Determinación producido por diferentes tipos de aceites vegetales y combinaciones en la biosíntesis y composición del polihidroxialcanoato producido por pseudomonas putida IPT 046 y pseudomonas aeruginosa IPT 171

DETERMINACIÓN DEL EFECTO PRODUCIDO POR DIFERENTES TIPOS DE ACEITES VEGETALES Y COMBINACIONES EN LA BIOSÍNTESIS Y COMPOSICIÓN DEL POLIHIDROXIALCANOATO PRODUCIDO POR Pseudomonas putida IPT 046Y Pseudomonas aeruginosa IPT 171

IVÁN ALEJANDRO AVILA LEÓN

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

DETERMINACIÓN DEL EFECTO PRODUCIDO POR DIFERENTES TIPOS DE ACEITES VEGETALES Y COMBINACIONES EN LA BIOSÍNTESIS Y COMPOSICIÓN DEL POLIHIDROXIALCANOATO PRODUCIDO POR Pseudomonas putida IPT 046Y Pseudomonas aeruginosa IPT 171

IVÁN ALEJANDRO AVILA LEÓN

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de

MICROBIOLOGO INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL São Paulo, SP, Brasil

NOTA DE ADVERTENCIA

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques

personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

DETERMINACIÓN DEL EFECTO PRODUCIDO POR DIFERENTES TIPOS DE ACEITES VEGETALES Y COMBINACIONES EN LA BIOSÍNTESIS Y COMPOSICIÓN DEL POLIHIDROXIALCANOATO PRODUCIDO POR

Pseudomonas putida IPT 046Y Pseudomonas aeruginosa IPT 171

IVÁN ALEJANDRO AVILA LEÓN

Dr. JOSE GREGORIO CABRERA GOMEZ Biólogo, Ph.D.

Director

Dra. LUIZIANA FERREIRA DA SILVA Bióloga, Ph.D

Jurado

SONIA REGINA SILVA QUEIROZ Ing. Química M.Sc

DETERMINACIÓN DEL EFECTO PRODUCIDO POR DIFERENTES TIPOS DE ACEITES VEGETALES Y COMBINACIONES EN LA BIOSÍNTESIS Y COMPOSICIÓN DEL POLIHIDROXIALCANOATO PRODUCIDO POR

Pseudomonas putida IPT 046Y Pseudomonas aeruginosa IPT 171

IVÁN ALEJANDRO AVILA LEÓN

Dra. ANGELA UMAÑA MUÑOZ Ph.D Decana Académica

Facultad de Ciências

A Ana, el ángel guardián que me ha cuidado y amado toda la vida; A Samuel, por ser el soporte y apoyo a todas mis metas; A mis 3 padres que siempre me han dado consejos y fuerzas Y a todos los miembros de mi familia que se han preocupado siempre por mí.

AGRADECIMIENTOS

A mi padre por apoyarme económicamente, por sus consejos, ayuda y ánimo durante toda mi carrera.

Al Dr. José Gregorio Cabrera Gomez por permitirme trabajar bajo su orientación, por su apoyo, su paciencia y por compartir su conocimiento a lo largo de la realización de este trabajo.

A Sonia Queiroz por su apoyo, colaboración y consejos durante este trabajo.

Al Instituto de Pesquisas Tecnológicas del Estado de São Paulo por permitirme realizar los ensayos en sus instalaciones y a los funcionarios del Centro Tecnológico de Procesos y Productos por su ayuda.

A mis amigos por su motivación, fuerza y consejos, en especial a Luisa Velásquez, Mónica Cubillos, Cecilia Romero, Adriana Quintero, Andrés Salcedo y Killian Nylander.

