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Análisis transcriptómico y proteómico del oviducto y útero bovino en la fase periovulatoria

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Academic year: 2017

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(1)

D. Omar Salvador Acuña Meléndez

FACULTAD DE VETERINARIA

(2)

 

 

 

 

UNIVERSIDAD DE MURCIA

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Omar Salvador Acuña Meléndez

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1  RESUMEN  _____________________________________________________________   1  

1.1.-  RESUMEN   ________________________________________________________   3  

1.2.-  SUMMARY   ________________________________________________________   9  

2  REVISIÓN  BIBLIOGRÁFICA  ______________________________________________   17  

2.1.-  TRACTO  GENITAL  FEMENINO  _______________________________________   18  

2.1.1.-  El  ciclo  estral  bovino   _________________________________________   18  

2.1.2.-  Generalidades  del  tracto  genital  de  la  vaca  ________________________   21  

2.1.2.1.-  Útero  ________________________________________________   22  

2.1.2.1.1.-  Anatomía  __________________________________________   22  

2.1.2.1.2.-  Histología   _________________________________________   23  

2.1.2.1.3.-  Transcriptoma  ______________________________________   24  

2.1.2.1.4.-  Proteoma   _________________________________________   27  

2.1.2.2.-  Oviducto   _____________________________________________   28  

2.1.2.2.1.-  Anatomía  __________________________________________   28  

2.1.2.2.2.-  Histología  del  oviducto  _______________________________   30  

2.1.2.2.3.-  Transcriptoma  ______________________________________   34  

2.1.2.2.4.-  Fluido  oviductal  _____________________________________   37  

2.1.2.3  Efecto  del  tracto  genital  femenino  en  el  espermatozoide   _________   39  

2.1.2.3.1.-  Transporte  espermático   ______________________________   39  

2.1.2.3.2.-  Reservorio  espermático   ______________________________   43  

2.1.2.3.3.-  Capacitación  espermática  _____________________________   46  

2.1.2.3.3.1.-  óá

  __________________________________________   47  

2.1.2.3.3.2.-  óí   ________________________   49  

2.1.2.3.3.3.-  á   ___   50  

2.2.-  ESPERMATOZOIDE  ________________________________________________   51  

2.2.1.-  Espermatogénesis  ___________________________________________   51  

2.2.2.-  Morfología  y  Estructura  _______________________________________   53  

2.2.2.1.-  Cabeza   ______________________________________________   55  

2.2.2.1.1.-  Acrosoma  _________________________________________   56  

(37)

2.2.2.3.-  Cola  o  flagelo  __________________________________________   60  

2.2.3.-  Maduración  espermática  ______________________________________   62  

2.2.3.1.-  Fluido  epididimario   _____________________________________   64  

2.2.3.2.-  Epididimosomas   _______________________________________   67  

2.2.3.3.-  Reacción  acrosómica   ___________________________________   68  

2.3.-  MOLÉCULA  DE  ADHESIÓN  DEL  ESPERMATOZOIDE  1  (SPAM1)   ___________   72  

2.3.1.-  Estructura  de  la  proteína  SPAM1   _______________________________   73  

2.3.2.-  Localización  de  SPAM1  en  el  espermatozoide  _____________________   74  

2.3.3.-  Expresión  de  SPAM1  en  testículo  y  epidídimo   _____________________   75  

2.3.4.-  Funciones  reproductivas  de  SPAM1  _____________________________   78  

2.3.4.1.-  Actividad  hialuronidasa  de  SPAM1  _________________________   78  

2.3.4.2.-  Capacidad  de  unión  a  ZP  de  SPAM1   _______________________   79  

2.3.4.3.-  Actividad  de  señalización  celular  de  SPAM1  __________________   81  

3  OBJETIVOS  ___________________________________________________________   85  

3.1.-  Objetivo  general:   _____________________________________________   87  

3.2.-  Objetivos  específicos:  __________________________________________   87  

4  MATERIALES  Y  MÉTODOS  ______________________________________________   89  

4.1.-  MATERIALES  _____________________________________________________   91  

4.1.1.-  Anticuerpos  ________________________________________________   91  

4.1.2.-  Hormonas   _________________________________________________   91  

4.1.3.-  Reactivos  y  Kits  _____________________________________________   92  

4.1.4.-  Tampones  y  soluciones  _______________________________________   96  

4.1.5.-  Varios   ____________________________________________________   97  

4.1.6.-  Equipos  ___________________________________________________   98  

4.2.-  MÉTODOS   ______________________________________________________   100  

4.2.1.-  Animales  _________________________________________________   100  

4.2.1.1.-  Novillas   _____________________________________________   100  

4.2.1.2.-  Sincronización  del  ciclo  estral  de  novillas  ___________________   101  

4.2.2.-  Obtención  de  material  biológico   _______________________________   102  

4.2.2.1.-  Suero  y  plasma  sanguíneo  bovino   ________________________   102  

4.2.2.2.-  Fluido  oviductal  bovino  (FOB)  ____________________________   102  

(38)

4.2.2.3.1  Extracción  de  proteínas  de  exosomas  de  fluido  oviductal   ____   104  

4.2.3.4.-  Extracción  de  proteínas  de  espermatozoides  bovinos   _________   104  

4.2.3.5.-  Extracción  de  proteínas  de  células  epiteliales  del  oviducto  bovino   105  

4.2.3.6.-  Determinación  de  la  concentración  de  proteínas   _____________   105  

4.2.2.7.-  Muestras  de  tejido  para  biología  molecular  __________________   105  

4.2.2.7.1  Muestras  de  oviducto  y  endometrio  bovino  ________________   106  

4.2.2.8.-  Obtención  de  ovocitos  bovinos  ováricos  ____________________   107  

