4.2.3.2.1.- Fijación de muestras
Las muestras de tejido para inmunohistoquímica fueron recolectadas después de haber tomado las muestras para biología molecular. Los tejidos tubulares para MO fueron abiertos longitudinalmente y cortados en trozos pequeños e introducidos en PBS con 4% formaldehído, se mantuvieron a RT t oda la noche, después fueron colocadas en PBS a 4qC hasta su posterior procesamiento.
4.2.3.2.2.- Inclusión de tejidos en bloques de paraplast
La inclusión de los tejidos se realizó de manera automática en un histoquinete, los tejidos fueron deshidratados gradualmente con etanol desde un 50% hasta llegar al 100%, el medio de aclaramiento de los tejidos se llevó a cabo en tolueno, finalmente la inclusión se hizo en paraplast plus (Sigma). Los tejidos fueron montados en moldes para formar los bloques, una vez secos los bloques fueron cortados (5 Pm) en micrótomo de rotación y montados en portaobjetos de cristal tratados con una solución de poly-L-lisina.
4.2.3.2.3.- Inmunohistoquímica en portaobjetos
Los portaobjetos que contenían los cortes fueron desparafinados en xilol y rehidratados en soluciones decrecientes de alcoholes. Para el bloqueo de la peroxidasa endógena, los portaobjetos fueron embebidos en una solución de PBS y 1% de peróxido de hidrógeno (H2O2) durante 30 minutos, después de 3 lavados con PBS, los
portaobjetos fueron incubados con los anticuerpos primarios (anticuerpos primarios y secundarios diluidos en PBS y 1 % de BSA). La incubación se realizó en cámara húmeda a RT durante 1 hora. Después se lavaron tres veces con PBS y se procedió a la in cubación con anticuerpos secundarios HRP con las mismas condiciones de la incubación primaria. Después de tres lavados con PBS se procedió al revelado utilizando como sustrato 3,3’diaminobencidina (DAB) que al oxidarse por la hidrólisis del agua oxigenada añadida al tampón forma
un producto marrón insoluble. El contraste se realizó con hematoxilina y se montaron con un medio de montaje anhidro (DPX) para su posterior visualización. La visualización fue realizada en microscopio óptico con cámara digital acoplada y las imágenes extraídas con el software de imagen. Los controles utilizados para esta técnica fueron la incubación de portaobjetos en medio de incubación sin anticuerpo primario y posteriormente la incubación con el anticuerpo secundario.
4.2.3.3.- Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM)
4.2.3.3.1.- Fijación
La fijación de las muestras para la realización de técnicas inmunocitoquímicas a nivel ultraestructural usando el TEM se realizó 0,5% de glutaraldehído diluido en PBS durante 2 horas a 4qC y se lavaron en PBS, posteriormente se mantuvieron a 4qC en PBS hasta su posterior procesamiento.
Adicionalmente se colectaron muestras para realizar un estudio de TEM convencional para un análisis morfológico. Para ello, las muestras fueron fijadas en PBS y 2,5% glutaraldehído por 2 horas a 4qC, después fueron postfijados con 1% de tetraóxido de osmio en tampón PBS durante 1 hora a RT.
4.2.3.3.2.- Inclusión de tejidos en LR-White
Los tejidos fijados para TEM fueron incluidos en LR -White que es una resina que una vez polarizada es hidrófila, por lo tanto, los reactivos de inmunocitoquímica penetran fácilmente en los tejidos incluidos. Los tejidos fueron deshidratados en soluciones graduales de etanol (50 - 70%) y embebidos en LR-White en condiciones de oscuridad y agitación. Las muestras fueron montadas en capsulas que contenían LR-White y polimerizadas a 50qC en estufa durante 24 horas. Los cortes ultrafinos (50 nm) fueron realizados en un ultramicrótomo (REICHERT) y montados en rejillas de níquel recubiertas con Formvar.
4.2.3.3.3.- Inmunocitoquímica en rejillas
Esta técnica fue realizada mediante la incubación de las rejillas en gotas por flotación. Que consiste en la colocación de gotas de incubación (15-20 µl) y lavados sobre un parafilm sobre superficie plana y la colocación de las rejillas sobre dichas gotas. El primer paso fueron 2 lavados en PBS seguido del bloqueo de uniones inespecíficas mediante la incubación en PBS y 1% de BSA durante 1 hora. Posteriormente se realizó la incubación con los anticuerpos primarios diluidos en PBS y 1% de BSA durante 1 hora. Se hicieron tres lavados con PBS antes de la incubación con los anticuerpos secundarios (ver tabla de materiales), dicha incubación también fue de 1 hora, al terminar la incubación, se lavaron nuevamente y se procedió a la incubación de 1 hora con proteína A conjugada con partículas de oro de 15 nm de diámetro. Tras los lavados con PBS, las rejillas se lavaron con agua bidestilada y se dejaron secar en papel filtro.
