4. Búsqueda de mutaciones que modifican un fenotipo de toxicidad a las
4.2. Análisis de los genes que presentan interacción genética dominante
4.2.5. Metabolismo del RNA: componentes asociados al EJC
El alelo Dekk09907 se identificó como potenciador del fenotipo de ojo rugoso producido
por sev-GAL4 UAS-(CTG)480. Utilizamos un alelo de sobreexpresión de Dek, DekEP1132
(Figura 4.18) y no fue capaz de modificar el fenotipo.
P{EP}Dek[EP1132] P{lacW}Dek[k09907]
Figura 4.18. Región genómica de Dek y las inserciones de los elementos transponibles ensayados. Se muestra la posición de las dos inserciones utilizadas (triángulo azul), así como los cuatro
transcritos derivados de Dek. Las regiones codificantes se muestran en naranja y el intrón se representa con una línea horizontal. Imagen obtenida en la base de datos de Drosophila (http://www.flybase.org).
Dek inicialmente se relacionó con el grupo de proteínas que forman el corazón del EJC (Exon Junction Complex) pero actualmente se considera como un componente asociado de este complejo (Reichert et al., 2002).
El EJC es un complejo macromolecular que se deposita a unos 25 nucleótidos aguas arriba del sitio de unión entre exones una vez se ha eliminado el intrón. Consiste en cuatro proteínas nucleares eIF4AIII, Y14, Mago y Barentsz (Stroupe et al.,
Resultados
2006) junto con toda una serie de proteínas asociadas transitoriamente con el complejo y que regulan funciones específicas del mismo tales como el procesado alternativo, la exportación de mRNAs, la localización citoplasmática, la traducción y la degradación de mensajeros erróneos por la vía Non-sense Mediated Decay (NMD). En estos últimos años ha habido diferentes propuestas sobre qué proteínas son genuinamente del EJC y cuales participan en cada uno de los procesos del metabolismo del RNA (Figura 4.19).
Figura 4.19. Representación esquemática de un modelo del ensamblaje y función del complejo de unión exón-exón (EJC) en Drosophila. Se depositan los componentes del
EJC aguas arriba de la unión exón-exón del mRNA. Los componentes son Mago/Y14, RNPS1, DEK, Aly/REF, SRm160, TAP/p15 y Upf3. En el nucleoplasma este complejo permite el secuestro de Upf3 y el heterodímero receptor de exportación TAP/p15. Después de la translocación a través de los complejos del poro nuclear (NPC), varios componentes del mRNP exportado se disocian y se reutilizan en el núcleo. Y14, Mago y Upf3 permanecen unidos al mRNA. Los mRNAs que contienen un codón de parada prematuro (PTC) son degradados por el mecanismo non-sense-
mediated mRNA decay. Imagen tomada de
Palacios, 2002.
En trabajos independientes se identificó una mutación de Aly, Aly02267, como un
supresor del fenotipo ojo rugoso producido por la expresión de mblC en el ojo bajo el control de sev-GAL4 (Pascual, 2005). El producto de este gen participa en la ruta del metabolismo del RNA en concreto en el transporte de transcritos (Kataoka y Dreyfuss, 2004).
Decidimos ensayar en las moscas modelo la mutación l(3)02267 del gen Aly porque participa en el mismo proceso celular que Dek. Como Aly suprimía el fenotipo producido por la expresión de mblC, en nuestro ensayo esperábamos que al expresar las expansiones y por tanto se secuestrara Mbl Aly potenciara el fenotipo. Para este ensayo cruzamos el recombinante sev-GAL4 UAS-(CTG)480 con el alelo mutante
Resultados
Aly02267, el único alelo de Aly existente, y detectamos en la descendencia que la
reducción de la función de Aly, en efecto, potenciaba el fenotipo de ojo rugoso (Figura 4.20).