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN 13

1. INTRODUCCIÓN 14

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 16

2.1 POLIHIDROXIALCANOATOS 16

2.1.1 Definición 16

2.1.2 Historia 17

2.1.3 Estructura química 18

2.1.4 Propiedades físicas 19

2.1.5 Aplicaciones 20

2.1.6 Biosíntesis 22

2.1.6.1 β-Ketoacil-CoA tiolasa 22

2.1.6.2 Acetoacetil-CoA reductasa 23

2.1.6.3 P(3HB) Polimerasa 23

2.1.6.4 Formación de gránulos 23

2.1.7 Otras rutas biosintéticas 25

2.1.7.1 Biosíntesis de PHAscl 25

2.1.7.2 Biosíntesis de PHAmcl 26

2.1.7.2.1 Biosíntesis a partir de carbohidratos 26 2.1.7.2.2 Biosíntesis a partir de ácidos grasos 27

2.1.8 Detección y cuantificación de PHA 27

2.2 GÉNERO Pseudomonas 28

2.3 METABOLISMO DE ÁCIDOS GRASOS 30

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 35

4. OBJETIVOS 37

4.1 Objetivo General 37

5. MATERIALES Y MÉTODOS 38

5.1 Recuperación de los linajes 39

5.2 Producción de PHAmcl a partir de aceites vegetales 39 5.3 Transesterificación BF3 para aceites vegetales 40

5.4 Determinación masa seca celular 41

5.5 Caracterización del polímero 42

5.5.1 Liofilización 42

5.5.2 Cantidad y composición del PHA 42

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 44

6.1 Determinación de la composición de los aceites vegetales 44

6.2 Producción y composición de PHA 47

6.3 Influencia del pH 51

6.4 Modulación en la composición del polímero producido 53

6.5 Análisis de flujos metabólicos 58

7. CONCLUSIONES 63

8. RECOMENDACIONES 65

9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 66

10. ANEXOS 73

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Monómeros esperados como constituyentes

en la formación de PHA 34

Tabla 2 Composición de los aceites vegetales a utilizar

y las mezclas de estos 40

Tabla 3 Composición de aceites vegetales obtenida

por análisis de cromatografía gaseosa 46 Tabla 4 Producción de PHA por P. putida IPT 046 a

partir de diferentes aceites vegetales y/o

combinaciones de estos 48

Tabla 5 Producción de PHA por P. aeruginosa IPT 171

a partir de diferentes aceites vegetales y/o

combinaciones de estos 49

Tabla 6 Variación del pH luego de 72h de cultivo 52

Tabla 7 Producción de 3HDd∆6 por Pseudomonas putida

IPT 046 a partir de ácido linoléico 61

Tabla 8 Producción de 3HDd∆6 por Pseudomonas aeruginosa

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Gránulos de Polihidroxialcanoato

acumulado en bacterias. 17

Figura 2. Formula estructural de los polihidroxialcanoatos 19 Figura 3. Diversos objetos formados por PHB. 21 Figura 4. Mecanismo propuesto para la formación de

gránulos de PHA. 25

Figura 5. Vías metabólicas involucradas en la síntesis de PHA. 26

Figura 6. Vía metabólica de la β-oxidación 30

Figura 7. Actividades para la determinación de producción de PHA en linajes IPT 046 e IPT 171 a partir de

aceites vegetales 38

Figura 8. Comparación entre la composición de monómeros en los PHA sintetizados por P. putida IPT 046 y P. aeruginosa IPT 171 a partir de un mismo

aceite vegetal 50

Figura 9. Correlación entre la concentración de ácido linoléico suministrada y la fracción molar de 3HDd∆6 detectado

en el PHA producido por P. putida IPT 046 55

Figura 10. Correlación entre la concentración de ácidos grasos precursores de monómeros insaturados y la fracción

molar de estos en el PHA producido por P. putida IPT 046. 55

Figura 11. Correlación entre la concentración de ácidos grasos precursores de monómeros saturados y la fracción

molar de estos en el PHA producido por P. putida IPT 046. 56

Figura 12. Correlación entre la concentración de ácido linoléico suministrada y la fracción molar de 3HDd∆6 detectado

Figura 13. Correlación entre la concentración de ácidos grasos precursores de monómeros insaturados y la fracción molar de estos en el PHA producido por

P. aeruginosa IPT 171 57

Figura 14. Correlación entre la concentración de ácidos grasos precursores de monómeros saturados y la fracción molar de estos en el PHA producido por

