Curso de verano
Biología Forense
La Rábida, 1 al 5 de agosto de 2005
Directores
Dra. Pilar Sanz Nicolás
Dr. Manuel López soto
LAS CIENCIAS FORENSES EN ESPAÑA. INTCF, IML, LABORATORIOS DE POLICÍA CIENTÍFICA Y GUARDIA CIVIL
PILAR SANZ NICOLÁS
Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses.
La definición más sencilla de Ciencia Forense, de acuerdo con la Forensic Science Society del Reino Unido, es la que la considera como la aplicación de los conocimientos científicos a cuestiones legales. Cuestiones legales que puedan requerir la intervención de un científico son todos los sucesos que necesitan la decisión de un juez o un jurado y en los que hay que investigar causas que excedan de los conocimientos que aporta el derecho (un robo, una falsificación de documentos, el derrumbamiento de un edificio, un vertido a un río, una homicidio...).
Expertos de cualquier rama del conocimiento pueden ser llamados a colaborar con la justicia. En ese mismo momento pasan a ser expertos forenses. Recogerán información de las personas que han intervenido en el suceso, del lugar en que ha ocurrido o de los objetos relacionados, para aportar datos objetivos que ayuden a esclarecer el caso judicial. El biólogo forense recogerá esa información de pistas biológicas (fluidos corporales, restos humanos o animales, vegetales) que han ido quedando sobre los propios implicados y en el lugar de los hechos o los objetos. Las analiza, las identifica, las individualiza y colabora así a aclarar los hechos.
Los biólogos forenses intervienen en casos civiles, como son los estudios de parentesco (por ejemplo filiaciones: reconocimiento o impugnación de paternidad), en casos penales como puede ser un robo en el que el ladrón se ha herido y ha dejado su sangre en un cristal, o en casos criminales (homicidios, agresiones sexuales) y en desastres en masa (accidentales o terroristas).
En la investigación de delitos (investigación de la escena del crimen, CSI) intervienen muy distintos tipos de profesionales. Al lugar de los hechos acuden distintos cuerpos policiales (local, nacional, guardia civil); también puede ser necesaria la presencia de bomberos, si hay un incendio, una inundación o cualquier otro percance que los requiera, del 061 y otros grupos asistenciales si hay heridos o muertos. El primero que se entera avisa a la policía y se pone el hecho en conocimiento del Juzgado de Guardia. Si hay personas heridas o fallecidas acude el médico forense. También puede ocurrir que una víctima de cualquier tipo de agresión acuda directamente a la policía, al hospital o al Juzgado a poner la denuncia.
Esquemáticamente, el médico forense se encarga del reconocimiento de las personas o de la autopsia en su caso, la policía inspecciona el lugar de los hechos y busca al delincuente (que también puede ser atendido por el médico forense). Tanto unos como otros, en el desempeño de su función, recogen cuantos vestigios y objetos presenten interés y los envían al laboratorio para su análisis.
Tanto Policía Nacional como Guardia Civil disponen de laboratorios propios y los Médicos Forenses, actualmente organizados en Institutos de Medicina Legal provinciales o regionales (según autonomías; algunos de ellos disponen también de laboratorios), mandan las muestras al Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses (INTCF). Existen en España tres Departamentos del INTCF, dependientes del Ministerio de Justicia, en Madrid, Barcelona y Sevilla y una Delegación en Tenerife. No obstante esta multiplicidad de laboratorios con funciones muy parecidas, pertenecientes a distintos Ministerios, intercambian a menudo muestras e información.
Los laboratorios forenses realizan pruebas periciales y emiten informes forenses.
LA PRUEBA PERICIAL EN LA RESOLUCIÓN DE DELITOS
PILAR SANZ NICOLÁS
Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses.
La Administración de Justicia tiene una doble misión; por una parte el conocimiento de la Ley y por otra la consideración de los hechos a los que se aplica. En esta segunda misión, si se sobrepasa el conocimiento que proporciona el Derecho es necesario recurrir a la prueba pericial.
“El Juez acordará el informe pericial cuando, para conocer o apreciar algún hecho o circunstancia importante en el sumario, fuesen necesarios o convenientes conocimientos científicos o artísticos” (Artículo 456 de la Ley de Enjuiciamiento Criminal). Las pruebas periciales al ser actos jurídicos se rigen por leyes, la de Enjuiciamiento Civil para los casos civiles (para nosotros los estudios de filiación) y por la ley de Enjuiciamiento Criminal (LEC), donde están definidos perfectamente todos los momentos y circunstancias de la prueba:
- La recogida y conservación de los vestigios o pruebas materiales - Como debe describirse el lugar del delito y los objetos que se
encuentren.
- Como deben recogerse los vestigios o huellas para garantizar su autenticidad
- En que circunstancias se recurre a la colaboración de peritos.
Es una ley que data de 1882 y aunque ha sufrido numerosas modificaciones, la última en 2003, todavía conserva un lenguaje decimonónico y habla de Ministerio de Gracia y Justicia como se denominaba antes. Cuando habla de pruebas periciales se refiere normalmente a análisis de sustancias químicas, y alguna vez cita los análisis biológicos. En la modificación última se incluye un apartado dedicado al ADN.
El Perito se define como la persona no-jurista con conocimientos especiales (“experto”), que informa al Juez sobre puntos litigiosos y el Perito Biólogo es por tanto el facultativo especializado en Biología que proporciona
conocimientos y experiencias conforme a su profesión y emite dictámenes no jurídicos. La Biología forense es muy amplia, abarca muchos aspectos y en el Laboratorio de Biología Forense lo mismo hay que identificar plantas que setas, realizar estudios microbiológicos, buscar diatomeas en sangre o tejidos de personas ahogadas, identificar alimentos en un contenido gástrico, pero el grueso del trabajo lo constituyen los estudios de parentescos y la individualización de vestigios en casos penales o criminales. La herramienta de elección es la individualización genética por lo que los laboratorios de Biología Forense actuales están altamente especializados en Genética Molecular.
De acuerdo con la LEC, los Peritos pueden ser titulares (con titulación académica) o no titulares y a su vez los Titulares pueden ser oficiales o no oficiales. Los Peritos oficiales son funcionarios de un organismo estatal como el INTCF.
Normalmente los jueces prefieren peritos titulares y, siempre que los haya, oficiales y la LEC exige que la prueba pericial se lleve a cabo por dos peritos.
En resumen, la prueba pericial es el “examen” de las pruebas por un experto aunque la LEC se refiere a ella como reconocimiento o acto pericial, porque presupone (pensemos en el siglo XIX) que se realiza en el transcurso del juicio oral. Como es lógico los recursos técnicos que se aplican hace que el “acto pericial” biológico se lleve a cabo en laboratorios especializados donde el perito. por orden del Juez Instructor y a través del Instituto de Medicina Legal, hace los análisis y emite los informes.
La prueba pericial auxilia a la administración de justicia, es eficaz y a menudo decisiva (exclusión de una paternidad), pero no es vinculante, es decir que no es obligatorio que jueces y tribunales se atengan a ella y resuelven libremente de acuerdo con todos los demás datos y circunstancias del hecho.
MESA REDONDA
ACTUACION EN EL ESCENARIO DEL CRIMEN. POLICIA JUDICIAL. LA INSPECCION OCULAR: BUSQUEDA Y RECOGIDA DE INDICIOS.
LA VICTIMA. EL AGRESOR. MARIANO PERELLÓ RIUS
Laboratorio Biología/ADN de la Brigada Provincial de Policía Científica de la Jefatura Superior de Policía de Andalucía Occidental.
INTRODUCCION: LA POLICIA CIENTIFICA
Se enuncia cual es la misión asignada a las unidades de Policía Científica dentro de la estructura básica de la Dirección General de la Policía así como las funciones desarrolladas por las mismas en la práctica habitual.
Breve explicación de cómo se incardina la actuación de la Policía Científica en la investigación policial de un hecho delictivo.
LA INSPECCION OCULAR TECNICO-POLICIAL: OBJETIVO, FASES Y MEDIOS
Definición genérica de la Inspección Ocular Técnico-Policial y su concreción dentro del campo de actuación de la Biología Forense.
