20x106 células se transfectaron con lipofectina (Life Technologies, Inc) según las instrucciones de la casa comercial. Brevemente, las células se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en 1mL de medio Opti-MEM (Life Technologies, Inc) y se incubaron durante 8h en un incubador de CO2 a 37ºC junto con una mezcla de 20µg de lipofectina y 30-75 µg del vector correspondiente en un volumen total de 2mL de Opti-MEM. Las células se lavaron y se resuspendieron en medio completo dejándolas recuperarse durante 24h más. Con objeto de disponer de un elemento de normalización de la eficiencia de transfección, los vectores del ensayo se cotransfectaban con 5 µg del vector “reporter” de Renilla.
A continuación, las células se estimularon en placa de 24 pocillos. A las cinco horas se recogieron y centrifugaron. Las correspondientes alícuotas de células se lisaron según las instrucciones del Kit Luciferase Assay y Dual luciferase Assay de Promega (Madison, WI). Para cada condición experimental, las actividades lumínicas de la luciferasa y de la renilla se determinutosaron por duplicado en un luminutosómetro LUMAT LB9506 (Berthold, Germany).
En el caso de cotransfecciones con vectores de expresión se siguió el mismo protocolo, si bien las relaciones molares del vector de expresión: “reporter” del promotor de FasL variaban en función del tipo de vector de expresión. Así, en el caso de la construcción IkBα ( o del correspondiente vector vacio pcDNAIII) la relación fue de 1.5 y para el caso del dominutosante negativo de NFAT, de 3. Las construcciones de dominutosantes negativos de MEKK1 y DK-JNK, se cotransfectaron en una relación de 1.5 - 3 y 1.5, respectivamente.
Los valores se representaron como unidades relativas de luz (R.L.U.) y corresponden a las medidas de luciferasa relativizadas a las de Renilla.
5. AISLAMIENTO DE RAFTs LIPÍDICOS POR ULTRACENTRIFUGACIÓN EN
GRADIENTE DE SACAROSA.
50-100x106 células se estimularon con anti-CD3 sólo o junto con anti-CD28. Las células se lisaron en 1 mL del tampón: Tris /HCl pH 7.6 25mM, NaCl 150mM, Triton 0.5% , aprotinina 10µg/mL, leupeptina 10µg/mL, peppstatina A 10µg/mL, PMSF 1mM, Na3VO4 1mM, NaF 20mM, tras lo cual, los lisados se pasaron por aguja de 21G. Los lisados se mezclaron con 1mL de sacarosa al 80% (preparada en el mismo
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55 de sacarosa al 5%, ambas disoluciones preparadas en el mismo tampón de lisis. Tras ultracentrifugación a 50000rpm, sin freno, en un rotor SW50.1 (Beckman), a 4ºC durante 18h, se colectaron fracciones de 400µL empezando desde fondo del tubo y se examinutosó el contenido en el marcador lipídico de Rafts, GM1 por medio de western blot con toxina colérica acoplada a peroxidasa. Las alícuotas que resultan positivas para GM1 se juntaron en una sóla fracción que se denominutosó FRACCIÓN INSOLUBLE. Asimismo, las negativas para GM1, se agrupan como FRACCIÓN SOLUBLE. Alternativamente, los Rafts se aislaron por recolección directa de la fracción flotante situada aproximadamente en la interfase 5%-30% . En este caso la comparación se realizó con la fracción soluble correspondiente a los 2mL del fondo del gradiente, previa normalización de los volúmenes.
6. MEDIDA DE Ras-GTP
5-10x106células se estimularon con anti-CD3 y anti-CD28 y se lisaron en un tampón que contenía Tris/HCl pH 7.8 20mM, NaCl 150mM, Brij 96 1%, aprotinina 1µg/mL, leupeptina 1µg/mL, peppstatina A 1µg/mL, PMSF 1mM, Na3VO4 1mM y NaF 20mM. Los lisados se incubaron durante 2h, en agitación circular, a 4ºC, con 5-10µg de GST-RBD, una proteína de fusión que contenía el dominutosio de unión de Raf-1 a Ras. Previamente, esta proteína había sido aislada tras lisis de un cultivo de E. Coli, en el que había sido inducida su expresión, y posterior incubación de los extractos con glutation acoplado a bolas de agarosa ( Amersham). El lecho de agarosa que contenía la Ras activa unida, se lavó varias veces en el tampón de lisis y se resuspendió en tampón de muestra. Ras activa se detectó tras haber sometido las muestras a PAGE-SDS, western blot e inmunodetección con un anticuerpo anti-Ras.
7. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE c-JUN QUINASA EN FASE SÓLIDA
5x106 de células no estimuladas o estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28 se lisaron en 200µL de un tampón de lisis ( HEPES 25mM pH 7.5, NaCl 30mM, MgCl2 1.5mM, EDTA 0.2mM, DTT 0.5mM, beta glicerofosfato 20mM, ortovanadato sódico 0.1mM Triton X-100 0.1%, leupeptina 2µg/mL, PMSF 100µg/mL). Tras centrifugación, los sobrenadantes se reconstituyeron adecuadamente para hallarse resuspendidos en HEPES 20mM pH 7.5, NaCl 75mM, MgCl2 2.5mM, EDTA 0.1mM, Triton X-100 0.05%, DTT 0.5mM, β-glicerofosfato 20mM, ortovanadato 0.1mM, leupeptina 2µg/mL y PMSF 100µg/mL , y se incubaron durante 3h, en agitación circular a 4ºC, con 10µg de GST- Jun o del control GST, acoplados a bolas glutation-Sepharose ( Pharmacia). Los lechos
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se lavaron 5 veces en un tampón de lavado (HEPES 20mM pH7.7, NaCl 50mM, MgCl2 2.5mM, EDTA 0.1mM, Triton X-100 0.05%) y finalmente se resupendieron en 30µL de tampón quinasa ( HEPES 20mM pH 7.6, MgCl2 20mM, β-glicerofosfato 20mM, PMSF 20mM, ortovanadato 0.1mM, DTT 2mM) que contenía 20µM de ATP frío y 5µCi de [γ−32P]-ATP. La reacción se efectuó durante 20 minutosutos a 30ºC y se paró con tampón de lavado. Las proteínas fosforiladas se eluyeron en tampón de muestra y se sometieron a PAGE-SDS. Las bandas correspondientes al GST-Jun fosforilado que se obtuvieron a partir de autorradiografías, se densitometraron y relativizaron a los niveles de JNK presentes en alícuotas de los precipitados antes de realizar el ensayo quinasa.8. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DE RafK, ERK Y p38MAPK
1-5x106 células fueron estimuladas con anti-CD3 sólo o con anti-CD28 y lisadas en tampón de lisis ( HEPES 20mM, EGTA 10mM, MgCl2 2.5mM, beta glicerofosfato 40mM, DTT 1mM, ortovanadato sódico 2mM, NP-40 1%, aprotinina 1 g/mL, leupeptina 1 g/mL, peppstatina A 1µg/mL, PMSF 1mM, NaF 20mM). La estimación de las actividades inducidas de ERK y p38MAPK se realizó por inmunodetección sobre memmbranas, uti.izando anticuerpos específicos que reconocían las formas fosforiladas de las correspondientes MAPKs, y que se asume son una medida de su actividad.
Para la detección de RafK activa se procedió de forma análoga pero los correspondientes lisados de células estimuladas se sometieron a PAGE-SDS al 8% a partir de una disolución de acrilamida: bisacrilamida 26:0.4 que aportaba mayor resolución en la separación de las bandas proteicas. Las proteínas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y tras inmunodetección con anticuerpos anti-RafK, se evaluó la actividad de la quinasa por la presencia de bandas de mayor peso molecular, reconocidas por los anticuerpos anti-RafK, que se corresponden con las formas fosforiladas de RafK.
El control de carga se realizó para ERK y p38MAPK tras “stripping” de la membrana y posterior inmunodetección con anticuerpos anti-ERK y anti-p38MAPK respectivamente. En el caso de la RafK, y de forma paralela también para ERK y p38, se empleó como control de carga la α-tubulina, una proteína del citoesqueleto cuya expresión no varia con la estimulación.
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9. SUBFRACCIONAMIENTO CELULAR
20-30x106 células estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28 o sin estimular se resuspendieron en un tampón hipotónico (HEPES 10mM pH 7.4, KCl 42mM, MgCl2 5mM, aprotinina 10 g/mL, leupeptina 10µg/mL, peppstatina A 10µg/mL), se incubaron a 4ºC durante 15 minutosutos y se pasaron 10 veces a través de una aguja de 30G. Los lisados se centrifugaron a 200 x g durante 10 minutosutos para separar los núcleos y el “ debris” celular y el sobrenadante se recogió y centrifugó a 13000 x g durante 1h, a 4ºC. A continuación, el sobrenadante ( fracción citosólica) se recogió y el precipitado se resuspendió en tampón de lisis ( Tris/HCl pH 7.5 20mM, NaCl 150mM, NP-40 1%, aprotinina 10µg/mL, leupeptina 10µg/mL, pepstatina A 10µg/mL), se agitó en vortex durante 5 minutosutos, a 4ºC y se centrifugó de nuevo a 13000 x g durante 1h, a 4ºC. El sobrenadante que correspondía a la fracción de membrana se retiró y la fracción insoluble en el detergente ( citoesqueleto) se resuspendió en SDS 1% en agua. Cada fracción se diluyó en tampón de muestra, se sometieron a PAGE-SDS 10% cantidades equivalentes de cada fracción en geles individuales y tras western blot e inmunodetección con un anticuerpo específico anti- PKCθ se determinutosó la cantidad de PKCθ translocada desde la fracción citosólica a las fracciones de membrana y citoesqueleto.
10. INMUNOPRECIPITACIONES
20-30x106 células no estimuladas o estimuladas con anti-CD3 y anti-CD28 se lisaron con un tampón TNE (Tris /HCl pH 7.6 25mM, NaCl 150mM, EDTA 5mM ) que contenía Brij 96 1% e inhibidores de proteasas y fosfatasas ( aprotinina 1µg/mL, leupeptina 1µg/mL, peppstatina A 1µg/mL, PMSF 1mM, Na3VO4 1mM) , durante 30 minutosutos, a 4ºC. Tras centrifugación, los sobrenadantes se sometieron a dos preaclarados, uno con bolas de proteína G o proteína A-Sepharose ( Pharmacia), en función de la especie o del isotipo del anticuerpo utilizado para inmunoprecipitar, y otro, con suero normal de la especie precipitante acoplado a bolas de proteína G/proteína A-Sepharose. Ambos se realizaron durante 2h, a 4ºC y en agitación circular. Por último, se llevó a cabo la inmunoprecipitación durante toda la noche con el anticuerpo específico, en agitación circular, a 4ºC y posterior incubación de 1h con proteína G/proteína A-Sepharose, en las mismas condiciones. Tras lavar los inmunoprecipitados con TNE- Brij96 al 0.5%, y eluir en tampón de muestra, las muestras se resolvieron en geles de poliacrilamidada-SDS al 12% en condiciones reductoras. A continuación, se realizó western blot e inmunodetección con anticuerpos específicos frente a las proteínas de interés o frente a proteínas fosforiladas en Tyr.