Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Barcelona.
Todo el patrimonio genético que poseemos los seres humanos se encuentra confinado en dos orgánulos celulares: núcleo y mitocondria dando nombre al ADN que en dichos estructuras se localiza: ADN nuclear (ADNn) y ADN Mitocondrial (ADNmt). La mayor parte del ADN celular se encuentra empaquetado en el núcleo, sin embargo, las mitocondrias, que se encuentran ubicadas en el citoplasma y constituyen las autenticas plantas generadoras de energía de la célula, poseen un ADN propio dispuesto circularmente y cerrado que se encuentran en múltiples copias dentro de la célula (1000 a 10000 copias).
Por su composición bioquímica, las dos cadenas son diferentes, ya que en la secuencia nucleotídica de una de ellas prevalecen las bases púricas (adenina y guanina), por lo que es más pesada que su complementaria donde, para respetar la complementariedad han de predominar las pirimidínicas (timina y citosina). Así la primera de las hebras se denomina H (Heavy o pesada) y a la segunda L (Light o ligera).
El ADNmt tiene 16569 pares de bases y en esa secuencia se distribuye 37 genes que codifican aproximadamente para el 10 % de las proteínas constitutivas de la mitocondria. Únicamente un 10% del genoma mitocondrial es no codificante.
El ADNmt fue secuenciado completamente en 1981 por Anderson et al. La mayor parte de las variaciones entre individuos aparecen en una región no codificante del ADNmt de aproximadamente 1112 pares de bases y denominada bucle de desplazamiento (displacement loop, D-loop o región de
control) (1-3 nucleótidos diferentes cada 100 bases), y dentro de esta región
aparecen dos regiones descritas como región hipervariable I (HVR1) y región hipervariable II (HVRII) que son las que más interés han suscitado para la comunidad forense.
Pero, ¿Por qué interesa el ADNmt?. Tres son las características que hacen del ADNmt una herramienta útil para el laboratorio forense.
1. El número de copias de ADNmt por célula puede oscilar entre 1000 y 10000 dependiendo del tipo de célula y su actividad metabólica. Esta peculiaridad permite que ante muestras degradadas o con escasa o nula cantidad de ADNnuclear (pelos caídos) por una cuestión de mera probabilidad siempre puedan presentarse moléculas de ADNmt íntegras dispuestas para ser analizadas.
Posiblemente, características estructurales como la disposición circular y su escasa extensión (sólo 16569 pb) la hacen también ser más difícilmente vulnerable a la acción de nucleasas, de manera que esta “resistencia” al proceso de degradación, tan usual en las muestras procesadas en el laboratorio forense, aumenta extraordinariamente el atractivo del ADNmt. 2. La ubicación de la molécula de ADNmt en zonas próximas a la membrana
interna de la mitocondria, lugar donde se lleva a cabo la fosforilación oxidativa, expone de forma permanente al ADN a la acción de los radicales libres generados con el consiguiente efecto mutagénico. A diferencia de lo que ocurre con el ADN nuclear el ADNmt no posee histonas, de manera que dicho ADN quedará mucho más expuesto a la acción mutagénica. Por último la ADNmt polimerasa tiene una pobre actividad reparadora.
El resultado de todo ello es un ADN con unos índices de mutación superiores al ADNn (5-10 veces superior). Esta gran variabilidad es siempre una propiedad interesante en el ámbito forense a efectos de poder discriminar entre individuos.
3. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, por tanto todos aquellos individuos emparentados por vía materna poseerán, salvo mutaciones de “novo” puntuales, idéntico ADNmt.
Esta propiedad es especialmente útil en casos de identificación de cadáveres en los que no se dispone de muestras de familiares próximos y se tiene que recurrir a familiares lejanos emparentados por vía materna. Hay un caso que ilustra a la perfección lo expuesto, se trata de la
identificación de los restos del último zar de Rusia Nicolás II y parte de su familia, los cuales fueron ejecutados y sepultados tras la Revolución bolchevique en 1918 y el hecho de poder contar con muestras de referencia de parientes maternos, algunos de ellos aún vivos, permitió su identificación certera mediante el análisis del ADNmt.
Por tanto, el tipo de muestras en las que el análisis de ADNmt resulta especialmente útil son en aquellas que presentan un avanzado estado de degradación o en aquellas que la cantidad de ADN nuclear sea escasa o nula (por ej. pelos caídos o carentes de raíz).
Actualmente el análisis del ADNmt se lleva a cabo mediante secuenciación directa de las regiones HVR1 (~400pb) y HVR2 (~400pb) tras la reacción de PCR.