Antes de proceder a la Inspección Ocular propiamente dicha, es preceptiva la realización de unas Actuaciones previas que abarcan tanto la asistencia a la víctima como el aislamiento de la zona.
La Inspección Ocular tiene un triple objetivo: Comprobar la realidad del
delito y servir de base a la investigación (saber que hecho delictivo ha
ocurrido), Evidenciar los medios empleados (como se ha producido el delito) e Identificar a los autores.
La investigación pericial de los indicios en general, y de los biológicos en particular, consta de tres etapas:
- Búsqueda en la escena del delito.
- Recogida y envío al Laboratorio de los indicios. - Investigación analítica de los mismos.
Es de capital importancia señalar que el resultado final de “la prueba del ADN” va a depender en gran medida de la correcta ejecución de los procesos
de recogida y envío de muestras al laboratorio; y además, la admisibilidad de dicha prueba en los Tribunales de Justicia también vendrá condicionada por el cumplimiento de la cadena de custodia.
En cuanto a los medios que habitualmente se emplean en el examen del lugar de los hechos, a efectos de la búsqueda y recogida de indicios biológicos podemos englobarlos en dos apartados:
- Medios que facilitan la búsqueda y localización de los indicios (reactivos químicos y equipos de iluminación).
- Medios empleados para la recogida de muestras (maletines de Inspecciones Oculares y Kits de recogida).
BUSQUEDA DE INDICIOS BIOLOGICOS
Como introducción se enumeraran cuales son los indicios biológicos más frecuentes en los Laboratorios Forenses.
La metodología a seguir en la búsqueda vendrá condicionada por las circunstancias particulares de cada caso en concreto; si bien es muy conveniente efectuar una interpretación “in situ” de los indicios antes de manipular nada, ya que una correcta valoración de los mismos exige su estudio dentro del contexto del lugar en que se ha producido el delito.
La búsqueda en sí debe de ser minuciosa, ordenada y sistemática, extremando las precauciones para no pasar por alto algún indicio o destruirlo inadvertidamente; siendo muy recomendable seguir los métodos de dividir la escena en cuadrículas, que se irán examinando sucesivamente, o bien en círculos concéntricos, tomando como centro el lugar que consideremos más importante, por ejemplo, la ubicación del cadáver.
En cualquier caso, antes de proceder a la recogida, se debe documentar la localización de todos los indicios biológicos que se vayan a recoger mediante esquemas, fotografías o vídeo, lo cual nos podrá servir para poder plantear una hipótesis sobre los hechos.
En cuanto a los lugares de búsqueda, vendrán condicionados por las circunstancias particulares de cada caso en concreto. A título de ejemplo, se
describirá como se procedería en los casos más comunes (lugar cerrado, abierto, vehículos, víctima y agresor).
RECOGIDA DE INDICIOS BIOLOGICOS
Durante el proceso de recogida es muy conveniente adoptar una serie de precauciones que abarcan un doble ámbito: La protección del personal encargado de la recogida y la protección de las muestras (esta última para evitar distintos procesos que puedan afectar a su integridad, fundamentalmente la posible contaminación de las mismas).
Como complemento a la práctica de la Inspección Ocular, en muchos casos se efectúa la toma de las denominadas muestras de referencia o
indubitadas, que serían aquellas de las que sabemos de qué persona
proceden (víctima, sospechoso, cadáver) para su cotejo con las evidencias recogidas en el lugar del delito (muestras dubitadas).
En lo referente a la recogida de indicios biológicos en el lugar de los hechos, se enumerarán las normas básicas a seguir para efectuar una correcta recogida de los indicios, con ejemplos de la casuística mas frecuente (manchas en soportes pequeños y de fácil transporte, en soportes no transportables, soportes absorbentes y no absorbentes, indicios húmedos, líquidos, pelos, etc.)
MESA REDONDA
ACTUACIÓN EN EL ESCENARIO DEL CRIMEN. POLICÍA JUDICIAL. INSPECCIÓN OCULAR: BÚSQUEDA Y RECOGIDA DE INDICIOS
LA VÍCTIMA. EL AGRESOR FÉLIX SÁNCHEZ UGENA
Director del Instituto de Medicina Legal de Badajoz.
La existencia de una persona fallecida en condiciones extrañas o de forma violenta, supone un acontecimiento desde el punto de vista Policial y Judicial que pone en marcha un dispositivo específico encaminado a esclarecer las causas y circunstancias de ese fallecimiento.
Entre las actuaciones previstas está la práctica de la autopsia Médico Legal, conforme a lo establecido en la Ley de Enjuiciamiento Criminal (Art. 343)
La autopsia judicial no se limita al examen interno del cadáver como podría pensarse, sino que comprende una serie de pasos bien diferenciados y de gran trascendencia cada uno de ellos, a saber:
- Inspección ocular y levantamiento del cadáver. - Examen externo y examen interno del cadáver. - Pruebas y estudios de laboratorio complementarios.
EL LEVANTAMIENTO DEL CADÁVER
Se trata de una actuación judicial por la que se constituye en el lugar de los hechos la Comisión Judicial, formada por el Juez, el Secretario, el Médico Forense y el Agente Judicial. Una vez practicada, el Juez ordena el LEVANTAMIENTO DEL CADÁVER y su traslado al lugar donde vaya a realizarse la autopsia.
La diligencia de inspección ocular y levantamiento del cadáver es de extraordinario interés médico forense ya que como dice el profesor Gisbert un examen a la ligera del cadáver en el lugar de los hechos puede invalidar y hacer ineficaz la más minuciosa y perfecta de las autopsias.
En primer lugar, se trata de proceder al examen del cuerpo para comprobar la realidad de la muerte, el momento estimado del fallecimiento y el posible origen (natural o violento) de la misma. A continuación habrá que
recoger aquellos datos e indicios que nos permitan la posibilidad de reconstruir los hechos, una aproximación a la causa, circunstancias de la muerte y la posible intervención de terceros.
Para ello se tomará nota de los siguientes datos: posición del cuerpo y relaciones con el entorno, examen somero de las ropas, apreciación de lesiones de forma general, búsqueda y recogida de indicios biológicos y no biológicos y cualquier otra circunstancia de interés. Es fundamental apoyar la recogida de estos elementos con croquis, esquemas, fotografías o videos.
Ciñéndonos al tema que nos ocupa es evidente que en el estudio biológico forense de un determinado caso nosotros somos el primer eslabón de la cadena. De nada sirve un extraordinario laboratorio, con los mejores recursos humanos y materiales, sí el médico forense no sabe que indicios
buscar, como los tiene que recoger y conservar y enviar y que tiene que solicitar al laboratorio.
VESTIGIOS DE INTERÉS MÉDICO LEGAL
BIOLÓGICOS NO BIOLÓGICOS
- Sangre - Ropas
- Semen - Balas, tacos, perdigones
- Restos - Fibras diversas.
- Tejidos - Restos de pintura
- Uñas - Fragmentos de vidrio
- Mordeduras / saliva - Tierra
-Otros - Otros
CONSERVACIÓN DE LOS VESTIGIOS
A.- DURANTE EL TRASLADO - Evitar pérdidas y contaminaciones. - Proteger las manos
- Envolver el cuerpo. B.- EN EL DEPÓSITO - Mínima manipulación. - No retirar envoltorio. - No desnudar ni lavar. - No obtener la necrorreseña.
RECUPERACIÓN DE LOS VESTIGIOS I.- EXAMEN CUIDADOSO DEL CUERPO
- Búsqueda de elementos adheridos en ropa / piel. - Toma de muestras de sangre.
- Toma de muestras de uñas
- Toma de muestra de boca / ano / vagina.
II.- RECOGIDA DE VESTIGIOS BIOLÓGICOS III.- RECOGIDA DE VESTIGIOS NO BIOLÓGICOS
RECONOCIMIENTO Y RECOGIDA DE MUESTRAS DEL POSIBLE AUTOR INSPECCIÓN GENERAL. Encaminada a la búsqueda de lesiones o signos de
lucha o defensa, que puedan orientarse hacia su participación en los hechos.
RECOGIDAS DE INDICIOS.
Ropas que llevaba en el momento de la agresión.
Muestras de pelos: cabellos, barba, bigote, vello púbico... Muestras de sangre y/o saliva.