Previa a su visualización al TEM, las rejillas fueron contrastadas mediante la incubación de 7 min de las rejillas en una solución de 2% de acetato de uranilo, tras el lavado con agua bidestilada corriente y secado en papel filtro, las rejillas fueron incubadas por 1 minuto en citrato de plomo. Posteriormente, las rejillas fueron lavadas con agua bidestilada y secadas en papel filtro antes de ser observadas en el microscopio electrónico PHILIPS TECNAI 12.
4.2.3.4.- Inmunoprecipitación de proteínas
La inmunoprecipitación de proteínas en e ste estudio se realizó con la finalidad de precipitar proteínas minoritarias a partir de mezclas complejas como el FOB. La técnica que elegimos fue el uso de perlas magnéticas recubiertas de proteína G separosa, la cual tiene alta afinidad para anticuerpos monoclonales o policlonales. Los anticuerpos inmovilizados en las esferas magnéticas capturan por afinidad a las proteínas diana contenidas en el FOB (inmunoprecipitación). El protocolo de nuestra elección fue el llamado “Crosslink“, este protocolo se caracteriza por mantener la unión covalente del anticuerpo a la
perlas magnéticas después del eluido, permitiendo con ello sólo la elución de las proteínas inmunoprecipitadas (Fig. 36).
Para la realización de esta técnica se eligieron las perlas de proteína G separosa y el kit de tampones para el protocolo crosslink (GE Healthcare), así como un rack magnético, que inmoviliza las perlas y permite la colección de las soluciones utilizadas en este protocolo. La técnica de inmunoprecipitación se inicia con la dilución de los anticuerpos (5 µl) en 495 µl de solución de unión TBS (50 mM Tris 150 mM NaCl pH 7,5 y 2M de urea). Las perlas magnéticas contenidas en un medio de conservación, son lavadas con el medio de unión TBS que a su vez equilibra el pH, los viales que contienen las perlas son colocados en el rack magnético, para eliminar el medio de lavado, inmediatamente después se coloca el medio de unión que contiene el anticuerpo, se incuba 1 hora a RT en agitación suave. El sobrenadante es eliminado y se procede al lavado.
Figura 36 Representación esquemática del protocolo de inmunoprecipitación. Modificado del manual de instrucciones 28-9537-63 AA GE Healthcare.
Para el crosslink del anticuerpo, las perlas son lavadas con la solución crosslink A (200 mM trietanolamina, pH 8,9) del kit de tampones. Posteriormente, las perlas son incubadas con la misma
solución adicionada con dimetil-pipelimidato (DMP) a una
concentración final de 50 mM y se incubaron 1 hora a RT en agitación suave. Se retiró el medio y para realizar el bloqueo que evita las posteriores uniones inespecíficas, las perlas fueron incubadas con la solución de crooslink B (100 mM etanolamina, pH 8,9) 15 min a RT. Se retiró el medio y se añadió el medio de eluido (0.1 M Glycine-HCl, 2 M urea, pH 2,9) para retirar el anticuerpo no acoplado. Se lavaron las perlas con solución de unión (x2).
Aproximadamente 500 µg de proteína total contenido en el FOB (aproximadamente 12,5 µl de fluido) fue diluido en solución de unión (475,5 µl). Las perlas son incubadas con el FOB diluido a 4ºC en agitación suave durante toda la noche. La porción no unida es recolectada y congelada (en principio no es r elevante puesto que no es lo que vas a estudiar, luego vemos si lo quitamos). Las perlas son incubadas con el FOB diluido a 4ºC en agitación suave durante toda la noche, la porción no unida es recolectada y congelada. Las perlas fueron lavadas con solución de unión (x3), posteriormente fueron incubadas en solución de eluido (50 µl) sin urea, se incubaron durante 2 minutos y se colectaron en el medio de elución, adicionado con un medio de amortiguación (1M tris-HCl pH 9.0) para ajustar el pH a 7.
También se realizaron algunas pruebas con el protocolo clásico de inmunoprecipitación que consiste básicamente en el mismo protocolo de crosslink omitiendo los pasos de fijación del anticuerpo, con este protocolo eluímos a la vez el anticuerpo acoplado a las perlas magnéticas y las proteínas inmunoprecipitadas. La proteína inmunoprecipitada de ambos protocolos fue congelada a -80ºC hasta su posterior uso.