4.2.3.-  Análisis  proteico   ___________________________________________   107  

4.2.3.1.-  Producción  de  anticuerpos   ______________________________   108  

4.2.3.1.1.-  Cultivo  de  hibridomas  para  la  obtención  de  anticuerpo  SPAM1   bovino   ___________________________________________________   108  

4.2.3.2.-  Inmunohistoquímica  para  microscopia  óptica  (MO)   ___________   109  

4.2.3.2.1.-  Fijación  de  muestras  ________________________________   109  

4.2.3.2.2.-  Inclusión  de  tejidos  en  bloques  de  paraplast   _____________   109  

4.2.3.2.3.-  Inmunohistoquímica  en  portaobjetos   ___________________   109  

4.2.3.3.-  Microscopia  Electrónica  de  Transmisión  (TEM)   ______________   110  

4.2.3.3.1.-  Fijación  __________________________________________   110  

4.2.3.3.2.-  Inclusión  de  tejidos  en  LR-White  _______________________   110  

4.2.3.3.3.-  Inmunocitoquímica  en  rejillas  _________________________   111  

4.2.3.4.-  Inmunoprecipitación  de  proteínas  _________________________   111  

4.2.3.6.-  Determinación  de  la  unión  de  SPAM1  oviductal  a  ZP  de  ovocitos   bovinos   ____________________________________________________   114  

4.2.3.7.-  Análisis  por  electroforesis  _______________________________   114  

4.2.3.7.1.-  Electroforesis   _____________________________________   114  

4.2.3.7.2.-  Western-blot  ______________________________________   115  

4.2.3.7.3.-  Inmunodetección  en  membrana  _______________________   115  

4.2.3.7.4.-  Electroforesis  bidimensional  (2D-PAGE)  y  Electroforesis  

bidimensional  diferencial  en  gel  (DiGE)  __________________________   115  

4.2.3.8-  Análisis  proteómico   ____________________________________   120  

4.2.3.8.1.-  Análisis  por  proteómica  de  fluidos  oviductales  y  uterinos  bovinos  _________________________________________________________   120  

4.2.3.8.2.-  Análisis  funcional  de  datos  de  proteómica  _______________   121  

(39)

4.2.4.1.-  Aislamiento  y  análisis  de  ARN  ____________________________   121  

4.2.4.2.-  Síntesis  de  ADN  complementario  para  PCR  _________________   123  

4.2.4.3.-  Reacción  en  cadena  de  la  polimerasa  (PCR)  ________________   123  

4.2.4.4.-  Electroforesis  en  gel  de  agarosa  __________________________   124  

4.2.4.5.-  Análisis  de  micromatrices  (Microarray)  _____________________   125  

4.2.4.5.1.-  Preparación  de  muestras  y  el  procesamiento  de  microarray   _   125  

4.2.4.5.2.-  Análisis  de  la  integridad  del  ARN  ______________________   127  

4.2.4.5.3.-  Hibridación   _______________________________________   128  

4.2.4.5.4.-  Lavado  y  escaneo  de  Microarray   ______________________   129  

4.2.4.5.5.-  Análisis  de  Microarray  _______________________________   130  

4.2.4.5.6.-  Análisis  funcional  de  datos  de  Microarray  ________________   130  

5  RESULTADOS  ________________________________________________________   131  

5.1.-  ANÁLISIS  DEL  OVIDUCTO  Y  ÚTERO  BOVINO  EN  FASE  PERIOVULATORIA  _   133  

5.1.1.-  Análisis  de  micromatrices   ____________________________________   133  

5.1.2.-  Análisis  proteómico  de  fluido  oviductal  y  uterino  en  la  especie  bovina  __   150  

5.3.1.2.-  Análisis  por  electroforesis  _______________________________   150  

5.3.1.2.1.-  Electroforesis  bidimensional  (2D-PAGE)   ________________   150  

5.1.1.2.2.-  Electroforesis  bidimensional  diferencial  en  gel  (DiGE)  ______   157  

5.1.1.2.3.-  Western-blot  ______________________________________   172  

5.2.-  SPAM1   _________________________________________________________   173  

5.2.1.-  Análisis  molecular  __________________________________________   173  

5.2.1.1-  Reacción  en  cadena  de  la  polimerasa  (PCR)  _________________   173  

5.2.2.-  Análisis  Bioquímico  _________________________________________   174  

5.2.2.1.-  Western-blot   _________________________________________   174  

5.2.2.2.-  Inmunoprecipitación   ___________________________________   175  

5.2.2.2.-  Tinción  de  coomassie   ________________________________   175  

5.2.2.2-  Western-blot  ________________________________________   176  

5.2.3.-  Análisis  proteómico  _________________________________________   176  

5.2.3.1.-  Análisis  proteómico  ____________________________________   176  

5.2.4.-  Análisis  Histoquímico  ________________________________________   178  

5.2.4.1.-  Microscopia  Óptica  (MO)  ________________________________   178  

(40)

5.2.5-  Unión  de  SPAM1  oviductal  a  la  ZP  de  ovocitos  bovino   ______________   182  

6  DISCUSIÓN  __________________________________________________________   183  

6.1.-  EXPRESIÓN  DIFERENCIAL  ENTRE  EL  OVIDUCTO  Y  EL  ENDOMETRIO  DE  LA   VACA  _______________________________________________________________   186  

6.1.1.-  Agrupamiento  de  las  sondas  detectadas  por  el  análisis  de  micromatrices   según  su  perfil  expresión  __________________________________________   188  

6.1.1.1.-  Agrupamiento  basado  en  los  perfiles  de  expresión  (SOTA1)  ____   188  