Hisopo lavado de glande.
OTROS PROBLEMAS MÉDICO LEGALES QUE NOS PUEDE RESOLVER LA BIOLOGÍA FORENSE
−
INVESTIGACIÓN BIOLÓGICA DEL PARENTESCO.
− INDIVIDUALIZACIÓN DE RESTOS HUMANOS. − IDENTIFICACIÓN DE RESTOS ÓSEOS.ENVÍO DE MUESTRAS AL LABORATORIO FORENSE
VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA
Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla
El estado actual de las técnicas de identificación genética hace posible el análisis de cantidades trazas de restos biológicos y la convierten en una herramienta imprescindible en la investigación de vestigios biológicos de interés forense. Desde una colilla dejada en el lugar del crimen, un pelo o unos escasos restos epiteliales restantes en unas uñas tras un arañazo son hoy valiosas “pruebas” que pueden por si solas arrojar la información suficiente para identificar a un sospechoso.
Sin embargo, paralelamente al aumento de sensibilidad en las técnicas de detección de ADN, ha crecido el riesgo de contaminaciones exógenas de las que puede derivarse el fracaso de la investigación. Además, una mala praxis en la toma de muestras o el incumplimiento de la cadena de custodia puede incurrir en la invalidación de la prueba ante los Tribunales.
Conscientes de estos riesgos, se han realizado desde hace tiempo muchos esfuerzos encaminados a mejorar las condiciones de recogida de indicios, su preservación y envío al laboratorio, como son la elaboración de recomendaciones y normas para la recogida de muestras, diseño de protocolos de actuación en su recogida y formularios que permitan sintetizar toda la información referente a una muestra concreta.
En el año 1996, el Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses (INTCF) elaboró unas “Normas para la preparación y remisión de muestras objeto de análisis por el Instituto de Toxicología”, que se publicaron en el BOE nº 308 de 23 de diciembre de 1996 (Orden de 8 de noviembre de 1996) que contiene, entre otros apartados, información sobre el tipo de muestras que deben estudiarse, cómo deben enviarse y los formularios que deben cumplimentarse cuando se solicitan análisis genéticos. Estas normas se
encuentran hoy en revisión para adaptarlas a las nuevas técnicas y se espera su pronta publicación en el BOE.
Por otro lado, dentro del GEP-ISFG (Grupo Español y Portugués de la Sociedad Internacional de Genética Forense) se elaboró un documento de “Recomendaciones para la recogida y envío de muestras con fines de identificación genética” en el año 1999, cuya misión es la de difundir buenas practicas en la toma y manejo de muestras que permitan garantizar la autenticidad e integridad de las mismas, así como asegurar el cumplimiento de la cadena de custodia. Este documento se aprobó en la reunión del GEP-ISFG del 2000 y fue publicado por el Ministerio de Justicia en el 2001 y difundido entre todos los Médicos Forenses del Estado.
No existe aún en España una normativa oficial para la recogida de muestras, aunque esperamos que se derive de actuales proyectos tales como los de la ley de bases de datos de ADN y los procesos de acreditación de los laboratorios forenses.
Entre los puntos más importantes que observaremos en relación con el envío de muestras al laboratorio forense destacaremos las precauciones destinadas a la protección del personal, las precauciones destinadas a la protección de las muestras, la documentación necesaria y la toma de muestras.
1. Precauciones destinadas a la protección del personal.
En la manipulación de evidencias biológicas será necesario tomar precauciones universales asumiendo que cualquier muestra puede ser infecciosa: uso de guantes, mascarilla, bata u otra ropa protectora; prohibición del consumo de bebidas, comidas y tabaco; uso de material desechable siempre que sea posible y uso de contenedores específicos para residuos biológicos; vacunación del personal (hepatitis, tétanos, etc.).
2. Precauciones destinadas a la protección de las muestras.
Todo lo expuesto anteriormente tiene cabida también en cuanto a la protección de la muestra, que debe ser protegida tanto de la contaminación biológica por otro material genético ajeno al de la evidencia como de la degradación por una incorrecta manipulación de la misma.
La prevención de contaminaciones biológicas de la muestra debe contemplarse en todos los estadíos de recogida, procesado previo y análisis de las muestras y en este sentido la primera regla de oro a observar será: Nunca, bajo ninguna circunstancia, se permitirá al sospechoso ocupar el mismo área de la víctima (o viceversa) hasta que todas las evidencias se hayan recogido. Esto incluye vehículos, salas de espera, salas de interrogatorio, etc. La misma regla cuenta para el envío de muestras dubitadas e indubitadas que jamás deben compartir el mismo embalaje, e incluso en el laboratorio durante el alicuotado y procesado de las muestras debe observarse una separación espacial y temporal entre evidencias y muestras indubitadas.
Además, deben preservarse las evidencias de la exposición a condiciones medioambientales adversas que podrían favorecer la proliferación microbiana, utilizar embalajes de papel con preferencia al plástico y nunca añadir conservantes del tipo del formol.
3. Documentación necesaria.
- Formularios de envío de muestras en casos de interés criminal y de investigación de la paternidad, especificando el tipo de estudio solicitado. - Datos de identificación de la muestra.
- Cadena de custodia: nombre y firma del personal que recoge la muestra, fecha y hora, y condiciones de almacenamiento hasta su envío. Fecha de envío y medio de transporte utilizado.
- Documentos adicionales: informe preliminar de autopsia, antecedentes clínicos, fotografías de la localización de los indicios, etc.
4. Toma de muestras.
- Muestras de referencia en personas vivas: sangre, saliva, pelos. - Muestras de referencia en cadáveres: sangre, saliva, pelos.
- Muestras de referencia en cadáveres en avanzado estado de putrefacción o esqueletizados: dientes, hueso largo.
- Otras posibles muestras de referencia: biopsias, preparaciones histológicas, objetos personales del fallecido.... .
- Indicios biológicos: recoger en función de la naturaleza del indicio y del soporte sobre el que se presenta. Empaquetar cada indicio por separado.
CRITERIOS DE ORGANIZACIÓN Y CALIDAD
PILAR SANZ NICOLÁS
Directora de Departamento de Sevilla del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses.
El Laboratorio Forense reúne una serie de requisitos que lo hacen muy diferente de otros tipos a los que estamos más acostumbrados como son los de centros de investigación, universitarios o incluso los de algunas empresas.
Estos requisitos se refieren al propio tipo de trabajo, que por ser judicial está sujeto a absoluta confidencialidad. El perito también tiene que reunir una serie de requisitos, independientemente de su preparación técnica, y no puede participar en una pericia si existen relaciones de parentesco, consanguíneo o de afinidad, o amistad o enemistad, con el acusado o la víctima, tampoco si tiene algún tipo de interés en la causa judicial. Y por último una de las diferencias más importantes en el trabajo pericial lo constituyen las propias muestras, sobre todo en los casos criminales.
Por tratarse de pruebas para el esclarecimiento de un delito, se les denomina vestigios, suelen ser únicas, las más de las veces irrepetibles (salvo las muestras de referencia que se toman a un acusado o a una víctima viva), son limitadas y muy frecuentemente muy escasas, sobre todo desde que disponemos de la tecnología del ADN y podemos analizar muestras mínimas. Todo ello exige por parte del experimentador (facultativo o auxiliar de laboratorio) altas dosis de cuidado y responsabilidad. Pero además, como necesariamente tienen que estar perfectamente autentificadas, es obligatorio conservar al menos una parte para futuros análisis y muchos de los objetos son también piezas de convicción que hay que aportar al momento del juicio (un arma, unas ropas), es necesario tener rigurosamente establecida y controlada la cadena de custodia.
La cadena de custodia no debe presentar ni una sola discontinuidad; debe en todo momento estar documentada la localización exacta de las muestras originales, de las muestras de análisis, sus alícuotas y extractos. Esta custodia abarca desde la entrega al Centro por el transportista, la entrega al laboratorio, la conservación hasta el momento del análisis y durante el mismo y la custodia postanálisis hasta la devolución de las muestras originales al Juzgado cuando procede o su destrucción. Todos los cambios de ubicación o de mano deben estar registrados y los posibles envíos al exterior documentados (devoluciones al Juzgado o envío a otros Laboratorios para ampliación de análisis).
