4.2.3.8.1.- Análisis por proteómica de fluidos oviductales y uterinos bovinos
La identificación de proteínas se hizo a partir de muestras de diferentes fuentes. La principal fuente fueron los “spots” identificados con tinción de coomassie, a partir de geles DiGE y 2D-SDS, otra fuente fueron las bandas identificadas con tinción de coomassie en geles SDS- PAGE de una dimensión. Por último se identificaron proteínas de exosomas aislados de FOB, proporcionadas por una colaboración con el Laboratorio Andaluz de Reprogramación Celular (LARCEL).
Las muestras que procedían de geles fueron desteñidas para eliminar los restos de tinción de coomassie. Las muestras fueron tratadas para la reducción de puentes disulfuro (tampón bicarbonato amónico 25 mM de pH 8,5 con 25 mM DTT) y después tratadas en un medio con iodoacetamida (tampón bicarbonato amónico 25 mM de pH 8,5 con 55 mM iodoacetamida) que es una sustancia que alquila l os átomos de azufre para impedir la renaturalización de las proteínas. Las muestras posteriormente fueron incubadas en un medio con tripsina y un potenciador de la actividad proteolítica, durante 10 min a RT (tampón bicarbonato amónico 25 mM, pH 8,5 con ProteaseMax Surfactant 0,01% y 2% de tripsina). La digestión se hizo a 37ºC durante tres horas y una vez terminada, la actividad enzimática se detuvo en una solución con 0,5% de trifluoroacético (TFA) y las muestras se lavaron en un medio con 50% de acetonitrilo y 0,5% de TFA.
La separación de las muestras tripsinizadas y análisis de las digestiones se realizaron mediante cromatografía líquida HPLC de alta resolución. Este equipo dispone de un accesorio para cromatografía capilar, inyector automático termostatizado, detector tipo DAD y compartimento termostatizado para las columnas, además, está conectado a un espectrómetro de masas tipo trampa de iones Trap XCT Plus a través de una interface tipo electrospray (ESI).
Los datos fueron analizados mediante el s oftware LC/MSD Trap Data Analysis Versión 3.3, para su búsqueda y comparación de los péptidos identificados se utilizó el software Spectrum Mill. Esta comparativa se hizo utilizando las bases de datos de NBCI. El criterio de selección y descarte de los péptidos identificados está dado por dos puntajes que otorga el software Spectrum Mill, el primero es básicamente la intensidad y precisión de la señal (score) y el segundo
tiene que ver con el porcentaje de señales detectadas
experimentalmente de cada fragmento respecto al número de señales teóricas que debería producir (SPI). Los péptidos considerados como aceptables son los que poseen un score mayor a 7,0 y un SPI superior a 70%.
4.2.3.8.2.- Análisis funcional de datos de proteómica
Una vez identificadas las proteínas por MS/MS de los diferentes “spots”, se procedió a clasificarlas. Para determinar las redes de interacción de las proteínas se utilizó la herra mienta bioinformática STRING 9.1. Para estas redes la clasificación que se utilizo fue la de evidencias, esto significa que sólo se presentaron las interacciones de las cuales se tiene referencias de artículos publicados. La especie para estas redes siempre fue la bovina. Otra herramienta bioinformática para agrupar las proteínas por funcionalidad o Gene Ontology (GO) fue el DAVID, con esta herramienta se elaboraron las tablas de funcionalidad.
4.2.4.- Análisis molecular
4.2.4.1.- Aislamiento y análisis de ARN
La extracción de ARN de muestras para PCR se realizó mediante la utilización del kit RNAqueous®. El aislamiento de ARN se consiguió siguiendo las indicaciones del fabricante. Para ello, lisamos los tejidos en la solución de lisis en una proporción de 10 µl de solución por 1 mg de muestra. La elución final se realiza con agua para biología molecular libre de RNasas. El eluido se congeló a -80ºC hasta su procesamiento.
El método de Trizol® fue utilizado para el aislamiento de ARN para las técnicas de micromatrices. El aislamiento se realizó siguiendo las indicaciones del fabricante con pequeñas variaciones en los tiempos de centrifugación.
Las muestras contenidas en RNAlater® fueron descongeladas y secadas para eliminar los restos del reactivo. Una vez secas se colocaron los tejidos en el Trizol® en una proporción de 50 mg/ml de reactivo. La homogenización se realizó con el equipo modelo DIAX 900. Para la fase de separación, a las muestras homogenizadas se les agregó cloroformo (200 µl por cada 1 ml de Trizol®) se mezcló por 15 segundos y después de 5 min a RT las muestras fueron centrifugadas a 12000g p or 15 min a 4qC en una microcentrífuga Eppendorf® 5417R. Las fases acuosas e incoloras que contienen el ARN fueron colocadas en viales nuevos. Para la fase de precipitación se les agregó a los viales alcohol isopropílico (isopropanol) 500 µl/ml de Trizol® se mezclaron en agitador y después de 10 min a RT, las muestras fueron centrifugadas a 25000g durante 45 min a 4°C en una microcentrífuga Eppendorf® 5417R, con cuidado de no perder los precipitados, el sobrenadante fue retirado y se procedió a lavar en dos ocasiones con etanol al 75%. La elución final se hizo en un volumen de 60 µl en agua para biología molecular. La incubación final se hizo a 37°C durante 20 minutos en un termo mezclador. La determinación de la pureza de ARN se midió con un espectrofotómetro (NanoDrop, SACE, UMU).