P. aeruginosa IPT 171 57

Figura 15. Representación del análisis de flujo metabólico de

los aceites vegetales y su incorporación al PHA. 58 Figura 16. Relación para determinar la cantidad de monómeros

formados a partir de la síntesis de novo de ácidos

RESUMEN

La producción de polihidroxialcanoatos (PHA) en Pseudomonas aeruginosa

IPT171 y P. putida IPT046 fue evaluada utilizando 11 aceites vegetales y 10

combinaciones de estos. Los valores de PHA acumulados por el linaje IPT046 fueron significativamente superiores a aquellos observados para el linaje IPT171 y alcanzó hasta 60% de la masa seca celular. Hidroxioctanoato (3HO) y 3-hidroxidecanoato (3HD) representaron un porcentaje mayor que 65% de los monómeros detectados en el PHA producido por los dos linajes bacterianos, utilizando cualquiera de los dos aceites. Se observó una tendencia de incorporación mas eficiente de 3HO en el linaje IPT171 en comparación con el linaje IPT046. Por otro lado, el sistema de biosíntesis de PHA del linaje IPT046 fue más eficiente en la incorporación de 3-hidroxihexanoato (3HHx) y 3-hidroxi-6-dodecenoato (3HDd∆6). La cantidad de monómeros insaturados pudo ser modulada en función del aceite vegetal suministrado e fueron obtenidos PHA conteniendo de 0 a 17 mol% de estos monómeros. Menos que 29% del ácido linoleico suministrado fue efectivamente incorporado como monómero 3HDd∆6.

Por medio del análisis de flujo metabólico, se determinó que en los dos linajes bacterianos se usaron las dos vías metabólicas para la formación de monómeros constituyentes del PHA, cuando son cultivados en diversos ácidos grasos; la síntesis de novo de ácidos grasos se detectó por la cantidad de 3HDd∆5 detectado, y la presencia de la β-oxidación por la existencia de 3HDd∆6.

1. INTRODUCCIÓN

Los polihidroxialcanoatos (PHA) son polímeros acumulados por diversas bacterias en forma de gránulos intracelulares, que alcanzan hasta el 90% de la masa seca celular (Marchessault, 1996), bajo condiciones desbalanceadas de crecimiento, como un exceso de fuente de carbono disponible y limitación de por lo menos un nutriente esencial para la multiplicación celular (Sanchez et. al.,

2003)

Estas moléculas de PHA presentan, una vez extraídas de la célula, propiedades similares a algunos plásticos comunes, como el polipropileno. El origen bacteriano del PHA hace de este poliéster un material natural, y por ende, muchos microorganismos como bacterias y hongos han desarrollado la capacidad de degradar estas moléculas para usarlas como fuente de carbono; aparte de esta biodegradabilidad, el PHA es reciclable como los termoplásticos petroquímicos (Poirier et. al., 2001).

Es grande la cantidad de microorganismos productores de PHA; entre los más estudiados se encuentran Ralstonia eutropha, Methylobacterium y especies del

género Pseudomonas (P. denitrificans, P. putida, P. oleovorans, P. aeruginosa).

Existen también otras especies menos estudiadas, como Agrobacterium, Actinobacillus, Azotobacter, Rhodobacter y Sphaerotilus. (Madison y Huisman,

1999).

económica y muchos de los ácidos grasos constituyentes de los aceites vegetales son insaturados, por lo que pueden funcionar como precursores de monómeros insaturados que son incorporados al polímero, lo que es esencial para algunas modificaciones químicas (Silva-Queiroz, 2003).

La actual preocupación por la polución ambiental causada por los plásticos petroquímicos descartados, ha dado mayor ímpetu al estudio de la producción y degradación de PHA en el ambiente natural (Anderson y Dawes, 1990). Por tal motivo, es de vital importancia la optimización de la producción de PHA, observando no solamente la productividad volumétrica y el contenido final de PHA en la célula (Hazenberg y Witholt, 1997), sino también el sustrato empleado, para obtener polímeros que presenten características deseadas y que sean de bajo costo. Dentro de las estrategias empleadas para el aumento de la productividad, se describen el uso de cepas mas productivas, la optimización de los medios de cultivo y el uso de fuentes de carbono de menor costo (Almeida et. al., 2004), una vez que la fuente de carbono puede contribuir

con 40% del costo de producción de este bioproducto (Choi y Lee, 1999).

Analizando este aspecto, los aceites vegetales se colocan como una buena alternativa de fuente de carbono, puesto que según Kahar et. al., (2004), el

rendimiento máximo teórico de conversión de aceites vegetales a PHA está en el orden de 1,00 g/g, comparado con el valor de conversión de sacarosa de 0,33 g/g, obtenido en la práctica industrial (Nonato et. al., 2001).