El informe escrito está también estipulado y la LEC exige que conste una descripción detallada de las muestras y de su estado, una relación detallada de los análisis y de los resultados. Esto y la necesaria rigurosidad de los estudios hace que se disponga de protocolos normalizados de trabajo para todas las operaciones del laboratorio, de hojas de recogida de datos en los que se consignan todas las circunstancias de cada ensayo y sus resultados y que estos estén contrastados por los dos peritos que firman el informe. El laboratorio forense debe estar por tanto sometido a medidas de control de la calidad basadas en la norma internacional ISO17025 y a la larga tendrá que estar acreditado.
Por último y como ya se ha dicho al comentar la necesidad de conservar una parte de las muestras originales, las pruebas periciales pueden estar sometidas a contraanálisis por otros peritos, para confirmar resultados no aceptados por alguna de las partes (acusación o defensa). Por ese motivo y para que los análisis puedan ser comparativos, los laboratorios forenses deben utilizar Métodos Normalizados Oficiales desarrollados por Centros de Referencia y regirse por normativas de carácter internacional. En el caso de la Genética Forense estas normas las dicta la Sociedad Internacional de Genética Forense a los que todos los miembros de los laboratorios de Biología Forense de España pertenecemos. Para revalidar la calidad de nuestras pericias realizamos además controles de calidad internos y ejercicios anuales interlaboratorios.
TIPOS DE ESTUDIOS EN UN LABORATORIO DE BIOLOGÍA FORENSE
VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA
Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla
Si nos dejásemos llevar por nuestra imaginación, uno pensaría que no hay nada imposible para un laboratorio de biología, en este caso forense, y esto es porque la visión que la sociedad recibe de la biología moderna suele ser a menudo una simplificación llena de falsedades procedentes del sensacionalismo periodístico y de la ciencia-ficción. A pesar de los avances tecnológicos, aún quedan cuestiones por resolver, tales como la data exacta de una mancha, por ejemplo. Los tipos de estudios solicitados más frecuentemente en un laboratorio de biología forense son:
Estudios de filiación: el caso más simple sería la investigación
biológica de la paternidad o maternidad en un trío hijo-madre-padre o bien contando únicamente con el progenitor cuestionado y el hijo. Las complicaciones aparecen cuando no es posible contar con el progenitor cuestionado por fallecimiento, siendo necesario en tal caso recurrir al análisis de otras muestras biológicas del fallecido, al análisis de familiares directos de éste que permitan reconstruir su genotipo o incluso a la exhumación del cadáver.
Estudios de identificación de restos cadavéricos: se realiza mediante
el análisis biológico de maternidad o paternidad o en su defecto análisis de otros familiares que compartan la línea materna o paterna. También puede recurrirse al análisis de otras muestras biológicas del fallecido o de objetos personales del mismo.
Identificación de indicios biológicos de interés criminal: son el tipo
de análisis más solicitado en el laboratorio de biología forense. Todos los indicios recogidos sobre la víctima, el sospechoso o el lugar de los hechos deben ser objeto de un minucioso y exhaustivo estudio que permita localizar, conocer o confirmar la naturaleza de los indicios, que variaran en función de las
características del suceso investigado. Los vestigios biológicos más frecuentes son los restos de sangre, fluidos seminales, fluidos vaginales, saliva, pelos y restos orgánicos en uñas. Otro tipo de restos biológicos menos frecuentes son la orina, las heces, la caspa, las uñas... . En el próximo tema de este curso tendremos ocasión de conocer en detalle cuales son los métodos de detección de estos indicios en función de sus características, los tipos de soporte más frecuentes sobre los que se encuentran así como sus posibilidades de individualización.
Identificación de especie: determinados restos hallados casualmente
pueden ser indicios de hechos delictivos que puedan ser causa para abrir una investigación. La solicitud de identificación de especie suele ir frecuentemente ligada al hallazgo de restos óseos muy fragmentados o cualquier otro resto orgánico del que pueda sospecharse un origen humano.
Estudios complementarios en casos de muerte por sumersión-asfixia: siempre que se recupera un cadáver del agua o cuando se sospecha
que la causa de la muerte puede haber sido la sumersión, será necesario confirmar los datos macroscópicos obtenidos en la autopsia mediante estudio anatomopatológico y considerar otros datos tales como la existencia de hidremia ( hemodilución de la sangre del ventrículo izquierdo respecto de la del derecho) y la existencia de elementos formes en las vísceras del cadáver que deben compararse, siempre que sea posible, con las del líquido de sumersión.
Estudios bioquímicos en casos de muertes súbitas e intoxicaciones: En casos de shock anafiláctico, los marcadores biológicos que
se investigan son la histamina, la triptasa y la IgE total y la específica. En casos de muerte súbita interesa la determinación de glucosa, urea, creatinina y cloruros. En casos de intoxicación por organofosforados y carbamatos se procederá a la determinación de acetilcolinesterasas y/o pseudocolinesterasas.
Identificación de setas y plantas superiores en casos de intoxicación: cuando se sospecha una intoxicación debida a setas o plantas
tóxicas es necesario la identificación del elemento tóxico para confirmar si es el responsable de los síntomas observados. La confirmación del origen de la intoxicación servirá para adecuar el tratamiento médico al tóxico concreto en
función de su naturaleza. A tal fin, deben enviarse al laboratorio los especimenes completos responsables de la intoxicación, si se cuenta con ellos, o restos cocinados o de contenido gástrico. Es posible identificar restos de setas en contenido gástrico o en otras muestras utilizando técnicas de ADN, como veremos a lo largo de este curso.
Estudios microbiológicos en muestras postmortem en casos de etiología no aclarada: en el caso concreto del INTCF se realizan únicamente
en el Departamento de Madrid y su finalidad es intentar arrojar algo de luz en aquellos casos de muertes de etiología desconocida en los que se sospeche un origen infeccioso. Si durante el curso de la investigación se detecta algún patógeno de reconocida alarma social tal como el meningococo, en colaboración con otros centros de referencia se procederá a informar a la consejería de salud correspondiente y a la puesta en marcha de los dispositivos de control epidemiológico.
Estudio del contenido gástrico: en algunos casos, conocer el estado
de la digestión así como la naturaleza de la última comida puede aportar datos en una investigación. A menudo, la integridad de los fragmentos de alimento hallados en un contenido gástrico podría indicar un período corto de digestión, sin embargo, este dato no puede correlacionarse con una ingesta inmediata al momento de la muerte ya que pueden confluir muchos factores que hacen esta correlación muy inexacta. Los estados emocionales del individuo así como la propia naturaleza de los alimentos influyen en el tiempo de digestión y permanencia de los alimentos en el estómago.
IDENTIFICACIÓN DE INDICIOS
VICTORIA PRIETO RUIZ-CANELA
Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla
Los tipos de indicios más comúnmente estudiados en el laboratorio de biología forense son los restos de sangre, semen, fluidos vaginales, saliva y pelos, que se presentan sobre una amplia variedad de soportes. Casi todos tienen en común que son escasos, están degradados o contaminados y son únicos e irrepetibles. La localización de una determinada evidencia de asiste a menudo con el uso de una fuente de luz forense que nos permite la utilización de diversas longitudes de onda y diversos filtros para detectar la fluorescencia típica de los fluidos orgánicos. En nuestro laboratorio contamos con una de estas fuentes (MCS-400 de Spex Forensics) basadas en el uso de distintos filtros, que han ido reemplazando a las fuentes laser por sus ventajas en el campo forense. Tras ser localizado, realizaremos una serie de pruebas preliminares, específicas para cada tipo de indicio, con las que estableceremos el diagnóstico de orientación o de certeza sobre la naturaleza del indicio.
Sangre: es un tipo de indicio fácilmente reconocible sobre determinados
soportes. Existe una amplia variedad de tests de diagnóstico previo que ponen de relieve su presencia (luminol, benzidina, fenolftaleina, o-toloidina, guayacol, verde leucomalaquita...). Los tipos de soporte más comunes sobre los que se presenta son ropas, armas, uñas, en el lugar de los hechos (tierra, suelo, piedras, paredes..). El estudio de la morfología de las manchas en la escena del delito proporciona información a cerca de cómo se produjeron los hechos.