En los últimos años y gracias a un importante avance tecnológico, los métodos y procedimientos de secuenciación han experimentado un espectacular avance que ha permitido rápidos y precisos procesos de análisis y gran culpa de ello lo ha tenido especialmente la aparición de secuenciadores automáticos y el empleo de fluorocromos.
Sin embargo, recientemente, la comunidad científica forense ha fijado sus esfuerzos en el análisis de otro tipo de polimorfismo que se presenta en el genoma (ADNn y ADNmt) con gran frecuencia, se trata de los SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms).
En este caso las variaciones entre individuos están basadas en mutaciones puntuales en la base ubicada en una cierta posición del genoma. Las estrategias así como las plataformas de análisis desarrolladas para el análisis de SNPs son muy variadas. El análisis de este tipo de polimorfismo dentro del ADNmt supone una herramienta muy útil cuando analizamos muestras altamente degradadas y el análisis de secuenciación no es viable o en aquellos casos en los que la secuencia obtenida es altamente frecuente y requerimos una mayor discriminación.
El análisis del ADNmt presenta también una serie de limitaciones que convienen describir aunque sea sucintamente:
1. En primer lugar nos encontrado con la temida contaminación, que supone uno de los auténticos caballos de batalla de los laboratorios forenses. El análisis de ADNmt es mucho más sensible a la acción de contaminaciones, pensemos que la incorporación accidental de una sola célula aportando ADN exógeno al propio de la evidencia supone la adición de miles de copias de ADNmt. Esta circunstancia supondrá la aparición de resultados no interpretables y en el peor de los casos resultados erróneos. Es por tanto fundamental extremar al máximo las medidas encaminadas a evitar contaminaciones.
2. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, de manera, que en un individuo cabe esperar un único tipo de ADNmt, sin embargo esto no es siempre así y en ocasiones podemos encontrar individuos en los que coexisten más de un tipo de ADNmt. A este fenómeno lo denominamos
heteroplasmia. Estas pueden clasificarse en dos grandes tipos: de secuencia, caracterizadas por ser moléculas que discrepan en una
determinada base en una posición concreta, y las llamadas heteroplasmias
de longitud, cuya característica es diferenciarse unas de otras en el número
de citosinas presentes en determinados tractos de las regiones HV1 y HV2. La aparición de una heteroplasmia en una muestra de referencia y no en la dubitada o viceversa puede, en ocasiones, complicar la interpretación y posterior valoración de resultados sin embargo en otros casos cuando la heteroplasmia se presenta tanto en la muestra dubitada como en la de referencia puede dar más peso, si cabe, al hecho de la coincidencia.
3. El análisis de ADNmt se muestra como una prueba realmente eficiente en casos de exclusiones, sin embargo cuando detectamos una coincidencia entre las muestras dubitadas y las muestras de referencia se hace imprescindible un tratamiento estadístico, y por tanto darle un peso a dicho “match”. El hecho de que la herencia del ADNmt sea exclusivamente materna, lo que implica una ausencia de recombinación, obliga a tratar la secuencia de ADNmt como un único locus. La práctica corriente y por otra parte recomendada por la Internacional Society of Forensic Genetic (ISFG) consiste en determinar la “rareza”de una determinada secuencia mediante
comparación con bases de datos poblacionales, y determinar el número de secuencias idénticas a la de la muestra problema que hayan sido detectadas en dicha base de datos. Las bases de datos que actualmente se disponen están nutridas con un número de secuencias relativamente escaso (3500-4000), el resultado es un bajo poder de discriminación si lo comparamos con el que el análisis del ADNn nos ofrece. Es por tanto muy importante hacer crecer dichas bases de datos y en esa línea ha volcando la comunidad forense sus esfuerzos con el fin de generar una gran base de datos mundial que contenga secuencias perfectamente contrastadas (EMPOP -EDNAP mtDNA population database-www.empop.org).
En resumen, hemos de señalar que la molécula de ADNmt reúne una serie de características que hacen de ella una herramienta imprescindible en los laboratorios forenses. La comunidad científica ha hecho y sigue haciendo grandes esfuerzos para que en la actualidad su uso ante los Tribunales de Justicia de todo el mundo esté ampliamente aceptado.
El análisis del ADNmt ha posibilitado emitir conclusiones y dictámenes en casos, que sin este tipo de estudio, hubiera sido del todo imposible, es por tanto justo darle la importancia que requiere este tipo de análisis con las ventajas e inconvenientes que hemos descrito anteriormente.