6.1.1.2.-  Agrupamiento  basado  en  los  perfiles  de  expresión  (SOTA2)  ____   189  

6.1.1.3.-  Agrupamiento  basado  en  los  perfiles  de  expresión  (SOTA3)  ____   193  

6.1.1.4.-  Agrupamiento  basado  en  los  perfiles  de  expresión  (SOTA4)  ____   197  

6.1.1.5.-  Agrupamiento  basado  en  los  perfiles  de  expresión  (SOTA5)  ____   198  

6.1.1.6.-  Agrupamiento  basado  en  los  perfiles  de  expresión  (SOTA6)  ____   198  

6.1.2.-  Expresión  diferencial  entre  la  ampolla  y  la  unión  istmo-ampular  del  oviducto.  ______________________________________________________________   199  

6.1.3.-  Clasificación  funcional  de  transcritos  identificados  que  sintetizan  a  proteínas   secretadas   _____________________________________________________   200  

6.2.-  PROTEOMA  DEL  OVIDUCTO  Y  ENDOMETRIO  EN  LA  ESPECIE  BOVINA  ____   202  

6.2.1.-  Proteoma  del  fluido  oviductal  __________________________________   205  

6.2.2.-  Proteoma  del  fluido  uterino  ___________________________________   207  

6.2.3.-  Comparativa  del  proteoma  del  oviducto  y  endometrio  en  la  especie  bovina  ______________________________________________________________   208  

6.2.4-  Aportación  del  suero  sanguíneo  a  los  fluidos  reproductivos    del  tracto  

femenino  bovino  _________________________________________________   212  

6.3.-  SPAM1  EN  LA  REPRODUCCIÓN  DE  LOS  MAMÍFEROS  __________________   212  

7  CONCLUSIONES   _____________________________________________________   217  

7.1.-  CONCLUSIONES  _________________________________________________   219  

7.2.-  CONCLUSIONS   __________________________________________________   220  

8  ANEXOS   ____________________________________________________________   223  

Anexo  I  Proteínas  identificadas  en  el  fluido  uterino  bovino  _____________   225  

Anexo  II  Listado  de  genes  agrupados  (SOTA1)   _____________________   228  

Anexo  III  Listado  de  genes  agrupados  (SOTA2)  _____________________   261  

Anexo  IV  Listado  de  genes  agrupados  (SOTA3)  _____________________   285  

(41)

Anexo  VI  Listado  de  genes  agrupados  (SOTA5)  _____________________   297  

Anexo  VII  Listado  de  genes  agrupados  (SOTA6)  ____________________   298  

Anexo  VIII  Genes  expresados  únicamente  por  el  oviducto  en  la  especie  bovina ___________________________________________________________   299  

Anexo  IX  Genes  expresados  únicamente  por  el  endometrio  en  la  especie   bovina   _____________________________________________________   300  

(42)

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(43)
(44)

Figura  1  Representación  esquemática  del  ciclo  estral  bovino.  ...  19  

Figura  2  Tracto  genital  de  la  vaca.  ...  22  

Figura  3  Cuerno  uterino  diseccionado  de  vaca  nulípara  en  fase  periovulatoria.  ...  23  

Figura  4  Vascularización  del  cuerno  uterino  de  vaca.  ...  23  

Figura  5  Microscopia  óptica  de  útero  bovino.  Corte  trasversal  del  epitelio  endometrial.  Epitelio  glandular  del   útero  bovino.  Epitelio  columnar  (E),  estroma  (e),  epitelio  glandular  (Eg).  ...  24  

Figura  6  Agrupamiento  por  perfiles  de  expresión  en  el  ciclo  estral  en  endometrio  bovino..  ...  26  

Figura  7  Representación  esquemática  del  oviducto  y  las  estructuras  adyacentes  en  la  especie  bovina.  ...  29  

Figura  8  Disección  de  oviducto  bovino.  Se  muestra  las  tres  regiones,  ampolla  (a),  unión  istmo-­‐ampular  (uia),   istmo  (i)  y  unión  útero-­‐  tubárica  (uut).  ...  30  

Figura  9  Esquema  de  la  histología  del  oviducto  de  cerda.  Secciones  transversales  del  istmo  (arriba),  la  unión   útero-­‐tubárica  (izquierda),  y  de  la  ampolla  (derecha)..  ...  31  

Figura  10  Imagen  por  TEM  y  SEM  del  oviducto  bovino.  ...  32  

Figura  11  Representación  esquemática  del  endosalpinx  en  le  especie  bovina  al  examen  microscópico.  ...  33  

Figura  12  Esquema  de  GO  de  genes  expresados  diferencialmente  en  estro  y  diestro  en  el  endometrio  bovino.  ...  34  

Figura   13   Clasificación   por   localización   de   genes   expresados   en   la   trompa   de   Falopio   normal   (GEO:   GSE10971).  ...  35  

&ŝŐƵƌĂϭϰŐƌƵƉĂĐŝſŶĨƵŶĐŝŽŶĂůĚĞůŽƐŐĞŶĞƐĐůĂƐŝĨŝĐĂĚŽƐĐŽŵŽ͞ƐĞĐƌĞƚĂĚŽƐ͟ƵƚŝůŝnjĂŶĚŽs/ĐŽŶĚĂƚŽƐĚĞ

las  trompas  de  Falopio  normales..  ...  36  

Figura  15  Diagrama  de  Venn  que  muestra  la  superposición  de  genes  expresados  oviducto  de  humano,  bovino   y  porcino.  ...  36  

Figura   16   Cambios   del   volumen   fluido   del   oviducto   de   las   vacas   durante   el   ciclo   estral.   Los   volúmenes   máximos  de  fluido  se  produjeron  inmediatamente  después  del  estro  (línea  blanca)  y  correspondían  a  bajas   concentraciones  de  progesterona,  y  un  pico  de  estradiol.  ...  38  