Semen: el principal componente celular del semen es el
espermatozoide, célula especializada flagelada que suele medir entre 50 y 55 µm, distinguiéndose básicamente dos partes: cabeza y cola. Su número puede variar entre 50 x 106 y 150 x 106 por mililitro de eyaculado, con una media de unos 100 x 106/ml en individuos normospermos. El volumen de eyaculado también varía entre unos 2 ml y 6 ml con un valor medio de unos 3,5 ml. Existe
una gran variabilidad en estos datos no sólo entre individuos, sino también dentro del mismo individuo según la edad o entre distintos eyaculados. Además de los espermatozoides, en el semen podemos encontrar otros elementos formes tales como leucocitos y células epiteliales del tracto urinario aunque en número mucho menor. Así, si en un individuo normospermo podemos esperar unos 450 µg de ADN/ml de eyaculado, en un individuo azoospérmico esperaremos unos 30 µg, esto es, sólo un 6,3% del normal.
Otros rasgos característicos del semen son su pH básico (8,3) y su capacidad de fluorescer en la región visible del espectro cuando es irradiado con luz ultravioleta. La presencia característica de altas concentraciones de fosfatasa ácida y de una proteína específica (proteína P30 ó PSA) serán rasgos que se utilicen en el diagnóstico previo ( test presuntivos) en la investigación de restos de semen. Las técnicas de confirmación implican la observación de espermatozoides en preparaciones microscópicas realizadas a partir de las muestras a analizar.
Fluidos vaginales: las células del epitelio vaginal sintetizan glucógeno
bajo la acción de los estrógenos. La identificación de estos restos se basa en esta particularidad (Reacción de PAS (+) Periodic Acid-Schiff) así como en la presencia de flora bacteriana característica (bacilos de Döderlein). Sin embargo, este carácter glucogenogénico está ausente en mujeres amenárquicas (aunque las terapias con estrógenos pueden afectar esto) y sufre variaciones durante el ciclo menstrual, alcanzándose los niveles más altos de glucógeno durante la ovulación. Estas células no son exclusivas del epitelio vaginal ya que se encuentran también en menor cantidad en la boca y en el tracto uretral de hombres (en concreto en la fosa navicular). Por tanto, el hallazgo de unas pocas células puede ser comprometido, hecho que se da a veces cuando se solicita la localización de células procedentes del epitelio vaginal en un hisopo penil.
Saliva: a menudo estos restos se hallan en cantidades mínimas, por lo
que es comprometido decidir entre la identificación del tipo de vestigio o la obtención del perfil de ADN. Los humanos producimos entre 1 y 1,5 litros de saliva al día y, acompañando a la saliva, se encuentran las células descamadas del epitelio bucal que serán el sustrato para la extracción de ADN
en estos restos. Las pruebas de orientación se basan en la detección de actividad alfa-amilasa. Esta enzima no es específica de la saliva, se encuentra también en el páncreas, en el sudor, en la leche materna, en el semen y en los fluidos vaginales. Puede considerarse un buen marcador para la presencia de saliva ya que sus niveles son 50 veces más altos en saliva que en el resto de fluidos orgánicos. Las amilasas se encuentran también en animales (tipo alfa-amilasas) y en plantas (tipo beta-alfa-amilasas). Para la confirmación de presencia de restos de saliva deberán observarse células del epitelio bucal en los extractos de las muestras. Los soportes más comunes son colillas, sellos, sobres, mordazas, mordeduras, manchas en ropas, chicles, vasos... .
Pelos: en los mamíferos, el pelo atraviesa tres fases en su ciclo de
crecimiento, anágena, catágena y telógena. La fase anágena es la fase de crecimiento activo del pelo, en ella las células del folículo se multiplican por mitosis y forman el pelo al queratinizarse completamente. Un cabello humano crece a un ritmo aproximado de 0.35 mm por día. La fase catágena es una transición entre el estado de crecimiento activo y el estado de no crecimiento. En la fase telógena, ha cesado la actividad del folículo.
Una cabeza humana tiene aproximadamente entre 100.000 y 150.000 folículos pilosos, de los cuales entre el 80 y el 90% estarán en fase anágena y entre el 10 y el 20% en fase catágena o telógena. En nuestra actividad diaria, los humanos perdemos entre 50 y 100 pelos. A menudo un perito es consultado sobre la cuestión de sí un determinado pelo hallado en la escena de un crimen puede haber sido arrancado o simplemente cayó allí. Si el pelo fue arrancado por la fuerza muy probablemente quedará tejido folicular adherido a la base del pelo, sin embargo es posible arrancar pelos que estuviesen en fase telógena o que no cuenten con ningún tejido adherido a la base. Por tanto, la ausencia de tejido folicular no prueba necesariamente que el pelo fuese caído y no arrancado. A diferencia de los cabellos, los pelos púbicos pasan más tiempo en fase telógena que en anágena. La mayoría de los pelos que encontraremos en casos de agresión sexual serán telógenos. De entre todas las evidencias, los pelos son los más susceptibles de transferencias secundarias.
Restos en uñas: una excoriación leve en la piel, cuyas señales
desaparezcan a las 24 horas, puede dejar restos epidérmicos en las uñas suficientes para obtener un perfil de ADN por PCR.
Un estudio realizado entre voluntarios que se produjeron excoriaciones leves y superficiales que desaparecieron dentro de las 24 horas posteriores al experimento concluyó que: los dedos índice y medio producen los arañazos más largos y profundos; a igual fuerza aplicada, en los arañazos sobre regiones de piel más suave tales como el cuello o zona superior del brazo se recuperaron restos epidérmicos pero no así en zonas de piel muy curtidas como el antebrazo; se encontró una correlación entre la fuerza aplicada y la cantidad de ADN recuperado.
Otros tipos de indicios menos frecuentes en el laboratorio: a veces
se solicita al laboratorio el análisis de restos que, aunque no son habituales, pueden aportar datos importantes a la investigación de un caso determinado. Entre estos restos podemos citar:
Restos de orina: La identificación de la orina se basa en la detección de iones o compuestos orgánicos que se hallan más concentrados en orina que en otros fluidos fisiológicos, tales como la urea o creatinina, también presentes en sudor, sangre, saliva, semen... pero en menor concentración. Contiene células epiteliales del tracto urinario, así como leucocitos y eritrocitos, muy diluidas en la orina, por lo que la esperanza de recuperar ADN a partir de manchas de orina es muy baja. Además, la flora bacteriana propia de la orina acelera los procesos de degradación en la muestra.
Heces: La identificación de restos fecales se basa en la presencia de pigmentos biliares y de restos alimenticios no digeridos. Son un pésimo sustrato para la extracción de ADN. No es posible el estudio de ADN nuclear en estos restos debido a la extrema degradación y a su contaminación natural (aproximadamente la tercera parte del peso seco de las heces son bacterias). Sin embargo, si se han conseguido resultados en ADN mitocondrial, en concreto la región HV1, partiendo de 10 mg de heces frescas.
Otros restos también analizados en el laboratorio son secreciones nasales, uñas, restos de tejido, caspa...
TECNOLOGÍA DEL ADN EN EL PROCESADO DE MUESTRAS FORENSES
MANUEL LÓPEZ SOTO
Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla.
De todas las partes que comprende una investigación criminal, ésta que a continuación desarrollaremos, pondrá de manifiesto la capacidad pericial y profesional del laboratorio de biología forense. De forma general y una vez que tenemos seleccionadas las muestras objeto de análisis, todo el proceso analítico se puede dividir en tres grandes bloques: EXTRACCIÓN de ADN, AMPLIFICACIÓN (PCR) y DETECCIÓN.
Extracción de ADN
Posiblemente, de los tres bloques citados anteriormente, la extracción constituya el paso más crítico, ya que cualquier manipulación errónea de la muestra en esta etapa inicial del proceso puede conducirnos a su descarte, siendo en algunos casos, el único indicio biológico de que se dispone para resolver un delito.
