MJA.7iE'RIJA£ y M T J'O V O S
5.1. Materiales 1 Materia prima
La muestra de nutrición parenteral fue obtenida en un hospital de la localidad, tomada en una bolsa EVA (etil-vinil acetato) de nutrición preparada, bajo los lineamientos de ese nosocomio (Apéndice 2). Una vez que la nutrición parenteral se terminó de preparar, se identificó con fecha y nombre, se almacenó en refrigeración a 4o C hasta el momento de ser utilizada en el laboratorio donde se realizaron los análisis.
5.1.2. Equipo
• refractómetro manual Atago 9097. • estufa de vacío
• viscos ¡metro Brookfield LVT
• frasco densimétrico de 2 mi (Duran Germany) • analizador de partícula Beckman Coulter LS Series. • potenciómetro marca Orion Model 420 A
• equipo Hewlett Packard (HP) G1800B GCD. (cromatografía de gases)
• espectrómetro de Resonancia Magnética Nuclear, marca VARIAN Modelo MERCURY PLUS a 300 MHz en Hidrógeno.
• espectrofotómetro Génesis 5
5.1.3. Materiales
• vasos de precipitado de diferentes tamaños • matraces volumétricos de diferentes tamaños • buretas
• pipetas de diferentes tamaños • termómetro
Caracterización de las mezclas de nutrición parenteral
5.1.4. Reactivos
Los reactivos utilizados para el análisis de las propiedades físicas y químicas se describen en el apéndice 3.
5.1.5. Métodos
Se utilizó el método de espectrofometria para el análisis de presencia y permanencia de la vitamina A (INNSZ, 1984).
Para la vitamina C se aplicó el Método Oficia! de la AOAC No. 967.21, de titulación 2,6-Dicloroindofenol.
5.1.6. Preparación de la materia prima
Los nutrientes utilizados en la mezcla de nutrición parenteral fueron principalmente de la marca Pisa®, aunque también se utilizaron da Beta® Interpharma® USV Grossman® y Fresenius® (Apéndice 2). La secuencia de nutrientes mezclados fue la siguiente: Solución con glucosa al 50%, aminoácidos al 8%, fosfato de potasio, sulfato de magnesio, gluconato de calcio, oligoelementos, L- carnitina, insulina, heparina, vitamina C, multivitamínico (en este caso se solicitó una con vitaminas y otra sin vitaminas) y, finalmente, intralipidos al 20%. La nutrición parenteral se preparó en una bolsa EVA de tres litros marca Pisa®, bajo condiciones estériles en campana de flujo laminar horizontal. La composición de la mezcla (Apéndice 2) corresponde a una dieta estándar de 2000 kcal, con una concentración
de 60 % de dextrosa, 40% de lípidos con 1.2 g/Kg/dia, de aminoácidos. Los
componentes de la mezcla se introdujeron en la bolsa mediante jeringas. La presencia de aire durante la preparación fue mínima; el aire residual en la bolsa se
eliminó antes de cerrar la misma. El almacenamiento de la mezcla fue en
refrigerador a 4o C, cubierta con campos estériles hasta su utilización en el laboratorio. En el laboratorio se prepararon dos bolsas EVA, tomándose alícuotas de diferentes medidas según el análisis a realizar, en dos horarios, uno inicial (cuando iniciaba la infusión) y después de transcurrir 24 horas conservándolas a temperatura y luz ambiental (equivalente a las 24 horas de infusión en un paciente).
Caracterización de las mezclas de nutrición parenteral 5.2. Metodología
En la figura 1 se presenta el diagrama de flujo que se siguió para el análisis de las muestras de nutrición parenteral.
Estabilidad ! relativa t Wmm 1>M | I M V Waync-tii'a Wm?mm I - I
I- ilr .d ¡ inn iii.r
ii liíu' iv I \tr.U' i ’iúri' V'll.iHlllU'. I:-x í i, .í.í j í ’in 7 Glucosa ViUimlnrj'A 1 aminoácidos p (•¡apyclrninetriu
Ácidos grasos V¡l;jm¡in;.|Q lílrilacíó'ri:
Caracterización de las mezclas de nutrición parenteral
5.2.1. Propiedades físicas
Sólidos solubles. Se midieron a través de un refractómetro manual Atago 9097. • Se tomó una alícuota
• Se colocó en el refractómetro • Se tomó la lectura
Estabilidad. Se removieron 10 mi de la emulsión inicial y después de 24 h de almacenamiento a 45° C. Se determinó por la fórmula 1. La humedad se tomó como
índice de estabilidad (Elizalde et al., 1988).
El = M24 h- M or'9inai x 100
|y| original
Donde:
El = índice de estabilidad M or'9'nal = humedad inicial M24 h= humedad a las 24 h
(1)
Viscosidad. Se determinó con un equipo Brookfield LVT a 25° C, utilizando un adaptador de muestras pequeñas para 2 mi.
Densidad relativa. Ésta se midió en un frasco de 2 mi densimétrico (Duran
Germany), utilizando la siguiente ecuación (2):
Densidad relativa = Peso del densímetro lleno de liquido a pesar - peso del deriSl01g.iíg_.VágJ.Q. (2)
C a ia d s ré a d é » «te las m eadas de m ám iM pssmSsta^
Tamaño de partícula promedio. Se detenninó en un analizador de partícula Bectanan Coutter LS Serles. El diámetro medio aritmético para cada emulsión se
calcu lo usando Sa ecuación 3.
D(3,2) = * J ) ntfó / T « « 2 0 )
Donde ni = No. De gotas con diámetro tft.