Figura  17  SEM  de  esperma  bovino  y  epitelio  oviductal  bovino.  ...  45  

Figura  18  Bases  moleculares  de  procesos  rápidos  y  lentos  asociados  a  la  capacitación  espermática.  ...  49  

Figura  19  Representación  de  la  hiperactivación  espermática.  ...  50  

(45)

Figura  21  Representación  esquemática  de  un  espermatozoide  típico  de  mamífero,  señalando  las  diversas   regiones  del  espermatozoide.  ...  55  

Figura  22  Características  generales  de  la  cabeza  de  espermatozoide  de  ratón  (izquierda)  y  conejo  (derecha)..  ...  56  

Figura  23  Esquema  de  las  partes  del  espermatozoide  humano  maduro  con  sus  diferentes  partes.  ...  61  

Figura  24  Proteoma  y  secretoma  de  epidídimo  de  bovino  en  SDS-­‐PAGE.  ...  66  

Figura  25  Secuencia  de  eventos  durante  la  reacción  acrosomica  del  espermatozoide  de  los  mamíferos.  ....  69  

Figura  26  Fecundación  desde  un  punto  de  vista  moderno.  ...  72  

Figura  27  Esquema  de  la  proteína  Spam1  del  ratón  en  forma  madura.  ...  73  

Figura  28  Esquema  de  la  proteína  SPAM1  bovino.  ...  74  

Figura  29  Detección  por  Western-­‐blot  de  las  dos  isoformas  de  SPAM1  en  el  fluido  epididimario.  ...  78  

Figura  30  Esquema  de  la  proteína  SPAM1  de  conejillo  de  indias  antes  y  después  de  la  RA.  ...  80  

Figura  31  Modelo  de  expresión  de  HSPA2,  SPAM1  y  ARSA  en  la  superficie  de  los  espermatozoides  humanos.  ...  82  

Figura  32  Inyección  de  hormonas  a  novillas.  Se  realizó  vía  intramuscular  en  la  región  de  la  anca...  101  

Figura  33  Extracción  de  fluido  oviductal  con  micropipeta.  ...  103  

Figura  34  Disección  de  tracto  genital  de  vaca.  (A)  Oviducto  ipsilateral  (B)  Cuerno  uterino  ipsilateral.  ...  103  

Figura  35  Imagen  del  oviducto  bovino  posterior  a  la  disección  donde  se  indican  sus  diferentes  regiones.  (a)   ampolla,  (uia)  unión  itsmo  ampular,  (i)  istmo  y  (uut)  unión  útero  tubárica.  ...  107  

Figura  36  Representación  esquemática  del  protocolo  de  inmunoprecipitación.  ...  112  

Figura  37  Representación  esquemática  del  protocolo  de  electroforesis  en  dos  dimensiones  2D-­‐PAGE.  ...  116  

Figura  38  Representación  esquemática  del  protocolo  de  electroforesis  diferencial  DiGE.  ...  118  

Figura  39  Diagrama  de  flujo  de  trabajo  para  la  preparación  de  muestras  y  su  procesamiento  para  el  análisis   de  micromatrices  (microarray).  ...  126  

Figura  40  Visualización  de  ARN  ribosonal  en  gel  de  agarosa  (1%)  incubado  en  bromuro  de  etidio.  ...  127  

Figura  41  Imagen  de  electroforesis  de  ARN,  generada  por  bionalizador  Agilent..  ...  128  

Figura  42  Cámara  de  hibridación  de  micromatrices  Agilent  a).  Ejemplo  de  carga  de  muestras  en  los  slides  b).   Burbujas  deseables  una  vez  montados  los  slides  en  la  cámara  de  hibridación  c).  ...  129  

(46)

Figura   44   Heatmap   de   correlación   de   pares   de   conjunto   de   datos   de   normalizados   de   micromatrices.   Generado  con  el  paquete  geneplotter  de  BioConductor.  ...  134  

Figura  45  Seis  agrupamientos  tipo  SOTA  basados  en  la  similitud  en  los  perfiles  de  expresión  génica  en  los   tejidos  estudiados.  ...  135  

Figura  46  Diagrama  de  Venn  de  los  genes  diferencialmente  expresados  entre  las  muestras  de  endometrio   (U_cr)  y  las  dos  regiones  del  oviducto  (O_a  y  O_u).  ...  140  

Figura  47  Diagrama  de  Venn  del  transcriptoma  de  las  muestras  de  endometrio  y  el  oviducto.  ...  141  

Figura  48  Gráfica  de  tarta  de  genes  expresados  comunes  entre  el  endometrio  y  oviducto  de  la  vaca.  ...  142  

Figura  49  Redes  de  interacción  por  evidencia  de  los  175  genes  clasificados  como  secretados  y  del  espacio   extracelular  expresados  comunes  entre  el  endometrio  y  el  oviducto  de  vaca.  ...  143  

Figura  50  Electroforesis  en  2D  de  FOB  en  fase  periovulatoria.  Resolución  de  300  µg  de  FOB  en  maxigel  con   tiras  reactiva  de  gradiente  no  lineal  de  pH  (3-­‐10),  teñido  con  azul  de  coomassie.  ...  151  

Figura  51  Electroforesis  en  2D  de  FUB  en  fase  periovulatoria.  Resolución  de  300  µg  de  FUB  en  maxigel  con   tiras  reactiva  de  gradiente  no  lineal  de  pH  (3-­‐10),  teñido  con  azul  de  coomassie.  ...  151  