Cualquier laboratorio forense debe contar con diferentes métodos de extracción que permitan obtener en cantidad y calidad suficiente ADN de la enorme variabilidad muestral que recibe. Los métodos de extracción se pueden dividir en tres grupos:
a) Aquel que comprende una digestión, una extracción orgánica y una purificación-concentración o, como alternativa, una precipitación con etanol. Se utiliza para la mayoría de las muestras biológicas de interés forense.
b) Aquel que comprende una etapa de digestión seguida de una precipitación con etanol. Se usa, principalmente, para obtener mucha cantidad de ADN a partir de sangre en buen estado.
c) Aquel que comprende solo una extracción directa mediante membranas especiales o bolas de sílice o similares. Su uso se limita normalmente a muestras de sangre líquida.
Centrándonos en el primer método de extracción, y en concreto en la digestión lo que se consigue con ella es romper toda la estructura celular, es decir, se alteran todos los sistemas membranosos de la célula así como todas las estructuras en las que estén implicadas proteínas (nucleosomas, citoesqueleto celular, etc.), dejando el ADN libre. Para ello, se utiliza un tampón de lisis con detergente (SDS) para solubilizar los lípidos y una enzima proteolítica (Proteinasa K) para lisar las proteínas.
Una vez que se encuentran todos los componentes celulares libres entre sí, pasamos al proceso de extracción propiamente dicho, donde se recuperará el ADN de todo ese “caldo molecular”. El método más extendido de todos es el de extracción orgánica con fenol cloroformo isoamílico (FCI). Al mezclar esta solución de FCI con el lisado celular obtenido de la etapa de digestión se genera una emulsión, que después de un centrifugado, permitirá separar el ADN de todo el material celular, aunque a veces junto con el ADN se separen otras moléculas que ser una fuente potencial de inhibidotes para el proceso de amplificación. Seguidamente, se añade N-butanol para eliminar los posibles restos de fenol que pudieran haber quedado en la solución acuosa. A continuación, esta solución acuosa se pasa por unidades de microfiltración-purificación para obtener un ADN lo más “limpio” posible, óptimo para el proceso de amplificación. Alternativamente a esta última etapa podremos llevar a cabo una precipitación con etanol.
Como ejemplo de métodos de extracción directa expondremos la extracción con Chelex y con columnas GFx, entre otros.
Por último, realizaremos un recorrido por los distintos tipos de muestras que llegan al laboratorio y por los métodos de extracción que se aconseja aplicar en cada caso. Además, se abordará brevemente la cuantificación del ADN humano y sus diferentes métodos.
Amplificación de ADN
Sin lugar a dudas, posiblemente el desarrollo de esta tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y su aplicación a la biología molecular ha permitido que este campo de la ciencia se haya desarrollado a un ritmo espectacular. El proceso en sí mismo es muy sencillo; utilizando solo unos cuantos “ingredientes” se puede multiplicar (en millones de copias) cualquier fragmento de ADN que queramos. Desde el punto de vista molecular se requiere exclusivamente dNTPs, Cl2Mg, cebadores, polimerasa
termorresistente, agua y el molde de ADN que se quiera multiplicar. El proceso de amplificación se puede dividir en tres etapas:
a) Desnaturalización del ADN a 95ºC
b) Annealing o unión de los cebadores al molde de ADN
c) Extensión, es decir, la polimerasa empieza a fabricar la nueva cadena de ADN.
Como requerimiento instrumental se necesitará un Termociclador. En definitiva, la PCR constituye un método fiable, sencillo, rápido y
económico.
Sistemas de detección de ADN
Hace unos años, la gran mayoría de los laboratorios de genética molecular utilizaba como principal sistema de detección, geles de poliacrilamida seguidos de una tinción con plata. Sin embargo, con el desarrollo de los secuenciadores automáticos, que combinan química y fluorescencia tanto en su formato de gel como de capilar, no solo se ha mejorado en gran medida la calidad y la rapidez en la detección de un producto amplificado, sino que además ha permitido incluso analizar simultáneamente fragmentos de ADN del mismo peso molecular. Dentro de los secuenciadores automáticos parece que ha tomado ventaja en el mercado el de capilar respecto al de gel entre otras razones porque requiere una menor manipulación de la muestra y permite reanalizarla sin tener que volver a prepararla. En la actualidad existen varios modelos de secuenciadores del formato de capilar: uno, cuatro, dieciséis y noventa y seis capilares.
APLICACIÓN FORENSE DE MICROSATÉLITES AUTOSÓMICOS
MARÍA JOSÉ FARFÁN Espuny
Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla
La primera aplicación de la tecnología del ADN a la resolución de un caso judicial data de 1985, cuando las autoridades británicas exigieron una prueba biológica de filiación en un asunto de inmigración en el que con la batería de ensayos disponibles en ese momento se pudo deducir que el joven ghanés investigado pertenecía al entorno familiar de su supuesta madre, pero no se podía resolver si era su hijo biológico o su sobrino. Para resolver el caso se solicitó la colaboración de Alec Jeffreys que acababa de publicar la posibilidad de aplicar el análisis de determinadas regiones repetitivas y muy polimórficas del ADN a cuestiones de identificación humana, incluidos los estudios de filiación. Mediante el análisis de la huella genética del joven y de sus presuntos madre y tres hermanos pudo confirmarse la maternidad.
Desde entonces, la tecnología del ADN ha experimentado un espectacular avance del que se ha visto beneficiada enormemente la Genética Forense. Actualmente la “prueba del ADN” constituye una pericia de enorme trascendencia en muchos casos judiciales lo cual ha supuesto en los últimos años un incremento considerable en la intervención de este tipo de pericias en los tribunales de justicia.
En una célula humana, el ADN se localiza principalmente en el núcleo, aunque también existe una pequeña cantidad de ADN en las mitocondrias, de cuya aplicación forense se hablará en otro capítulo. El ADN nuclear se encuentra dividido y muy compactado en los cromosomas, que son unas estructuras muy densas formadas por ADN y proteínas. El genoma humano nuclear está constituido por 22 pares de cromosomas autosómicos y un par de cromosomas sexuales, X e Y, cuya combinación determina el sexo femenino (XX) o masculino (XY).
La mayor parte de los análisis de identificación genética humana se centra en marcadores polimórficos localizados en regiones no codificantes de los cromosomas autosómicos. Casi la mitad del ADN no codificante está constituido por ADN repetitivo, en el que destacan las secuencias repetidas en tándem, constituidas por una secuencia determinada que se repite consecutivamente una detrás de la otra un número variable de veces. Atendiendo al tamaño de la unidad de repetición, estas secuencias se denominan satélites (unidad de repetición: 1 000-10 000 nucleótidos),
minisatélites (unidad de repetición: 7-100 nucleótidos) y microsatélites o STRs
(“Short Tandem Repeats”) (cuya unidad de repetición contiene de 2 a 6 nucleótidos), siendo éstos últimos los más ampliamente utilizados en Genética Forense.
Análisis de STRs mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La introducción de la PCR en Genética Forense ha hecho posible el análisis de una gran variedad de muestras cuyo estudio resultaba imposible mediante las técnicas convencionales. La PCR permite la obtención in vitro de millones de copias de un fragmento de ADN específico a partir de una cantidad ínfima de ADN mediante una reacción enzimática cíclica.
Dados los espectaculares avances científicos y tecnológicos experimentados en los últimos años (que incluyen el desarrollo de múltiples fluorocromos para el marcaje diferencial de fragmentos de ADN y plataformas complejas de detección capaces de discriminar selectivamente entre ellos), hoy en día se pueden analizar de forma conjunta 15 STRs o más a partir de tan sólo 0,1-1 ng de ADN, obteniéndose un perfil genético suficiente para la individualización de un resto biológico.
La principal ventaja de la aplicación de la PCR al laboratorio forense reside en el espectacular incremento en la sensibilidad de la técnica de individualización por ADN. No obstante, ello conlleva el inconveniente de un elevado riesgo de contaminación. Además, aunque la PCR ha supuesto una revolución en biología forense, presenta una serie de limitaciones que a veces son muy difíciles de salvar y que se refieren principalmente a las posibilidades
de degradación, inhibición de la reacción de PCR o la modificación del ADN. Por otra parte hay que tener en cuenta que durante la amplificación por PCR de marcadores STRs pueden originarse una serie de artefactos que pueden interferir con una clara interpretación de los resultados y cuya consideración es necesaria para garantizar un correcto genotipado.