Adicional a ello, el empleo de aceites vegetales y mezclas de estos no sólo contribuye a una reducción en los costos de producción, sino que permite la obtención de polímeros con diferentes conformaciones, debido al metabolismo empleado por los linajes de Pseudomonas en la asimilación de los ácidos grasos

y la posterior biosíntesis del polímero, lo que permitiría mejorar las propiedades

2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 POLIHIDROXIALCANOATOS

2.1.1 Definición

Los Polihidroxialcanoatos (PHAs) son estructuralmente simples macromoléculas sintetizadas por muchas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Los PHAs son acumulados en gránulos (Figura 1) hasta niveles del 80% del peso seco de la célula y juegan un rol como material de reserva de energía, carbono y equivalentes reductores; al polimerizar intermediarios solubles a moléculas insolubles, la célula no sufre alteraciones de su estado osmótico y se evita así la pérdida de compuestos valiosos, con lo que las reservas de nutrientes permanecerán disponibles por un relativo bajo costo (Madison y Huisman, 1999). La formación de estas macromoléculas se da normalmente bajo condiciones de privación nutricional de elementos como N, P, S, O o Mg, en presencia de un exceso de fuente de carbono (Castro y Rendón, 2003).

La utilización de dicho polímero también es considerada una estrategia desarrollada por las bacterias para incrementar su supervivencia en ambientes cambiantes. Los PHA son utilizados como fuente de carbono y energía en condiciones de escasez de nutrientes, como fuente de carbono y energía para el enquistamiento (en Azotobacter) y la esporulación (en Bacillus), para la

degradación de compuestos tóxicos, como fuente de poder reductor (Almeida et. al., 2004; Anderson y Dawes, 1990) y como protección de la nitrogenasa de las

(Anderson y Dawes, 1990). Asimismo, los PHA han sido detectados como constituyentes de la membrana celular citoplasmática, en complejos con calcio e polifosfato o asociados a proteínas (Gomez y Bueno-Netto, 2001)

Figura 1: Gránulos de Polihidroxialcanoato acumulado en bacterias. (A). Azotobacter

chroococcum (Lenz y Marchessault, 2005). (B). Pseudomonas fluorescens (Lee et. al.,

2001)

2.1.2 Historia

El primer PHA descubierto fue el poli(3-D-hidroxibutirato) (PHB), un homopolímero que fue detectado en la especie Bacillus megaterium en el año

1927 (Lenz y Marchessault, 2005). Desde entonces, una larga variedad de PHAs con diferentes longitudes de cadena de carbonos y grupos R se han estudiado, con por lo menos 150 diversos componentes de PHA y por lo menos cinco diversos caminos biosintéticos diferentes (Rehm et al., 1998). Esta variabilidad

en la composición depende de la especificidad del sistema de polimerización, de la naturaleza del sustrato suministrado, así como de las rutas metabólicas que llevan a la formación de los monómeros (Silva-Queiroz, 2003).

Los procesos comerciales para la producción de PHAs fueron desarrollados inicialmente por W.R. Grace en los años sesenta y desarrollados mas adelante por Imperial Chemical Industries, ICI, en el Reino Unido entre los años setenta y ochenta. Desde los años noventa, Metabolix Inc. y Monsanto han sido las

fuerzas impulsoras tras la explotación comercial de los polímeros de PHA en Estados Unidos (Castro y Rendón, 2003). Actualmente, existen 4 marcas: Biopol™ (copolímero de hidroxibutirato e hidroxivalerato), Biomer™ (homopolímero de hidroxibutirato), Nodax™ (copolímero de hidroxibutirato e hidroxihexanoato) y Biocycle™ (homopolímero de hidroxibutirato, copolímero de hidroxibutirato e hidroxivalerato) (Lemos et. al., 2006). En Latinoamérica, este

biopolímero viene siendo producido por la empresa brasileña PHB Industrial S.A. desde el año 2000, con capacidad inicial de 50 toneladas/año e ya en fase de ampliación (Nonato et. al., 2001).