Figura  52  Electroforesis  en  2D  de  FOB  en  fase  periovulatoria  marcado  con  sonda  fluorescente  Cy2.  Resolución   de  300  µg  de  FOB  en  maxigel,  con  tiras  de  gradiente  no  lineal  de  pH  (3-­‐10)..  ...  152  

Figura  53  Electroforesis  en  2D  de  FUB  en  fase  periovulatoria  marcado  con  sonda  fluorescente  Cy2.  Resolución   de  300  µg  de  FUB  en  maxigel,  con  tiras  de  gradiente  no  lineal  de  pH  (3-­‐10).  ...  153  

Figura  54  Proteínas  más  abundantes  del  fluido  oviductal  de  la  vaca.  Electroforesis  en  2D  de  FOB  en  fase   periovulatoria.  Resolución  de  300  µg  de  FOB  en  maxigel  con  tiras  reactiva  de  gradiente  no  lineal  de  pH  (3-­‐ 10),  teñido  con  azul  de  coomassie.  ...  154  

Figura  55  Red  de  interacción  por  evidencia  de  las  proteínas  más  abundantes  del  FOB  en  fase  periovulatoria,   donde  se  detectaron  hasta  32  interacciones..  ...  155  

Figura  56   Proteínas  más   abundantes  del  fluido  oviductal  de   la   vaca.  Electroforesis   en  2D  de   FUB   es  fase   periovulatoria.  Resolución  de  300  µg  de  FUB  en  maxigel  con  tiras  reactiva  de  gradiente  no  lineal  de  pH  (3-­‐ 10),  teñido  con  azul  de  coomassie.  ...  156  

Figura  57  Red  de  interacción  por  evidencia  de  las  proteínas  más  abundantes  del  FUB  en  fase  periovulatoria,   donde  se  detectaron  hasta  15  interacciones.  ...  157  

Figura  58  Electroforesis  en  2D  diferencial  (DiGE)  de  FOB,  FUB  y  SSB  en  fase  periovulatoria.  Comparativa  entre   FOB  (verde)  y  FUB  (rojo)  y  la  mezcla  (azul)  imágenes  a,  b  y  c..  ...  158  

Figura  59  Electroforesis  en  2D  diferencial  (DiGE)  de  FOB  y  FUB  en  fase  periovulatoria.  ...  159  

Figura  60  Electroforesis  en  2D  diferencial  (DiGE)  de  FOB  y  SSB  en  fase  periovulatoria.  ...  160  

(47)

Figura  62  Diagrama  de  Venn  de  las  proteínas  identificadas  por  espectrometría  de  masas  de  fluido  oviductal   bovino  (FOB),  fluido  uterino  bovino  (FUB)  y  suero  sanguíneo  bovino  (SSB).  ...  162  

Figura  63  Red  de  interacción  por  evidencia  de  las  47  proteínas  identificadas  por  MS/MS  de  FOB  y  FUB  en   fase  periovulatoria,  se  observan  91  interacciones.  ...  166  

Figura  64  Electroforesis  en  2D  diferencial  (DiGE)  de  FOB  y  FUB  en  fase  periovulatoria.  ...  169  

Figura  65  Red  de  interacción  por  evidencia  de  las  42  proteínas  de  FOB.  ...  170  

Figura  66  Red  de  interacción  por  evidencia  de  las  44  proteínas  de  FUB.  ...  171  

Figura  67  Inmunodetección  por  Western-­‐blot  en  membrana  en  FOB  y  FUB  con  anticuerpo  anti-­‐OVGP1.  .  172  

Figura  68  Expresión  por  PCR  de  SPAM1  en  oviducto  de  diferentes  especies  de  mamíferos.  Mujer  (a),  yegua   (b),  vaca  (c)  y    cerda  (d).  ...  173  

Figura  69  Inmunodetección  por  Western-­‐blot  de  SPAM1  en  espermatozoides  y  FOBs  bovinos.  ...  174  

Figura   70   Gel   SDS-­‐PAGE   de   inmunoprecipitación   de   SPAM1.   Resolucion   de   10   µg   aprox.   de   FOB   (a),   inmunoprecipitación  con  el  protocolo  de  crosslink  (b)  y  clásico  (c)  Teñido  con  azul  de  coomassie.  ...  175  

Figura  71  Inmunodetección  por  Western-­‐blot  de  SPAM1  de  proteína  inmunoprecipitada  de  FOB.  ...  176  

Figura  72  Inmunodetección  con  anti  SPAM1  bovino  (1:100)  en  corte  histológico  de  istmo  oviductal  de  vaca,   visto  al  microscopio  óptico,  revelado  con  DAB.  ...  178  

Figura  73  TEM  de  inmunocitoquímica  ultraestructural  de  oviducto  bovino  con  anti-­‐SPAM1.  ...  180  

Figura  74  TEM  de  inmunocitoquímica  ultraestructural  de  oviducto  bovino  con  anti-­‐OVGP1.  ...  181  

Figura  75  Inmunodetección  con  anti  SPAM1  en  ovocitos  de  vaca,  observación  microscópica  confocal.  ....  182  

   

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Región  extracelular   29   <0,001  

Transporte   28   <0,001  

La  matriz  extracelular   13   <0,001  

Transporte  intracelular   13   <0,001  

Establecimiento  de  localización  de  la  proteína   10   0,005  

Retículo  endoplasmático   10   0,008  

Parte  del  citoesqueleto     9   0,005  

(74)

Regulación  del  crecimiento  celular   8   <0,001  

Morfogénesis  celular   8   0,001  

Organización  del  citoesqueleto  y  la  biogénesis   8   0,003  

Unión  a  IGF   5   <0,001  

Transporte  intracelular  dependiente  del  citoesqueleto   5   <0,001  

Actividad  de  factores  de  crecimiento   5   0,004  

Movimiento  basado  en  microtúbulos   4   <0,001  

Microsoma   4   0,005  

Actividad  de  la  proteína  disulfuro  isomerasa   3   <0,001  

Filamentos  de  actina   3   0,001  

Vía  de  señalización  neuropéptido   3   0,003  

Regulación   positiva   de   la   I-­‐kappa   B   quinasa   /   NF-­‐kB   en   cascada  