Por otra parte, con cierta frecuencia llegan al laboratorio muestras en las que se detectan perfiles genéticos que reflejan la presencia de una mezcla de células procedentes de más de un individuo cuyo análisis es más complicado y laborioso que en casos de perfiles únicos y requiere un alto grado de formación y experiencia por parte del perito para distinguir entre los alelos verdaderos presentes en la mezcla y los posibles artefactos, lo cual no siempre es posible.
STRs autosómicos de uso generalizado en genética forense
Con fines de identificación humana es importante disponer de marcadores de ADN que exhiban una alta variación entre individuos y que en conjunto permitan discriminar entre ellos. Actualmente existen miles de STRs identificados y se calcula que en el genoma humano existe un STR cada 10 000 pares de bases. En los criterios a seguir para la selección de STRs con aplicación en identificación humana deben primar los siguientes factores: alto poder de discriminación, alta heterocigosidad, localización en distintos cromosomas para evitar el ligamiento entre marcadores, robustez y reproducibilidad de resultados en reacciones múltiplex, baja tasa de mutación y longitud de alelos en el rango de 90-450 pares de bases.
Para un intercambio y comparación de resultados efectivo entre distintos laboratorios es necesaria la utilización de una batería de marcadores genéticos comunes. Actualmente, los marcadores más extendidos en el ámbito mundial son los 13 STRs autosómicos integrados en el sistema CODIS (“Combined
DNA Index System”) establecido en 1997 por el FBI para la creación de un
banco de datos nacional. La probabilidad de coincidencia al azar entre individuos no relacionados mediante el análisis de los 13 marcadores del CODIS es inferior a uno en un billón.
APLICACIÓN FORENSE DE LOS CROMOSOMAS X e Y
MARÍA JOSÉ FARFÁN ESPUNY
Jefa del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Sevilla
Aparte de los STRs autosómicos, estrellas de la individualización mediante técnicas de ADN y a los que hemos dedicado el capítulo anterior, existen marcadores genéticos de especial relevancia en los cromosomas sexuales, cuyas peculiaridades los hacen idóneos para determinadas aplicaciones concretas.
Un marcador de sexo: amelogenina
La amelogenina es un locus localizado en una región homóloga de los cromosomas sexuales. Existe una diferencia de 6 pares de bases entre el tamaño del alelo presente en el cromosoma X y el Y, que se debe a una pequeña deleción en el cromosoma X. El resultado de la amplificación por PCR de este locus en un ADN femenino (XX) será de una única banda, mientras que si el ADN es masculino (XY), el resultado serán dos bandas de distinto tamaño.
La mayoría de los kits comerciales actuales incluyen este marcador, que permite la designación del sexo del individuo donante de la muestra. No obstante, hay que tener en cuenta que, aunque ocurre con muy baja frecuencia, se ha detectado la existencia de deleciones en esta región del cromosoma Y, de tal forma que una muestra masculina podría asignarse erróneamente como femenina. En este caso, el análisis de marcadores específicos del cromosoma Y permitirían una correcta asignación del sexo.
STRs del cromosoma Y
El cromosoma Y presenta una diferencia importante respecto al resto de cromosomas, su herencia es exclusivamente paterna, es decir, se transmite de padres a hijos varones sin que exista la posibilidad de recombinación. Por
tanto, la información genética contenida en el mismo se hereda como haplotipo, o sea, los genotipos para cada uno de los marcadores del cromosoma Y se transmiten en bloque y no de forma independiente. De esta forma, salvo posibles mutaciones, todos los individuos varones emparentados por vía paterna comparten el mismo haplotipo para el cromosoma Y.
En los últimos años, el análisis de marcadores del cromosoma Y se ha extendido en los estudios de evolución humana para trazar linajes paternos. En Genética Forense, estos marcadores han demostrado también su utilidad en casos de mezclas complejas, en estudios de filiación cuando los individuos implicados son varones y resultan de especial utilidad en los casos de agresión sexual. En éstos es común encontrar indicios donde existe una mezcla de células femeninas de la víctima y masculinas del agresor. Aunque existen métodos de extracción basados en una lisis diferencial que permite la separación del ADN de las células epiteliales (normalmente vaginales) del ADN de los espermatozoides, esta separación no siempre es posible, especialmente si los espermatozoides están muy deteriorados o el agresor es azoospérmico. En estos casos, el uso de marcadores específicos del cromosoma Y aumenta las posibilidades de detectar pequeñas cantidades de ADN masculino presentes en un fondo de abundante ADN femenino, el cual en otro tipo de análisis (STRs autosómicos, por ejemplo) enmascararía la obtención de resultados a partir del ADN masculino.
La limitación de este tipo de análisis reside en que, dado que el cromosoma Y no está sujeto a recombinación, es menos variable entre individuos, por lo que es necesario el análisis de muchos marcadores para obtener un alto poder de discriminación.
STRs del cromosoma X
En las células femeninas existe una pareja de cromosomas X de forma que éstos pueden recombinar entre sí comportándose de la misma forma que los cromosomas autosómicos, hablando en términos de su herencia. No obstante, los individuos varones transmiten a su descendencia femenina todos los marcadores localizados en su cromosoma X en bloque, es decir, uno de los cromosomas X de cada mujer es idéntico al de su padre. Esta peculiaridad
proporciona una herramienta útil en casos de paternidad con descendencia femenina así como en estudios de filiación o identificación en los que el presunto padre no está disponible y hay que recurrir a familiares en primer o segundo grado de parentesco.
APLICACIÓN FORENSE DEL ANALISIS DEL ADN MITOCONDRIAL
MANUEL CRESPILLO MÁRQUEZ
Facultativo del Servicio de Biología. Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Departamento de Barcelona.
Todo el patrimonio genético que poseemos los seres humanos se encuentra confinado en dos orgánulos celulares: núcleo y mitocondria dando nombre al ADN que en dichos estructuras se localiza: ADN nuclear (ADNn) y ADN Mitocondrial (ADNmt). La mayor parte del ADN celular se encuentra empaquetado en el núcleo, sin embargo, las mitocondrias, que se encuentran ubicadas en el citoplasma y constituyen las autenticas plantas generadoras de energía de la célula, poseen un ADN propio dispuesto circularmente y cerrado que se encuentran en múltiples copias dentro de la célula (1000 a 10000 copias).
Por su composición bioquímica, las dos cadenas son diferentes, ya que en la secuencia nucleotídica de una de ellas prevalecen las bases púricas (adenina y guanina), por lo que es más pesada que su complementaria donde, para respetar la complementariedad han de predominar las pirimidínicas (timina y citosina). Así la primera de las hebras se denomina H (Heavy o pesada) y a la segunda L (Light o ligera).
El ADNmt tiene 16569 pares de bases y en esa secuencia se distribuye 37 genes que codifican aproximadamente para el 10 % de las proteínas constitutivas de la mitocondria. Únicamente un 10% del genoma mitocondrial es no codificante.
El ADNmt fue secuenciado completamente en 1981 por Anderson et al. La mayor parte de las variaciones entre individuos aparecen en una región no codificante del ADNmt de aproximadamente 1112 pares de bases y denominada bucle de desplazamiento (displacement loop, D-loop o región de
control) (1-3 nucleótidos diferentes cada 100 bases), y dentro de esta región
aparecen dos regiones descritas como región hipervariable I (HVR1) y región hipervariable II (HVRII) que son las que más interés han suscitado para la comunidad forense.
Pero, ¿Por qué interesa el ADNmt?. Tres son las características que hacen del ADNmt una herramienta útil para el laboratorio forense.
1. El número de copias de ADNmt por célula puede oscilar entre 1000 y 10000 dependiendo del tipo de célula y su actividad metabólica. Esta peculiaridad permite que ante muestras degradadas o con escasa o nula cantidad de ADNnuclear (pelos caídos) por una cuestión de mera probabilidad siempre puedan presentarse moléculas de ADNmt íntegras dispuestas para ser analizadas.
