PKCθθθθ podrían estar implicadas en la expresión aumentada de CD69 en las
células mutantes estimuladas.
3. LAS ACTIVIDADES DE JNK Y p38MAPK ESTÁN NOTABLEMENTE REDUCIDAS EN LAS CÉLULAS MUTANTES.
Con el propósito de estudiar si la mutación, vía alguna de las moléculas adaptadoras cuya fosforilación estaba alterada ( LAT o Vav), repercutía en la correcta activación de JNK, se efectuaron ensayos quinasa en fase sólida o de “pull-down” con el substrato GST-Jun-Sepharose para medir la actividad de la quinasa. Comparando células salvajes y mutantes coestimuladas se observó como la actividad de JNK en las células salvajes alcanzaba un máximo a los 15 minutos y se mantenía a un nivel alto hasta los 30 minutos. Sin embargo en las células mutantes, la activación de JNK se inducía débilmente en todos los tiempos del ensayo ( Figura 20). Estas medidas se efectuaron también en ausencia de coestimulación y los resultados fueron semejantes como ya se ha descrito 100, 1 aunque la activación era mucho más débil.
Figura 20. La actividad de JNK está seriamente disminuida en las células mutantes. Células WT y MUT se estimularon con α-CD3+ α-CD28 durante los tiempos indicados, se lisaron e incubaron con el sustrato GST-Jun. Sobre los precipitados se realizó un ensayo quinasa ( vease Materiales y Métodos. Los valores de densitometría correspondientes a c-Jun fosforilado se relativizaron a los del control de carga ( JNK2) se ilustran en la gráfica en términos de inducción de la actividad quinasa de JNK.. El ensayo es representativo de cuatro experimentos independientes.
Como se observa en la Figura 20, la actividad de JNK en respuesta a PMA/Ionóforo fue similar en ambos tipos celulares, lo cúal indica que la actividad quinasa no se encontraba alterada a nivel basal en las células mutantes y que el defecto sólo era
IB:ααα-JNK2α TIEMPO (min)
ααα-CD3/ααP/I ααα -CD28 p-c-Jun JNK2
WT MUT 15 0 1 5 15 30 15- - + + + + - - + + + + 0 1 5 15 30 + - - - - - + - - - - - 0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0 0 1 5 1 5 3 0 TIEMP O (min) IN D U C T IO N A C T .Q U IN A S (A .U ) W T M U T
Resultados
79 ERK y JNK sinergizan para inducir la expresión y activación del factor de transcripción AP-1. Para medir la inducción de AP-1 se transfectaron células salvajes y mutantes con un reportero de luciferasa que contenía sitios AP-1 procedentes del promotor de la colagenasa y se estimularon con PMA y ionóforo y con anti-CD3 o SEB sólo o en combinación con CD28. Como se observa en la Figura 21, la inducción de AP-1 era ligeramente mayor en las células mutantes cuando resultaban estimuladas via su TCR e igual a la inducción de AP-1 de las células salvajes cuando se utilizaba como estímulo PMA/Ionóforo.
Figura 21. Inducción de AP-1. Células WT y MUT se transfectaron con el reportero AP-1luc (+73Col).Las células no estimuladas (N.S.) o estimuladas con SEB/CD28 y PMA/Ion durante 8h, se lisaron y se midió la actividad de luciferasa. Los valores se relativizaron según la eficacia de la transfección que proporciona un reportero de Renilla cotransfectado y se muestran en la gráfica normalizadas al nivel basal. Los datos son representativos de tres experimentos independientes con muestras triplicadas. SD se indica en cada punto a través de las barras de error.
Habida cuenta de que p38 es otra de las MAPK que resulta de forma importante activada mediante estimulación del TCR, se evaluó la posibilidad de que en las células mutantes la activación de p38MAPK estuviera alterada. La actividad de p38 se midió sobre extractos celulares de células salvajes y mutantes coestimuladas con α-CD3/α- CD28, seguido de inmunodetección con anticuerpos que reconocían la forma activa fosforilada de p38MAPK.
Como se ilustra en la Figura 22 y al igual que sucedía con la actividad de JNK, las células mutantes mostraban un defecto en la actividad de p38MAPK cuando eran estimuladas a través de su TCR. Este defecto se manifestaba cuando se utilizaba como estimulador PMA /Ionóforo.