3   0,005  

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 Ratón    

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35  

 (Clermont  y  Trott  1969)  

 Hámster    

35

ʹ

36  

 (Clermont  y  Trott  1969,  De  Roolj  1968)    

 Cerdo    

34

ʹ

41  

 (Swierstra  1968,  Almeida  et  al.,  2006,  Franca  et  al.,  2005)  

 Toro    

54-­‐60  

 (Hochereau  1963,  Franca  et  al.,  2005)  

 Conejo    

48

ʹ

51  

 (Swierstra  y  Foote  1963)  

 Hombre    

64  

 (Heller  y  Clermont  1964)    

 

 

 

 

(101)
(102)

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Símbolo   oficial  

Proteína     Función     Referencia    

ACR   Acrosina,  proacrosina,     Unión  secundaria  con  la   ZP,  hidrólisis de la ZP, actividad proteasa serina  

(Mao  y  

 Yang  2013,  Howes  et  al.,  2001,   Polakoski  y  Parrish  1977,  Moore   et  al.,  1993,  Guyonnet  et  al.,  

(104)

2012,  Honda  et  al.,  2002,  Mack   et  al.,  1983)    

ARSA   Arilsulfatasa  A   Unión  ZP,  desulfatación  

en  sulfoglicolipidos,   enzima  hidrolítica  

(Tulsiani   et   al.,   1998,   Xu   et   al.,   2012,   Schenk   et   al.,   2009,   Nikolajczyk  y  O'Rand  1992)    

CRISP2   Proteína  secretora  rica  en   cisteína  2  

Fusión  espermatozoide-­‐ óvulo    

(Foster   y   Gerton   1996,   Nimlamool  et  al.,  2013,  Muñoz  et   al.,   2012b,   Arangasamy   et   al.,   2011,  Cohen  et  al.,  2011,  Busso  et   al.,  2007)    

CTSB   Catepsina  B   La  hidrólisis  de  las  

proteínas  con  una  amplia   especificidad  por  enlaces   peptídicos  

(Tulsiani  et  al.,  1998,  Srivastava  y   Ninjoor  1982)  

CTSL   Catepsina  L   Importante  para  la  

degradación  global  de   proteínas  en  los   lisosomas.  

(Tulsiani  et  al.,  1998,  McDonald  y   Kadkhodayan  1988)  

EQTN   Equatorina  asociada  al   acrosoma  de  

espermatozoide  

Se  requiera  para  la  RA,   unión  espermatozoide-­‐ óvulo    

(Hao  et  al.,  2014)  

FUCA1   D-­‐L-­‐Fucosidasa   Hidrólisis  de  la  alfa-­‐1  ,6   Fucosa  

(Tulsiani  et  al.,  1998)  

GLA   D-­‐Galactosidasa   hidrólisis  de  alfa-­‐D-­‐ galactosa  

(Tulsiani  et  al.,  1998,  Mack  et  al.,   1983)  

GLB1      ɴ-­‐Galactosidasa     Actividad  hidrolasas, similares a la lectinas con ligandos ZP  

(Majumder   y   Turkingt.Rw   1974,   Nikolajczyk   y   O'Rand   1992,   Tulsiani  et  al.,  1998)    

GRN    Acrogranin,  granulin     Posible  actividad  similar   a  citoquinas,  actividad   proteína  quinasa    

(Anakwe  y  Gerton  1990,  Baba  et   al.,  1993)  

GUSB   ɴ-­‐Glucuronidasa   Degradación  de  sulfatos  

de  dermatán  y  queratán  

(Tulsiani  et  al.,  1998,  Mack  et  al.,   1983)  

HEXB   ɴ-­‐Hexosaminidasa   Degradación  de  los  

gangliósidos  GM2  

(Tulsiani  et  al.,  1998)  

HYAL   Hyaluronidase     Degradar  el  ácido  

hialurónico  

(Zaneveld   et   al.,   1973,   Yang   y   Srivastava   1975,   Gould   y   Bernstein   1975,   Mack   et   al.,   1983)  

MAN2B1   D-­‐Manosidasa   La  hidrólisis  de  alfa-­‐D-­‐ manosa    

(Tulsiani  et  al.,  1998)  

MANBA   Ȳ-­‐Manosidasa   La  hidrólisis  de  alfa-­‐D-­‐ manosa  

(Tulsiani  et  al.,  1998)  

MC41   Proteínas  intraacrosomal   Unión  secundaria  ZP,   penetración  ZP    

(Tanii   et   al.,   2001,   Saxena   et   al.,   1999)    

MMP2   Metalloproteinasa  2   Penetracion  ZP   (Gottlieb  y  Meizel  1987,  Ferrer  et   al.,  2012)  

NAGPA    N-­‐acetilglucosaminidasa    

Penetración  ZP,  unión   primaria  a  ZP,  actividad   glicosidasa    

(Miller  et  al.,  1993,  Nikolajczyk  y   O'Rand  1992,  Zitta  et  al.,  2006)    

NPTX2   Neuronal  pentraxin-­‐2   Unión  y  penetración  ZP,   actividad  glicosidasa    

(105)

Sp-­‐10     (ACRV1)  

Proteína  acrosomal  SP-­‐10   Supuesta  proteína  de   unión  ZP    

(Foster  et  al.,  1994,  Wright  et  al.,   1990)    

sp32     Proteína  acrosomal  SP32    

Proteína  de  unión  a   proacrosina    

(Baba  et  al.,  1994,  Tardif  et  al.,   2012)    