Figura 4.20. Aly02267 potencia el fenotipo ojo rugoso producido por sev- GAL4 UAS-(CTG)480. Se muestran ojos
visualizados por microscopía electrónica de barrido. (A) Moscas control con el genotipo sev-GAL4 UAS-(CTG)480/ + y (B) moscas
sev-GAL4 UAS-(CTG)480/ Aly02267.
A
B
Empleamos dos alelos de genes codificantes para componentes del EJC, mago y tsunagi (Y14) y así comprobar si también eran capaces de modificar el fenotipo de toxicidad a CUGs. Disponíamos de los únicos alelos de mago y tsunagi, magoKG03119 y
tsunagiEP567 y observamos que el fenotipo de ojo rugoso no era modificado por estos
mutantes. Estas dos proteínas interaccionan entre sí porque forman heterodímeros para el procesado y la exportación del mRNA de oskar (Hachet y Ephrussi, 2004). El hecho de que ninguno de los dos alelos modificara el fenotipo sugiere que los componentes que forman el corazón del EJC no estaban relacionados con el fenotipo de expresión de las CTG en el ojo.
Nos planteamos averiguar si en este fenotipo de ojo rugoso estaba implicada la proteína Aly que se asocia a la exportación de transcritos (Kataoka y Dreyfuss, 2004). Como la reducción de la función de Aly suprimía el fenotipo de la sobreexpresión de MblC y potenciaba el fenotipo de la expresión de CUGs, cabía la posibilidad de que esta interacción fuera a través de Muscleblind mismo. Nos planteamos comprobar si la interacción entre Muscleblind y Aly era física empleando el sistema del doble híbrido en levadura.
Comprobación de la interacción física entre Aly y Muscleblind
El estudio de la interacción entre Muscleblind y Aly se realizó por cotransformación en levaduras de dos vectores que contenían el cDNA de Muscleblind y de Aly. Las
Resultados
colonias se crecieron en medio selectivo de tal modo que sólo se detectaría crecimiento si existía interacción entre ambas proteínas.
En el vector que contiene el dominio de activación GAL4 clonamos en fase los cDNAs de MblA, MblB, MblC y MblD. Disponíamos del DNA que codifica la zona común a las cuatro variantes proteicas Mbl y los dedos de zinc (material proporcionado por Marta Vicente). Por otra parte clonamos en fase el cDNA de Aly en el vector que contiene el dominio de unión GAL4.
Sólo disponíamos de controles negativos, los cuales fueron dos tipos de vectores vacíos y el cDNA de Iron Regulatory Protein 1 (IRP1) en el vector que contiene el dominio de activación GAL4. No se conocía ninguna proteína que interaccione con Muscleblind de ahí la ausencia de controles positivos.
Tras la cotransformación de Aly como cebo con las presas descritas no obtuvimos interacción (Figura 4.21). Esto sugiere que Aly y las distintas variantes de Muscleblind no interaccionan físicamente en estas condiciones experimentales. No obstante, cabe la posibilidad de que la interacción sea dependiente de RNA porque Aly es una proteína con dominios de unión a RNA del tipo RRM (RNA Recognition Motif) y Muscleblind tiene motivos de dedos de zinc permitiendo su unión a ácidos nucleicos.
pACT2(presa)
pACT2 MblA MblB MblC MblD Mbl ZC Mbl DZ IRP1 Vacío (control -) (control -)
pGBKT7(cebo)
pGBKT7 - - - - - - - - Vacío (contol -)
Aly - - - - - - - -
Figura 4.21. Aly y las diferentes construcciones de Muscleblind ensayadas en el sistema del doble híbrido en levadura. Se ensayaron las cuatro isoformas MblA-D, la zona común (MblZC) de las
cuatro proteínas y los dedos de zinc (MblDZ) con la proteína Aly. Como controles negativos los vectores vacíos y la proteína Iron Regulatory Protein 1 (IRP1). El signo – indica que no creció ninguna colonia en medio selectivo.
Resultados