Recientemente, copolímeros de 3HB y 3-hidroxialcanoatos de cadena media (3HAmcl) han sido objeto de diferentes patentes presentadas por la empresa Procter & Gamble (Noda & Bond, 2002; Noda & Satkowski, 2003; Noda et al.,

2005; Hassan et al., 2006), los cuales son polímeros de gran interés, puesto que

poseen propiedades intermediarias entre PHAscl y PHAmcl, como alongamiento superior al 600% (Sudesh et al., 2000)

2.1.3 Estructura química

Estructuralmente, los PHA son polímeros lineales de (R)-3-hidroxiácidos en los

cuales el grupo carboxilo de un monómero forma un enlace tipo éster con el grupo hidroxilo del monómero siguiente (Figura 2). El radical R puede ser un átomo de hidrógeno o una cadena de hasta trece átomos de carbono, que puede contener instauraciones, cadenas cíclicas, grupos aromáticos e inclusive otros átomos como bromo, flúor o cloro (Almeida et. al., 2004).

Mas de 150 diferentes tipos de ácidos hidroxialcanoicos han sido identificados como constituyentes de PHA, cuando la bacteria es cultivada bajo condiciones limitadas de nitrógeno (Steinbüchel y Valentin, 1995).

Thakor et. al., 2005). Esta variación en la composición monomérica depende del

incorporación de la mayoría de los monómeros es necesario proporcionar un sustrato estructuralmente relacionado a estos (Silva-Queiroz, 2003).

Figura 2. Formula estructural de los polihidroxialcanoatos. (Romero, C. 2006)

Los PHA pueden ser divididos en dos clases de polímeros: polímeros de cadena corta o PHAscl (“short chain length”), conteniendo ácidos 3-hidroxibutírico (3HB) y 3-hidroxivalerico (3HV), y polímeros de cadena media o PHAmcl (“medium chain length”), que contienen monómeros de C6 (3-hidroxihexanoato) a C14 (3-hidroxitetradecanoato) (Hazenberg y Witholt, 1997). Esta diferencia parece deberse a la PHA sintasa de los microorganismos, que puede ser dividida en dos tipos distintos, a pesar que las bases moleculares para la especificidad de sustrato aun es desconocida (Gomez et al., 1996). Los PHAscl son encontrados

en Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Azotobacteri vinelandii, Azotobacter chrococcum y Methylobacterium organoplhilum entre otras (Choi y Lee, 1999),

mientras que los PHAmcl son encontrados en Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa y otras Pseudomonas fluorescentes (Silva-Queiroz,

2003).

2.1.4 Propiedades físicas

dureza, pero a su vez lo hace un material muy quebradizo. Su punto de fusión es relativamente alto (180oC), pero cerca del punto de degradación térmica (200oC) (Kim y Lenz, 2001).

Los polímeros de cadena corta son mas duros y quebradizos, mientras que los de cadena media son mas flexibles y tienen un punto mas bajo de cristalinidad, por lo que cada polímero tiene diferentes rangos de aplicación (Madison y Huisman, 1999). Los PHAscl son catalogados como termoplásticos, mientras que los PHAmcl, por tener menor cristalinidad y puntos de fusión menores son reconocidos como elastómeros (Poirier et al., 2001). Los PHAmcl tienen un

alongamiento para ruptura mayor que 100%, mientras que los PHAscl poseen un alongamiento para ruptura menor que 5%; la incorporación de unidades de 3HV al P3HB permite aumentar la maleabilidad y resistencia, alcanzándose valores de alongamiento para ruptura cerca de 50% (Sudesh et al., 2000).

2.1.5 Aplicaciones

Además de sus propiedades termoplásticas, los PHA poseen otras características interesantes: su biodegradabilidad y el hecho de que pueden ser producidos a partir de recursos renovables. Su producción fermentativa utiliza productos derivados de la agricultura como fuente de carbono. En la naturaleza los microorganismos son capaces de degradar los PHA, mediante la acción de PHA depolimerasas y PHA hidrolasas extracelulares, hasta CO2 y agua (Almeida et al, 2004).

Como se mencionó anteriormente, las diferencias estructurales de los polímeros producidos permiten diferentes lugares de aplicación. Los PHAmcl, debido a su baja rigidez, tienen aplicaciones potenciales en películas medicas y dispositivos especiales (Sánchez et al., 2003), como transportadores de fármacos, suturas

otras aplicaciones estudiadas, especialmente para polihidroxibutirato-co

-hidroxivalerato (P3(HB-co-3HV), un copolímero de PHAscl, hay tecnicas de

microencapsulación para la liberación controlada de drogas y otros agentes activos tales como albúmina de suero bovina, hormona folículo estimulante y tionicotinamida para el control de la enfermedad de Chagas (Silva-Queiroz, 2003).

