Sb Potencia dor 67A2; 67D7-13 lamininB2
Df(3L) st-f13, Ki roe p/TM6B, Tb Potenciador 72C1-D1; 73A3-4
Df(2L)J-H/SM5 Supresor 27C2-9; 28B3-4 nop5, X16
In (2R) bw Cy/ ln Gla, Gla Supresor 41A-B; 42A2-3 Tpnc4, dream Df(3L) rdgC-co2, th st in kni p/ Supresor 77A1; 77D1 rdgC, presenilin
TM6C, cu Sb Tb ca
Tabla 4.1. Regiones del cromosoma 2 y 3 que interaccionaron genéticamente con sev-GAL4> UAS-(CTG)480. En la primera columna se muestra el nombre de la deficiencia. En la segunda columna se
muestra para cada línea en qué sentido se modifica el fenotipo. La columna Localización citogenética indica la región delecionada para cada línea. En la última columna se muestran algunos de los genes incluidos en las deleciones que interaccionaron que nos parecieron interesantes por diferentes motivos: en rojo los que codifican para componentes estructurales del citoesqueleto o están asociados a ellos, en
verde los factores de transcripción, en azul los implicados en adhesión celular y en naranja los
relacionados en la contracción muscular.
Estas interacciones no fueron analizadas en más profundidad porque el objetivo de este rastreo era comprobar que el fenotipo de sev-GAL4 UAS-(CTG)480 era
modificable para realizar un rastreo a gran escala con inserciones letales de elementos P.
Realizamos un rastreo genético cruzando hembras sev-GAL4 UAS-(CTG)480
con líneas que contenían un elemento P insertado en los cromosomas 2 (498 líneas) o 3 (174 líneas) (Figura 4.2).
Resultados
sev-GAL4>UAS-(CTG)480 X Colección de inserciones letales de
elementos P
Control:
Figura 4.2. Esquema del rastreo realizado para buscar mutaciones que modifiquen el fenotipo de ojo rugoso por expresión de RNAs CUG. La línea recombinante sev-GAL4>UAS-(CTG)480 expresa el transgén UAS-(CTG)480 por la unión del factor de transcripción GAL4 a las secuencias UAS. Su expresión se dirige al ojo determinado por la línea sev-GAL4. Esta línea recombinante se cruzó con la colección de inserciones de elementos P. Cada línea tiene insertado un elemento P en el genoma que interrumpe la función de un determinado gen según la línea utilizada. En la descendencia el fenotipo ojo rugoso debido a la expresión de (CTG)480 puede verse modificado por la reducción en la dosis génica de X (expresión
reducida a aproximadamente el 50% del normal). Este fenotipo se compara con el fenotipo ojo rugoso producido por la expresión (CTG)480 per se, con el gen X silvestre.
En la descendencia de los cruces comprobamos si estas inserciones P letales eran capaces de modificar de forma dominante el fenotipo de ojo rugoso. Así identificamos 13 líneas que interaccionaron; 3 intensificaban el fenotipo y 10 lo suprimían. Además estudiamos una serie de genes candidatos que revelaron 2 potenciadores más, Aly y seven-up. Los genes afectados por estas mutaciones pudimos agruparlos en 5 procesos celulares aunque en algunos casos no pudimos
gen endógeno X P + + + + GAL4 sev (CTG)480 UAS gen endógeno X UAS GAL4 sev (CTG)480 gen endógeno X P UAS GAL4 sev (CTG)480 + + gen endógeno X + +
Resultados
asignar la mutación a un gen o la proteína codificada es de función desconocida. (Tabla 4.2)
Línea P Modificador Gen Función
Factores de transcripción reguladores
l(3)j5E7 Supresor cap-n-collar Factor de transcripción de tipo cremallera de leucina básico. Las larvas mutantes cnc no tienen
estructuras labrales
svp1 Potenciador seven up Pertenece a la superfamilia del receptor nuclear de la hormona esteroide, requerida para la identidad de los subtipos R3/4 y R1/6
Reguladores de la estructura de la cromatina
l(2)k16102 Supresor Nurf-38 Factor remodelador de la cromatina
l(3)j8B6 Supresor jumeaux
Un supresor de la variegación por efecto
de posición con dominios forkhead/winged. Implicado en el desarrollo del ojo y las quetas
jumuL70 Supresor jumeaux
Adhesión celular
l(3)j8E8 Supresor fear-of-intimacy Proteína con dominio transmembrana de la familia
FICL que controla la migración de las células gliales
l(2)k08011 Supresor coro Proteína de unión a actina posiblemente implicada en la organización y biogénesis del citoesqueleto
l(2)k00236 Potenciador viking Cadena 2α del colágeno de tipo IV (componente de membranas basales)
Apoptosis
l(2)k09905 Supresor spinster Proteína transmembrana expresada en la glía. Los mutantes muestran un exceso de supervivencia neuronal
thread4 Potenciador thread Proteína Ubiquitin ligasa, inhibe la activación de las caspasas
l(3)j1D8 Supresor Csk Regulador de la proliferación celular y apoptosis
Complejo EJC
l(2)k09907 Potenciador Dek Asociado al complejo de unión de exones (EJC)
Aly02267 Potenciador Aly Proteína asociada a EJC que participa en la exportación de transcritos
Miscelánea
l(2)k10502 Potenciador CG4589 Elemento P insertado en CG4589, dominio de unión a calcio
l(2)k00808 Supresor mAcR-60C o Probablemente muta los genes mAcR-60Cl o Plkk1
Plkk1
Resultados
Tabla 4.2. Modificadores genéticos del fenotipo ojo rugoso provocado por sev-GAL4 UAS- (CTG)480. Se utilizó una colección de líneas letales por inserción del elemento P y varios alelos mutantes
de genes candidatos. Se identificaron 13 modificadores como potenciadores o supresores que modificaban el fenotipo ojo rugoso. La columna de Función se ha tomado de los informes de cada gen disponibles en la bibliografía. Los genes se agruparon por clases funcionales.