Con las muestras de ARN para el estudio de micromatrices se procedió de la siguiente manera: Para determinar si no hubo contaminación por ADN, se hicieron electroforesis en geles de agarosa al 1%, los fragmentos se visualizaron in cubando los geles en bromuro de etidio y fueron observados en el sistema de fluorescencia UV, la imagen se obtuvo por medio del software AlphaSnap .
La integridad del ARN se evaluó mediante análisis con chips de micro fluidos Agilent® RNA Nano 6000 en un Bioanalizador Agilent
2100. Los números de integridad de ARN (RIN) para las muestras utilizadas en este estudio fueron superiores a 7,9.
4.2.4.2.- Síntesis de ADN complementario para PCR
La síntesis in vitro de ADN complementario (ADNc) se realizó con el kit SuperScript® III según el protocolo descrito por el fabricante. La desnaturalización del ARN molde, se realizó empleando una cantidad de ARN total de partida de 250 ng, durante 5 min a 65ºC y en presencia de oligo (dT) 12-18 y dNTPs (desoxinucleósidos-trifosfato). La muestra se deja enfriar en hielo por 1 minuto, se añade la segunda mezcla (tampón, DTT, inhibidor de las RNasas, MgCl2, 1 µl de la enzima SuperScript® III) hasta completar 20 μl. La síntesis de ADNc tuvo lugar a 50ºC durante 50 min, la reacción se detiene a 85 °C por 5 min y se terminó por hidrolizar el ARN incubando las muestras a 37ºC durante 20 min con la enzima RNAsa H suministrada en el kit.
4.2.4.3.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Esta técnica se utilizó para la amplificación de fragmentos de ADNc obtenido a partir oviductos de diferentes especies (mujer, cerda y yegua), para determinar la expresión de ARNm de SPAM1.
El diseño de cebadores se realizó con las siguientes indicaciones: una longitud de 15 a 30 nucleótidos, un contenido de G y C de 40-60%, una o dos G o C en el extremo 5´, la diferencia de temperatura melting o de fusión (Tm) de los dos cebadores usados no fue mayor a 5°C (Tabla 9). El cálculo de la Tm se hizo mediante la siguiente formula:
Tm (ºC) = 2(A+T) + 4(C+G).
La enzima utilizada para esta técnica fue la misma para todas las muestras, Taq DNA Polymerase (Fermentas), el protocolo fue el recomendado por el fabricante (2 μl del ADN, 5 μl de tampón, 2,5 μl de cada cebador a 100 μM, 4 μl de MgCl2 al 2 mM, 4 μl dNTPs a 10 mM, 29 μl de H2O Milli-Q, y 1 μl de enzima) obteniendo un volumen final de 50 μl. Las amplificaciones de PCR se hicieron en un termociclador de
Eppendorf®, las condiciones de amplificación fueron iguales para todas las muestras con la única variación de la temperatura de fusión de los cebadores. Básicamente consistió en 29 ciclos, cada ciclo de PCR constó de tres pasos: 45 segundos a 95ºC (desnaturalización), 1 min entre 56- 60ºC (hibridación) y 1 min a 72ºC como extensión de la cadena naciente y al final de los ciclos una extensión de 10 min a 72ºC.
Tabla 9 Cebadores utilizados para amplificar SPAM1 por PCR en diferente especies de mamíferos.
Muestra de:
Tamaño de amplicon
Secuencia de cebador Dirección
Vaca 210 5´-‐CCTATTACATACCAAATGACA-‐´3 Directo
5´-‐CTTGCATGAAACTCTTTCCTG-‐´3 Reverso
Yegua 755 5´-‐GGGAGTGCTAAGGATCCAG-‐´3 Directo
5´-‐CAGTGCTTTCCTTCCACAAC-‐´3 Reverso
Cerda 262 5´-‐CTAACAGACTTGGCTACTATC-‐´3 Directo
5´-‐GCTGAACCAACTCAATAGAC-‐´3 Reverso
Mujer 771 5´-‐GGGTAAACCAAAGTGTGTAGG-‐´3 Directo
5´-‐GCAACTTCCATTGTAACCGG-‐´3 Reverso