También se han empleado en aplicaciones de moldeado, en particular en embalajes de productos de consumo como botellas, recipientes para cosméticos, bolígrafos, y palos de golf (Madison y Huisman, 1999) (Figura 3). Adicional a su potencial como material plástico, los PHA sirven como precursores quirales para la síntesis de compuestos ópticamente activos; estos compuestos son usados como portadores biodegradables para dosificación a largo plazo de insecticidas y herbicidas y son usados como materiales osteosintéticos en la estimulación del crecimiento de huesos, debido a sus propiedades piezoeléctricas (Khanna y Srivastava, 2005)

2.1.6 Biosíntesis

Los pasos individuales para la biosíntesis de PHB han sido estudiados en detalle para algunas bacterias, teniendo en cuenta 3 enzimas de vital importancia en dicho proceso (Castro y Rendón, 2003):

2.1.6.1 ββββ-Cetoacil-CoA tiolasa: cataliza el primer paso en la formación del

P(3HB). Se dividen en dos grupos dependiendo en la especificidad de sustrato. El primer grupo consiste en tiolasas con una amplia especificidad por el β

-ketoacil-CoAs en un rango de C4 a C16 (Castro y Rendón, 2003). Esta clase de enzimas están involucradas principalmente en la degradación de ácidos grasos y están localizadas en el citoplasma de procariotas y en mitocondrias y peroxisomas de células vegetales y de mamíferos (Madison y Huisman, 1999)

El segundo tipo de β-Ketoacil-CoA tiolasas esta considerada como biosintética y

tiene un estrecho rango de especificidad por el tamaño de la cadena, de C3 a C5; estas tiolasas biosintéticas están especializadas para una variedad de roles, como formación de cuerpos ketónicos y biosíntesis de isoprenoides y esteroides (Madison y Huisman, 1999).

2.1.6.2 Acetoacetil-CoA reductasa: esta enzima es una (R)-3-hidroxiacil-CoA

deshidrogenasa y cataliza el segundo paso en la biosíntesis del p(3HB), convirtiendo el acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA (Castro y Rendón, 2003). Esta enzima, junto con la P(3HB) polimerasa, estimulan la reacción de condensación, puesto que la tiolasa tiene preferencia por la ruptura tiolítica, lo cual ocurre en dirección opuesta a la biosíntesis de P(3HB); sin embargo, bajo condiciones de acumulación de P(3HB), la tiolasa actúa contra su dirección termodinámicamente favorable, cuando la acetoacetil-CoA reductasa reacciona, la cual necesita de equivalentes reductores en forma de NADPH, por lo cual la disponibilidad de estos equivalentes es considerada la fuerza directriz de la formación de P(3HB) (Madison y Huisman, 1999).

2.1.6.3 P(3HB) Polimerasa: es la tercera enzima involucrada en la biosíntesis de P(3HB). La actividad de polimerización de esta enzima se basa en la formación de enlaces éster con un residuo de cisteína como sitio activo. Se ha descubierto que la polimerasa se encuentra en estado hidrofílico e hidrofóbico, por lo que se supone que la evolución ha seleccionado enzimas que sean catalíticamente eficientes cuando se presenten problemas relacionados con la “superficie-zona hidrofóbica-proteína”. La gran variedad de microorganismos productores de PHA representaría un vasto espectro de condiciones intracelulares en donde estas enzimas tendrían que haberse adaptado; esto explicaría el bajo nivel identidad total de secuencias dentro de las diferentes PHA polimerasas (Madison y Huisman, 1999). Se presume también que el rol de transferencia de monómeros en la cadena, hecho por la PHA polimerasa, debe ejercer algún control en el peso molecular del polímero producido, lo cual es una característica típica de cada microorganismo (Anderson y Dawes, 1990)

2.1.6.4 Formación de gránulos:

Los gránulos tienen un diámetro típico entre 0,2 y 0,5 µm y poseen una

proteínas, representando el 0,5 y el 2%, respectivamente, del peso del gránulo. Parece que el número de gránulos por célula es fijado en los estados tempranos de la acumulación del polímero, y durante la acumulación, la célula pierde su conformación típicamente cilíndrica para acomodar polímero adicional, hasta el punto en que la síntesis de PHA disminuye. El cese en la acumulación de polímero puede deberse a la cantidad acumulada, puesto que al alcanzar su porcentaje máximo de reserva, la PHA polimerasa permanece activa, lo que sugiere que constricción física opera e impide que la célula acomode más polímero dentro de ella, a pesar de la disponibilidad de sustrato y de la polimerasa activa (Anderson y Dawes, 1990).