E lp H se midió en un potenciómetro marca Orion Model 420 A. • Se encendió el potencióm etro
• Se estabilizó el potenciómetro • Se midió el pH d e ia mezcla. 5.2.2. ITropíe^ctes químicas
La determinación de ácidos grasos se realizó por Cromatografía de Gases acoplada
a Espectrometría de masas, en un sistema Hewlett Packard (HP) <318008 GCD Para la
separación, se utilizó una columna HP 5 para gas Helio. La identificación se realizó por el método PBAL.M, mediante comparación de los tiempos de retención y el espectro de masas de un estándar analizado bajo las mismas condiciones. El tiempo de la corrida fue de 16 minutos, utilizando una rampa de 100° C por tres minutos; 200° C por 1 minuto y 280° C por 0.6 de minuto.
Para el análisis de los ácidos grasos se aplicó la siguiente técnica:
• Agregar 2 mi de solución de metano! 0.5 M a 2 mi de NPT y agitar • Poner a baño María con 70° C x 15 minutos, con agitación.
• Agregar 2 mi de BF3, (trifluoruro de Boro) calentar a 70° C x 15 minutos • Sacar del baño
• Agregar 2 m! de hexano HPLC (Egan et al,, 1981).
• Analizar en CG.
Caracterización de las mezclas de nutrición parenteral
La determinación de ácidos grasos y, de aminoácidos y glucosa, se estudiaron en un espectrómetro de Resonancia Magnética Nuclear, marca VARIAN Modelo MERCURY PLUS a 300 Mhz en hidrógeno. Las muestras fueron analizadas empleando la técnica Presat por saturación de la señal de agua. Para las muestras orgánicas se utilizó una técnica de rutina a través de resonancia de hidrógeno.
Técnica para la extracción de glucosa y aminoácidos
• A 3 mi de NPT se le agregaron 3 mi de hexano calidad HPLC • Se agitó esta solución
• Se toma la fase orgánica • Se filtra
Técnica para extracción de los ácidos grasos
• A 3ml de NPT se le agregaron 3 mi de hexano calidad HPLC • Se agitó esta solución
• Se toma la fase de hexano • Se filtra
Posteriormente se analizaron ambas alícuotas en Resonancia Magnética Nuclear.
Determinación de vitamina A. Se realizó de acuerdo a la técnica siguiente:
• Agregar a 1 g de NPT 2.5 mi de solución de NH^iOH (hidróxido de amonio) al 2.5%
• Poner en baño a 60° C por 10 minutos • Agregar 20 mi de etanol
• Agregar éter de petróleo
• Cubrir de la luz durante 15 minutos ® Leer fase etérea
Caracterización de las mezclas de nutrición parenteral
• Agregar isopropanol
» Leer en espectrofotómetro
Para obtener la concentración final se aplicó la siguiente ecuación (4):
1 g ---volumen de éter de petróleo (4)
X—-...—-... -— Alícuota tomada
X g ---- ---Y mi de isopropanol Z g --- ---——- 100 mi de isopropanol
Z gramos = concentración final
Para conocer la concentración de vitamina A se aplicó la ecuación 5:
Calculo de vitamina A = absorbancia x 19 x peso muestra (5)
Concentración final
La determinación de vitamina C se realizó mediante la aplicación del método de titulación (Método Oficial AOAC no. 967.21):
1. Solución extractora de ácido metafosfórico-ácido acético:
• Se disolvió por agitación, 15 g de HP03 (ácido metafosfórico) en 40 mi de CH3COOH (ácido acético) y 200 mi de agua destilada, se aforó a 500 mi y se filtró rápidamente a través de papel filtro.
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2. Solución de ácido ascòrbico estándar (1mg/ml):
• Se pesaron 50 mg de USP ácido ascòrbico estándar que fue guardado en un desecador sin la luz directa del sol. Posteriormente se trasfirió en un matraz volumétrico de 50 mi. Se aforó inmediatamente antes de usarlo con la solución 1.
3. Solución estándar de indofenol:
• Se disolvieron 50 mg de 2,6 dicloroindofenol en 50 mi de agua, a la cual se le
había agregado 42 mg de NaHC03 (bicarbonato de sodio); se agitó
vigorosamente y cuando el dicloroindofenol estuvo completamente disuelto, se aforó a 200 mi con agua destilada. Se filtró con papel, utilizando un frasco ámbar, cubriéndolo de la luz y se guardó en refrigerador.
4. Estandarización de la solución
• Se colocaron tres alícuotas de 3.0 mi de la solución de ácido ascòrbico estándar a 3 matraces erlenmeyer que contenían 5.0 mi de la solución 1. Se titularon rápidamente con la solución de dicloroindofenol hasta que la solución de los matraces cambió a color rosa por más de 5 segundos.
5. Titulación
• Se tomaron tres alícuotas de 3 mi de NPT y se les agregó solución
extractora en matraces erlenmeyer.
• Se titularon con la solución de dicloroindofenol hasta que cambiaran a color rosa persistiendo por más de 5 segundos.
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Para calcular el contenido de ácido ascòrbico, se utilizó la ecuación 6:
mg de ácido ascòrbico / mi = (X-B) x (F/E) x (V/Y) (6)
Donde:
X = mi de dicloroindofenol gastados en titular las muestras
B = mi de dicloroindofenol gastados en titular las muestras estándar
F = mg de ácido ascòrbico equivalente a 1,0 mi de dicloroindofenol en la solución estándar.
E = peso en gramos de la muestra Y = alícuota de la muestra titulada
V = volumen inicial de solución analizada.
Caracterización de ias mezclas de nutrición parenteral