El estudio fue realizado en los laboratorios del Centro Tecnológico de Procesos y Productos del Instituto de Pesquisas Tecnológicas del Estado de São Paulo, Brasil (IPT). La metodología empleada para el presente estudio se ve esquematizada en la figura 7.
Figura 7: Actividades para la determinación de producción de PHA en linajes IPT 046 e IPT 171 a partir de aceites vegetales
Linajes IPT 046 e IPT 171 en glicerol Recuperación de linajes en Agar
nutriente
Siembra en caldo nutriente
Siembra en medio mineral con los diferentes aceites vegetales y/o mezclas
Medición pH
Suspensión células en solución salina con tween 0,1m/ v Centrifugación Centrifugación Suspensión células en agua destilada Liofilización Propanólisis Filtración Secado Determinación masa seca Cromatografía gaseosa
5.1. RECUPERACIÓN DE LOS LINAJES
Se tomaron muestras conservadas en glicerol de cada linaje del banco de cepas de los laboratorios del IPT, que fueron aisladas de suelos de plantaciones de caña de azúcar (Gómez et. al., 1996).
Los linajes fueron reactivados por estriamiento en placas de Agar Nutriente (Anexo 1) y cultivados por 72h a 30oC. Colonias aisladas de cada cultivo se utilizaron para inocular 125mL de Caldo Nutriente, e incubadas por 24h (30oC, 150rpm). Una vez incubadas, se tomaron muestras para analizar la axenidad del cultivo por medio de una coloración de Gram.
5.2. PRODUCCIÓN DE PHAmcl A PARTIR DE ACEITES VEGETALES
Los aceites vegetales utilizados se observan en la Tabla 2. También se pueden observar las diferentes mezclas de los aceites vegetales que fueron empleadas en el estudio, las cuales fueron deducidas teniendo en cuenta la cantidad de los respectivos ácidos grasos en cada aceite citados por literatura (Silva-Queiroz, 2003; Vieira et al., 2005), para obtener diferentes
concentraciones y poder de esta manera correlacionar la formación de los monómeros de PHA, con la cantidad de sustrato relacionado (ácido graso) que es adicionado al cultivo (Gómez, J.G.C., 2006).
Se inocularon 20mL del cultivo anterior a 200mL de Medio Mineral (Anexo 1) con 1g/L de (NH4)2SO4, para que el nitrógeno sea el nutriente limitante, teniendo como única fuente de carbono los diferentes aceites vegetales y sus mezclas (concentración 1%v/v), y se incubaron por 72h a 30oC y 150 rpm; pasado el tiempo de incubación, se hizo la respectiva medición de pH en potenciómetro (Mettler modelo Delta 350), utilizando patrones de pH 4,7 y 9 (Silva-Queiroz, 2003).
Tabla 2: Composición de los aceites vegetales a utilizar y las mezclas de estos, de acuerdo con los datos de literatura (Silva-Queiroz, 2006)
C12: ácido láurico. C14: ácido mirístico. C16: ácido palmítico. C18: ácido esteárico. C18:1: ácido oléico. C18:1A: ácido ricinoléico. C18:2: ácido linoleico. C18:3: ácido
linolénico. C18:3A: ácido
α-eleosteárico. *Las mezclas de aceite de linaza y de algodón
son para tener diferentes concentraciones de ácido linolénico
5.3. TRANSESTERIFICACIÓN BF3 (Trifluoruro de boro) PARA ACEITES VEGETALES
Para comprobar la composición de los aceites empleados en este estudio, se realizó el método descrito por Williams (1984), una preparación de ésteres metílicos para análisis de ácidos grasos por cromatografía en fase gaseosa.