SPACA1     Proteína  asociada  a  la   membrana  acrosomal  de   espermatozoides  1  

Infertilidad  en  ratones   con  gen  fragmentado    

(Hao  et  al.,  2002,  Fujihara  et  al.,   2012,  Guyonnet  et  al.,  2012)  

SPACA3     Proteína  asociada  a  la   membrana  acrosomal  de   espermatozoides  3  

Enzima  asociada  a   lisosoma  no  bacteriolítica    

(Mandal  et  al.,  2003,  Guyonnet   et  al.,  2012)  

SPACA4   Proteína  asociada  a  la   membrana  acrosomal  de   espermatozoides  4  

Unión  y  fusión  a  ZP,   similar  a  Ly6/urokinasa   plasminógeno,  posible   implicación  en  

infertilidad  

(Shetty  et  al.,  2003,  Malcher  et   al.,  2013,  Guyonnet  et  al.,  2012)  

SPAM1   (PH-­‐20)  

Molécula  de  adhesión  de   espermatozoide  

Unión   a   ZP,   actividad   hialorunidasa  

(Morin  et  al.,  2010)  

SPESP1   Proteína  del   espermatozoide   segmento  ecuatorial  1  

Participa  en  la  unión   espermatozoide-­‐ovocito    

(Wolkowicz  et  al.,  2003,   Guyonnet  et  al.,  2012)  

SYT4   Sinaptotagmina-­‐IV   Exocitosis  acrosomal,   proteína  de  unión  a   calcio  

(Michaut  et  al.,  2001)    

TESP1     Proteína  TESPA1   Proteasa serina,  posible   penetración  de  ZP    

(Kohno  et  al.,  1998)  

TESP2     Proteína  TESPA2   Proteasa serina,  posible   unión  a  ZP  

(Kohno  et  al.,  1998)    

TRY-­‐5   (TESP4)    

Proteína  TRY-­‐5   Penetración  de  ZP     (Ohmura  et  al.,  1999)(317)    

ZAN   Zonadhesina     Proteína  de  unión  ZP     (Guyonnet  et  al.,  2012,  Hardy  y   Garbers  1994,  Olson  et  al.,  2004,   Tardif  y  Cormier  2011)    

ZP3R   (sp56)    

Proteína  de  unión  de   espermatozoide-­‐receptor   de  zona  pelúcida  3  

Unión  ZP,  Interacción  ZP   post  reacción  acrosómica  

(Foster  et  al.,  1997,  Kim  et  al.,   2001)    

ZPBP1   (sp38)  

Proteína  de  unión  de  zona   pelúcida  

Unión  ZP   (Lin  et  al.,  2007)  

ZPBP2    

Proteína  de  unión  de  zona   pelúcida  2  

Unión  ZP   (Lin  et  al.,  2007)  

(106)
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óí í á í óí ó ó í ó ó ó í íóí íí ó íáíí í ó óí Símbolo   oficial  

Proteína     Función  

ACE   Angiotensina   actividad  glucosidasa  que  libera  proteínas  ancladas  a  GPI   de  la  membrana  

ACO1   Aconitasa   Sensor  de  Hierro  

ACR   Acrosina   Es  la  principal  proteasa  de  espermatozoides  de  mamífero.  

AKR1B1   Aldosa  reductasa   Cataliza  la  reducción  dependiente  de  NADPH  

ARSA   Arilsulfatasa   Hidroliza  sulfato  cerebrósido.  

CCT2   Proteína  de  complejo  T   ɴƐƵďƵŶŝĚĂĚϭ  

Chaperona  molecular  

CCT4   Proteína  de  complejo  T   ϭƐƵďƵŶŝĚĂĚɷ  

Chaperona  molecular  

CCT8   Proteína  de  complejo  T   ɽϭƐƵďƵŶŝĚĂĚ  

Chaperona  molecular  

(111)

GSTM5   Glutatión  S-­‐transferasa   Mu  5  

Actividad  glutatión  transferasa  

HIP1   Huntingtina  1   Estabilización  de  la  actina  y  los  microtúbulos  de  células  de   espermátides  

HK1   Hexoquinasa  tipo  1   Proteína  de  membrana  integral  de  espermatozoide  de   ratón    

HSP90AA1   Proteína  de  choque   térmico  HSP  90-­‐ɲ  

Chaperona  molecular  que  promueve  la  maduración,   mantenimiento  estructural  y  la  regulación  adecuada  de   proteínas  diana  específicas  

HSPA1L   Proteína  de  choque   térmico  70  kDa  1  

Estabiliza  proteínas  preexistentes  frente  a  la  agregación  y   media  el  plegamiento  de  polipéptidos    

HSPA2   proteína  de  choque   térmico  70  kDa  2  

Estabiliza  proteínas  preexistentes  frente  a  la  agregación  y   media  el  plegamiento  de  polipéptidos    

HSPA4L   Proteína  de  choque   térmico  70  kDa  4L  

Posee  actividad  chaperona  in  vitro  donde  inhibe  la   agregación  de  citrato  sintasa  

IMPA1   Inositol  monofosfatasa   1  

Responsable  de  la  provisión  de  inositol  necesaria  para  la   síntesis  de  fosfatidilinositol  y  polifosfoinosítidos  

ISYNA1   Iinositol  1-­‐fosfato   sintasa  

Enzima  clave  en  la  ruta  de  biosíntesis  de  myo-­‐inositol  que   cataliza  la  conversión  de  glucosa  6-­‐fosfato  