Posiblemente, características estructurales como la disposición circular y su escasa extensión (sólo 16569 pb) la hacen también ser más difícilmente vulnerable a la acción de nucleasas, de manera que esta “resistencia” al proceso de degradación, tan usual en las muestras procesadas en el laboratorio forense, aumenta extraordinariamente el atractivo del ADNmt. 2. La ubicación de la molécula de ADNmt en zonas próximas a la membrana
interna de la mitocondria, lugar donde se lleva a cabo la fosforilación oxidativa, expone de forma permanente al ADN a la acción de los radicales libres generados con el consiguiente efecto mutagénico. A diferencia de lo que ocurre con el ADN nuclear el ADNmt no posee histonas, de manera que dicho ADN quedará mucho más expuesto a la acción mutagénica. Por último la ADNmt polimerasa tiene una pobre actividad reparadora.
El resultado de todo ello es un ADN con unos índices de mutación superiores al ADNn (5-10 veces superior). Esta gran variabilidad es siempre una propiedad interesante en el ámbito forense a efectos de poder discriminar entre individuos.
3. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, por tanto todos aquellos individuos emparentados por vía materna poseerán, salvo mutaciones de “novo” puntuales, idéntico ADNmt.
Esta propiedad es especialmente útil en casos de identificación de cadáveres en los que no se dispone de muestras de familiares próximos y se tiene que recurrir a familiares lejanos emparentados por vía materna. Hay un caso que ilustra a la perfección lo expuesto, se trata de la
identificación de los restos del último zar de Rusia Nicolás II y parte de su familia, los cuales fueron ejecutados y sepultados tras la Revolución bolchevique en 1918 y el hecho de poder contar con muestras de referencia de parientes maternos, algunos de ellos aún vivos, permitió su identificación certera mediante el análisis del ADNmt.
Por tanto, el tipo de muestras en las que el análisis de ADNmt resulta especialmente útil son en aquellas que presentan un avanzado estado de degradación o en aquellas que la cantidad de ADN nuclear sea escasa o nula (por ej. pelos caídos o carentes de raíz).
Actualmente el análisis del ADNmt se lleva a cabo mediante secuenciación directa de las regiones HVR1 (~400pb) y HVR2 (~400pb) tras la reacción de PCR.
En los últimos años y gracias a un importante avance tecnológico, los métodos y procedimientos de secuenciación han experimentado un espectacular avance que ha permitido rápidos y precisos procesos de análisis y gran culpa de ello lo ha tenido especialmente la aparición de secuenciadores automáticos y el empleo de fluorocromos.
Sin embargo, recientemente, la comunidad científica forense ha fijado sus esfuerzos en el análisis de otro tipo de polimorfismo que se presenta en el genoma (ADNn y ADNmt) con gran frecuencia, se trata de los SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms).
En este caso las variaciones entre individuos están basadas en mutaciones puntuales en la base ubicada en una cierta posición del genoma. Las estrategias así como las plataformas de análisis desarrolladas para el análisis de SNPs son muy variadas. El análisis de este tipo de polimorfismo dentro del ADNmt supone una herramienta muy útil cuando analizamos muestras altamente degradadas y el análisis de secuenciación no es viable o en aquellos casos en los que la secuencia obtenida es altamente frecuente y requerimos una mayor discriminación.
El análisis del ADNmt presenta también una serie de limitaciones que convienen describir aunque sea sucintamente:
1. En primer lugar nos encontrado con la temida contaminación, que supone uno de los auténticos caballos de batalla de los laboratorios forenses. El análisis de ADNmt es mucho más sensible a la acción de contaminaciones, pensemos que la incorporación accidental de una sola célula aportando ADN exógeno al propio de la evidencia supone la adición de miles de copias de ADNmt. Esta circunstancia supondrá la aparición de resultados no interpretables y en el peor de los casos resultados erróneos. Es por tanto fundamental extremar al máximo las medidas encaminadas a evitar contaminaciones.
2. El ADNmt se hereda exclusivamente por vía materna, de manera, que en un individuo cabe esperar un único tipo de ADNmt, sin embargo esto no es siempre así y en ocasiones podemos encontrar individuos en los que coexisten más de un tipo de ADNmt. A este fenómeno lo denominamos
heteroplasmia. Estas pueden clasificarse en dos grandes tipos: de secuencia, caracterizadas por ser moléculas que discrepan en una
determinada base en una posición concreta, y las llamadas heteroplasmias
de longitud, cuya característica es diferenciarse unas de otras en el número
de citosinas presentes en determinados tractos de las regiones HV1 y HV2. La aparición de una heteroplasmia en una muestra de referencia y no en la dubitada o viceversa puede, en ocasiones, complicar la interpretación y posterior valoración de resultados sin embargo en otros casos cuando la heteroplasmia se presenta tanto en la muestra dubitada como en la de referencia puede dar más peso, si cabe, al hecho de la coincidencia.
3. El análisis de ADNmt se muestra como una prueba realmente eficiente en casos de exclusiones, sin embargo cuando detectamos una coincidencia entre las muestras dubitadas y las muestras de referencia se hace imprescindible un tratamiento estadístico, y por tanto darle un peso a dicho “match”. El hecho de que la herencia del ADNmt sea exclusivamente materna, lo que implica una ausencia de recombinación, obliga a tratar la secuencia de ADNmt como un único locus. La práctica corriente y por otra parte recomendada por la Internacional Society of Forensic Genetic (ISFG) consiste en determinar la “rareza”de una determinada secuencia mediante
comparación con bases de datos poblacionales, y determinar el número de secuencias idénticas a la de la muestra problema que hayan sido detectadas en dicha base de datos. Las bases de datos que actualmente se disponen están nutridas con un número de secuencias relativamente escaso (3500-4000), el resultado es un bajo poder de discriminación si lo comparamos con el que el análisis del ADNn nos ofrece. Es por tanto muy importante hacer crecer dichas bases de datos y en esa línea ha volcando la comunidad forense sus esfuerzos con el fin de generar una gran base de datos mundial que contenga secuencias perfectamente contrastadas (EMPOP -EDNAP mtDNA population database-www.empop.org).
En resumen, hemos de señalar que la molécula de ADNmt reúne una serie de características que hacen de ella una herramienta imprescindible en los laboratorios forenses. La comunidad científica ha hecho y sigue haciendo grandes esfuerzos para que en la actualidad su uso ante los Tribunales de Justicia de todo el mundo esté ampliamente aceptado.
El análisis del ADNmt ha posibilitado emitir conclusiones y dictámenes en casos, que sin este tipo de estudio, hubiera sido del todo imposible, es por tanto justo darle la importancia que requiere este tipo de análisis con las ventajas e inconvenientes que hemos descrito anteriormente.
NUEVAS TECNOLOGÍAS EN GENÉTICA FORENSE
LOURDES PRIETO SOLLA
Laboratorio de Biología-ADN de la Comisaría General de Policía Científica.
Introducción
La genética forense es una ciencia que no ha dejado de evolucionar y que sigue en constante cambio. Desde sus comienzos en España a principios de los años 90, hasta hoy, se han producido muchos avances en el campo molecular que se han ido incorporando a la rutina de los laboratorios forenses. Hace unos años se requería una mancha de sangre de considerable tamaño para poder realizar una identificación y hoy se puede obtener un perfil genético de un filtro de cigarrillo e incluso de los restos epiteliales presentes en las prendas de vestir producidas por el contacto continuado con la piel.
Pero ¿qué podemos esperar en los próximos años?; si el análisis de ADN con fines forenses es una técnica tan estandarizada y establecida ¿por qué buscar nuevas tecnologías?
Aunque es verdad que la tecnología del ADN ha permitido mejorar las investigaciones criminales, todavía existen limitaciones que actualmente están tratando de superarse. En la mayoría de los casos, los resultados de “la prueba del ADN” son claros y no están sujetos a debate. Sin embargo, no podemos obviar que los resultados analíticos de algunos casos son ambiguos.
Desgraciadamente, las muestras biológicas relacionadas con el delito se encuentran a veces, diluidas, degradadas o proceden de varios contribuyentes. En estos casos, el análisis estándar de ADN y las búsquedas en las bases de datos son menos productivas y los resultados que ofrecen no son de elevada confianza. Por otro lado, el tiempo que transcurre desde que las evidencias biológicas llegan al laboratorio hasta que se emite el informe pericial puede ser considerablemente largo si el número de muestras involucradas en el caso es elevado. Por ello, las nuevas tecnologías en el análisis forense de muestras biológicas con fines identificativos se centran fundamentalmente en: posibilitar