La formación de los gránulos puede seguir 4 pasos (Figura 4): 1) la polimerasa soluble actúa con concentraciones cada vez mayores de 3-hidroxibutiril-CoA en el citoplasma. Durante la fase lag, oligómeros de hidroxibutiril (HB) son formados

y se mantienen unidos con la enzima. 2) Estos oligómeros de HB forman micelas que aumentan en tamaño e hidrofobicidad. Consecuentemente, estas partículas proveen una unión de dos fases, con la polimerasa en la interfase. 3) La enzima entonces procede rápidamente con la síntesis de P(3HB) dentro del gránulo en crecimiento, la cual precisa de una superficie disponible. 4) Eventualmente las micelas coalescen formando grandes gránulos que pueden ser fácilmente visualizados en el microscopio de contraste de fases (Madison y Huisman, 1999)

Figura 4. Mecanismo propuesto para la formación de gránulos de PHA. (Madison y Huisman, 1999)

2.1.7 Otras rutas biosintéticas

Debido a la gran variedad de microorganismos que producen PHA y que viven en diferentes ambientes y con diferentes fuentes de carbono, la ruta biosintética que envuelve las enzimas tiolasa, reductasa y polimerasa no es la única empleada.

2.1.7.1 Biosíntesis de PHAscl (Madison y Huisman, 1999)

La biosíntesis de ese grupo de PHA involucra dos rutas metabólicas diferentes, dependiendo del sustrato empleado; la primera está mediada por el uso de monómeros generados durante la oxidación de ácidos grasos, como el enoil-CoA, por lo que no implica a las enzimas tiolasa y reductasa. Se produce PHA principalmente con monómeros de 3-hidroxivalerato (3HV), pero también se encuentran pequeñas cantidades de 3HB.

2.1.7.2 Biosíntesis de PHAmcl

La biosíntesis de PHAmcl posee varias rutas metabólicas, que son esquematizadas en la figura 5:

Figura 5: Vías metabólicas involucradas en la síntesis de PHAmcl. (Park et al., 2006)

2.1.7.2.1 Biosíntesis a partir de carbohidratos: cuando el microorganismo es cultivado con carbohidratos como única fuente de carbono, el PHA producido está compuesto principalmente por monómeros de C10 y C8. Por tal motivo, se sugiere que estos monómeros son derivados de intermediarios de la biosíntesis de ácidos grasos a partir de glucosa, lo cual es confirmado por experimentos de inhibición: cuando la cerulenina (inhibidor de la biosíntesis de ácidos grasos) es adicionado a cultivos celulares, no se forma PHA a partir de glucosa, aunque sí hay producción a partir de ácidos grasos. (Madison y Huisman, 1999). Se forman moléculas de 3-hidroxiacil a partir de la condensación de moléculas de Acetil-CoA, via malonil –Acetil-CoA, para formar el hidroxiácido que será incorporado al polímero, que es trasferido de la ACP (Acyl Carrier Protein) para la coenzima A

por la transacilasa, para luego realizar la reacción de polimerización catalizada por la PHA sintasa (Rehm et. al., 1998)