Estos resultados indican que la mutación en la región transmembrana del TCRββββ afecta diferencialmente a las MAPKs, provocando un defecto en la
activación de JNK y p38MAPK opuesto a la sobre-activación de ERK. Sin
0 2 4 N.S. SEB P/I INDUCCIÓN DE AP-1 WT MUT
Resultados
embargo, las alteraciones en la activación de las MAPKs no llegan a influir gravemente a nivel transcripcional ya que la inducción de AP-1 en las células mutantes sólo es ligeramente superior a la de las células salvajes.
Figura 22. La actividad de p38MAPK está disminuida en las células mutantes. Células WT y MUT se estimularon con α-CD3+ α-CD28 a los tiempos indicados y lisaron con un tampón que contenía NP-40 1%. Los lisados se sometieron a PAGE-SDS al 10% en condiciones reductoras. Las proteínas se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y tras bloqueo, se realizó inmunodetección con anticuerpos α- fosfop38MAPK. Posteriormente, se realizó “stripping” de la membrana e inmunodetección con un anticuerpos específicos para la identificación de los niveles de p38. El ensayo es representativo de tres experimentos independientes.
4. ESTUDIO DE LA INDUCCIÓN DE NF-AT COMO EFECTOR DE LA VÍA
DEL Ca
2+En trabajos anteriores se había observado que, la liberación del calcio intracelular en las células salvajes y mutantesera similar 43. Por otro lado, en extractos celulares totales la fosforilación en tirosina de PLCγ1, fenómeno previo y necesario para su activación tampoco habían mostrado diferencia alguna entre ambos tipos celulares. Con el propósito de evaluar si la aparente normalidad de la activación de la vía del Ca2+ en las células mutantes se traducía en una similitud funcional de la vía, se estudió a nivel transcripcional la eficiencia en la inducción de NF-AT. Para ello, células mutantes y salvajes fueron transfectadas con reporteros de luciferasa que contenían un promotor con sitios consenso para NF-AT. Como se aprecia en la Figura 23, no existía diferencia significativa en la inducción de NF-AT entre las células salvajes y mutantes tanto si se estimulaba con PMA/ionóforo ( datos no mostrados) como a través del TCR. TIEMPO (min)
αααα-CD3/αααα-CD28
P/I
IB: αααα-pp38MAPK IB: αααα-p38 WT MUT 15 0 5 15 30 15 0 5 15 30 + - - - - + - - - -- - + + + - - + + + p-p38MAPK p38MAPK
Resultados
81
como ya se ha comentado antes, PLCγγγγ1 fosforilada se asocia débilmente a LAT
en las células mutantes.
Figura 23. La inducción de NF-AT es igual en células salvajes y mutantes. Células WT y MUT se transfectaron con el reportero NF-AT-luc o con el correspondiente vector vacio ( denominado vector en la figura). Las células transfectadas no estimuladas (N.S.) o estimuladas con SEB o PMA/Ion durante 5h, se lisaron y se midió la actividad luciferasa. Los valores se relativizaron según la eficacia de la transfección que proporciona un reportero de Renilla cotransfectado y se muestran en la gráfica normalizadas al nivel basal. Los datos son representativos de tres experimentos independientes con muestras triplicadas. La SD se indica en cada punto a través de las barras de error.
5. ESTUDIO DE LA RUTA DE ACTIVACIÓN DE NF-KB
A pesar de los muchos estudios que se han dedicado a caracterizar los diferentes intermediarios de la vía de inducción de NF-kB todavía se desconocen cuales son los primeros mensajeros. A priori, pues, ninguno de los defectos que ocasiona la estimulación del TCR mutado, permitían hacerse una idea de los efectos que podría tener en la inducción de este factor de transcripción.
De forma análoga a los ensayos para NF-AT, se transfectaron células mutantes y salvajes con reporteros de luciferasa que contenían sitios consenso de unión para NF- kB. No se observaron diferencias celulares en la inducción de NF-kB entre ambos tipos celulares cuando se empleaba como estímulo PMA/Ionóforo ( datos no
0 5 10 15 20 25 30 WT MUT NF-ATluc R.L.U.X10E3 N.S. SEB vector