Se pesaron 0,3g de cada uno de los aceites empleados en beaker de 50mL, a los cuales se les adicionó 6mL de solución de NaOH al 20% en metanol y fue
PORCENTAJE DE ACIDOS GRASOS (%m/m) ACEITE VEGETAL O MEZCLA C12 C14 C16 C18 C18:1 C18:1A C18:2 C18:3 C18:3A Tungue 4,0 1,0 8,0 4,0 3,0 80 Mamona 1,2 1,0 3,3 89,2 3,6 0,2 Girasol 0,1 7,0 3,3 14,3 75,4 Linaza 5,5 3,5 19,1 15,3 56,5 Palma 50,9 18,4 8,7 1,9 14,6 1,2 Arroz 17,5 1,3 39,9 39,1 0,3 Canola 5,4 1,6 56,3 25 Maíz 11,5 2,2 26,6 58,7 Soya 10,5 3,2 22,3 54,5 8,3 Algodón 1,0 25,0 2,8 17,1 52,7 Coco 48,2 16,6 8,0 3,8 5,0 2,5 Mamona (20%), Palma (80%) 35,4 3,8 33,5 8,3 Arroz (50%), Maíz (50%) 14,5 1,8 33,3 48,9 Palma (15%), Canola (85%) 5,9 1,6 50 21,4 Palma (50%), Soya (50%) 9,8 2,7 19,2 33,2 5,0 Girasol (80%), Soya (20%) 8,4 3,3 17,5 67,04 3,3 Linaza (25%), Algodón (75%)* 14,5 Linaza (40%), Algodón (60%)* 22,6 Linaza (50%), Algodón (50%)* 28,3 Linaza (70%), Algodón (30%)* 39,6 Linaza (80%), Algodón (20%)* 45,3
agitado y calentado cada beaker en baño de maria por 5 minutos. Se agregaron 8mL de BF3-metanol al 20% y esta mezcla se hizo hervir por 3 minutos, luego de enfriar a temperatura ambiente, se adicionaron 5mL de éter de petróleo y 3mL de solucón saturada de NaCl, descartando el precipitado formado y recuperando el sobrenadante, al cual le fue agregado sulfato de sodio para retirar agua residual. Finalmente, la fracción etérea resultante fue analizada por cromatografía gaseosa, en un cromatógrafo gaseoso Hewlett Packard HP 6890 Series equipado con una columna HP-20M, con 1mL/min de nitrógeno como fase móvil (Silva-Queiroz, 2006).
5.4. DETERMINACION MASA SECA CELULAR
Se tomaron 10mL de cada cultivo y se centrifugaron 10min (10000rpm, 10oC). Se resuspendió el pellet en solución salina con Tween 0,1%m/
v y nuevamente se centrifugó por 10min (10000rpm, 10oC); se suspendió en agua destilada y se filtró en membranas de poro 0,45µm (Millipore). La membrana junto con las
células se secó por 4h a 100oC; luego de ser retiradas del horno, este conjunto permaneció 20min en desecador y, después de este período, se determinó la masa seca celular (MS) por la siguiente ecuación:
1000
x
VOL
UM
MM
MMC
MS
=
−
+
Ecuación 1: Determinación de masa seca.
En donde:
MMC: Masa de la membrana y células después del secado (g) MM: Masa de la membrana (g)
UM: Humedad media del lote de membrana (g) VOL: Volumen de suspensión centrifugada (mL)
5.5. CARACTERIZACIÓN DEL POLÍMERO
5.5.1. Liofilización
Se tomaron 10mL de cada cultivo y se centrifugaron 10min (10000rpm, 10oC). Se resuspendió el pellet en solución salina con Tween 0,1%m/v y nuevamente se centrifugó por 10min (10000rpm, 10oC); se suspendió en 2mL de agua destilada y fue congelado a -20oCpara su posterior liofilización, que fue realizada en un equipo Labconco modelo 5-75050/75150 con cámara de control de temperatura durante 24h (Silva-Queiroz, 2003).
5.5.2. Cantidad y composición del PHA
Para determinar la cantidad y la composición del PHA, se realizó el método de propanólisis descrito por Riis y Mai (1988), en donde se tomaron 20mg de células liofilizadas, se les adicionaron 2mL de solución de ácido clorhídrico (HCl) 0,1N en propanol (1:4v/
v), 2mL de 1,1-dicloroetano (solvente que extrae el polímero) y 200µL de solución de 40g/L de ácido benzoico en propanol, como
patrón interno. Los tubos fueron cerrados, agitados y sometidos por 3 horas a 100oC en baño de María, agitándolos después de los primeros 30 minutos. Se enfriaron a temperatura ambiente y se adicionaron 4mL de agua Milli-Q, agitando vigorosamente por 30seg. La fase acuosa (superior) se descartó y la fase orgánica (inferior) que contiene los propil-ésteres fue analizada con un cromatógrafo gaseoso Hewlett Packard HP 6890 Series equipado con una columna HP-5 (Gomez et al., 1996), con ácido benzóico como patrón interno y
polímeros producidos por P. oleovorans fueron utilizados como patrones
externos (Silva-Queiroz, 2003). Para el análisis de monómeros conteniendo insaturaciones, especialmente en la región de 12 carbonos, se admitió el mismo factor de respuesta del componente saturado con 12 carbonos, es decir, el 3HDd.