LDHAL6B   L-­‐lactato  

deshidrogenasa  A-­‐6B  

Fermentación  de  piruvato  a  lactato  

LYPD4   Dominio  LY6  /  PLAUR  4   Componente  de  membrana  

MAN2C1   ɲ-­‐manosidasa   Hidrolisis  terminal  de  alfa-­‐D-­‐Manosa   MDH1   malato  deshidrogenasa   Actividad  reductasa  diiodofenilpiruvato     MFGE8   Lactadherin   Proteína  que  puede  desempeñar  un  papel  en  la  

interacción  de  gametos  zona  pelúcida  vinculante.   PGAM2   Fosfoglicerato  mutasa  2   Promueve  el  crecimiento  muscular  embrionario   PGK2   Proteína  específica  de  

testículo  fosfoglicerato   quinasa  

Posible  marcador  de  infertilidad  masculina  

PRDX5   Peroxiredoxin-­‐5   Reduce  el  peróxido  de  hidrógeno  e  hidroperóxidos  de   alquilo  

RAB2   Proteína  de  unión  a   GTP-­‐  

Se  requiere  para  el  transporte  de  proteínas  del  retículo   endoplásmico  al  aparato  de  Golgi  

TCP1   Proteína  de  complejo  T   ϭƐƵďƵŶŝĚĂĚɲ  

Chaperona  molecular  

TUBB   ɴ-­‐tubulina   Tubulin  is  the  major  constituent  of  microtubules  

VCP   Valosin   Es  un  modulador  potencial  de  la  liberación  de  SAAF  del  

ovocito   YWHAZ   4-­‐3-­‐ϯĐĂĚĞŶĂɺƉƌŽƚĞşŶĂ  

ZPBP   Proteína  zona  pelúcida   1  vinculante  

Pueden  estar  implicados  en  la  interacción  de  gametos   durante  la  fecundación.  

    Modificado  de  Belleannee  et  al.,  2011ª.  

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í ó í óí óíá í í íé ó í í ó í ó ó ó ó ó í í í óó óó íé ó áúá á ó í ó Símbolo   oficial  

Proteína      Función     Referencia     Referencia  en   tracto  genital   femenino  

MIF   Factor  inhibidor  

de  la  migración   de  macrófagos  

Participa  en  la   motilidad  del   espermatozoide  

(Frenette  et  al.,  2010,   Frenette  et  al.,  2006)  

(Nahar  y  

(115)

PPFIA3   >ŝƉƌŝŶĂɲϯ   Reacción  del   acrosoma  

(Joshi  et  al.,  2013)    

CSRC   Proteína  quinasas  

CSRC  

Cascada  de   señalización  de   capacitación  

(Krapf  et  al.,  2012)    

GPX5   Glutatión  

peroxidasa  5  

Protección  contra   el  estrés  oxidativo   (integridad  del   ADN)  

(Chabory  et  al.,  2010)    

UBC   Ubiquitina   Eliminación  de  los  

espermatozoides   defectuoso  

(Sutovsky  et  al.,  2001)   (Lin  et  al.,  2013)  

CD52  (HE5)   Proteína  de   epidídimo  de   unión  a  

espermatozoide   5    

Protección  contra   la  respuesta   inmune  

(Kirchhoff  1996)   (Kumamoto  et   al.,  2009)  

ELSPBP1   Proteína  de   epidídimo  de   unión  a  

espermatozoide   1  

Eliminación  de  los   espermatozoides   defectuoso  

(D'Amours  et  al.,   2012b,  D'Amours  et   al.,  2012a)  

 

P25b  /   RAB3B  

P25b  /  Proteína   Ras  Rab-­‐3B  

Interacción  

espermatozoide-­‐ZP    

(Girouard  et  al.,  2009,   Frenette  y  Sullivan   2001)  

 

SPAM1  (PH-­‐ 20)  

Molécula  de   adhesión  del   espermatozoide   1  

Diferentes  roles  en   la  fecundación  

(Martin-­‐DeLeon  2006,   Griffiths  et  al.,  2008a)  

(Griffiths  et  al.,   2008b,  Zhang  y   Martin-­‐DeLeon   2003b,  Acuña  et   al.,  2014b,   Acuña  et  al.,   2011)   GLIPR1L1   Glioma  

patogénesis   relacionados   proteína  1  

Fecundación   (Caballero  et  al.,  2012)    

ADAM2,   adam3,   Adam7   Desintegrin   metaloproteasas   A  

Participa  en  la   fecundación  

(Oh  et  al.,  2005)   (Yamaguchi  et   al.,  2009)  

MMSDH   Metilmalonato  

semialdehído   deshidrogenasa  

desconocido   (Suryawanshi  et  al.,   2012)  

 

Modificada  de  Sullivan  y  Saez  2013.  

(116)

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Componente     Concentración  

 Bicarbonato  sódico  

4,20  mM  

 Hepes  

10,00  mM  

 Suero  fetal  bovino    

2,00  %  (v/v)  

 Glutamina    

200,00  mM  

 Penicilina  

10  000  UI/ml  

 Estreptomicina  

10  000  UI/ml  

 Polivinilalcohol  

0,005  g/l  

 Heparina  

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Figura 1 Representación esquemática del ciclo estral bovino. Patrón de secreción de la hormona folículo estimulante (FSH), hormona luteinizante (LH) y progesterona (P4); y el Patrón de crecimiento de los folículos ováricos durante el ciclo estral en bovino
Figura 2 Tracto genital de la vaca. Modificado de K önig and Liebich, 2004.
Figura 36 Representaci ón esquemática del protocolo de inmunoprecipitación. Modificado del manual de instrucciones 28-9537-63 AA GE Healthcare
Figura 38 Representaci ón esquemática del protocolo de electroforesis diferencial DiGE
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