2.1.7.2.2 Biosíntesis a partir de ácidos grasos: la composición de estos polímeros está directamente relacionada con la estructura de la fuente de carbono, lo cual sugiere que la ruta biosintética es una rama directa de la oxidación de ácidos grasos. Cuando la fuente de carbono es de C6 a C12, los monómeros de PHA tienen la misma longitud que el sustrato disponible, o tienen dos, cuatro o seis átomos menos. Cuando se administran ácidos grasos de C13-C18, la composición del PHA no es relacionada con la longitud del sustrato, puesto que el monómero más largo insertado tiene 11 o 12 carbonos, aunque es dependiente para configuraciones como insaturaciones. Cuando se emplean los ácidos heptadecanoico u octadecanoico, no se observa acumulación de PHA, puesto que esta fuente de carbono no permite el crecimiento de los microorganismos, aunque Ballistreri et. al., (2001) lograron obtener acumulación

de PHA a partir de ácido eicosanoico. Como los intermediarios de la oxidación de ácidos grasos presentan una conformación (S)-3-hidroxiacil-CoA, se necesita

un paso adicional para transformarlos a (R)-3-hidroxiacil-CoA, puesto que la

polimerasa para PHAmcl presenta especificidad para este tipo de monómeros (Madison y Huisman, 1999); por lo tanto, enzimas como una (R)-específica

enoil-CoA hidratasa, una hidroxiacil-enoil-CoA epimerasa y una 3-cetoacil reductasa han sido postuladas para unir la β-oxidación con la biosíntesis de PHA (Hoffmann y

Rehm, 2004).

2.1.8 Detección y cuantificación de PHA

La cuantificación de polímeros del tipo polihidroxialcanoato, se lleva a cabo en la mayoría de los estudios reportados mediante cromatografía de gases, empleándose un patrón interno de ácido benzoico, el cual establece los tiempos de retención mediante los cuales se informa el tipo de estructura y la cantidad de carbonos que puede tener (Castro y Rendón, 2003). Sin embargo, para usar la cromatografía de gases es necesario realizar una depolimerización del PHA una vez extraído de la célula, formando metil-ésteres ó propil-ésteres, dependiendo si el método empleado es metanólisis (Braunegg et. al, 1978) o propanólisis (Riis

y Mai, 1988), respectivamente.

Se ha empleado el análisis espectroscópico con Resonancia Magnética Nuclear con 13_{C (}13_{C-NMR) para el estudio de la estructura de PHA. Sin embargo, para} PHA con monómeros saturados e insaturados de cadena larga la 13_{C-NMR es} mucho mas complicada por la equivalencia de los cambios químicos de los átomos de carbono y los patrones protónicos del espectro de NMR, lo que dificulta la determinación estructural (Lee y Choi, 1995)

2.2 GENERO Pseudomonas

aminoácidos y otros, pero normalmente no pueden descomponer polímeros en sus componentes monómeros (Moreno y Rios, 1995)

Las Pseudomonas son particularmente ricas en lipasas catalíticamente útiles.

Enzimas de este tipo en las especies P. fluorescens y P. aeruginosa presentan

hidrólisis de éster enantioselectiva, lo cual las hace altamente procuradas en las reacciones de biotransformación y reacciones de esterificación; adicional a ello, preparados de estas enzimas no requieren de cofactores para su uso. Las biotransformaciones también están siendo favorecidas por el uso de cepas recombinantes, en las que este género bacteriano también presenta grandes ventajas: los genes de Pseudomonas son frecuentemente más eficientes en su

transcripción y trasducción en las especies originales que en hospederos heterólogos. Además, pseudomonadas, mucho más que otros microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos, se acomodan mejor para su uso en sistemas acuosos/solventes por su inherente resistencia a solventes; esta tolerancia a compuestos tóxicos puede servir para almacenar enzimas a partir de DNA recombinante que sean eficaces en convertir sustratos insolubles en agua, tales como los ácidos grasos (Montie, 1998)

Los primeros reportes de la formación de PHAmcl por especies de

Pseudomonas fueron de la especie P. oleovorans, describiendo la producción

del polímero conteniendo 3-hidroxioctanoato por la asimilación de ácidos grasos de cadena media y cadena larga; esta capacidad también es expresada para el crecimiento en alcanos (Kessler y Palleroni, 2000). Sin embargo, la síntesis de PHAmcl es ahora considerada pertinente no sólo para P. oleovorans, sino

también común para todas las Pseudomonas fluorescentes (Ballistreri et. al.,

2001)

Una característica fascinante de muchas especies de Pseudomonas como

(S)-3-Hidroxiacil-CoA fabD

Acil-CoA

3-Cetoacil-CoA _{ββββ-oxidación}Via de la Enoil-CoA Ácidos grasos

Acil-CoA deshidrogenasa

3-hidrxiacil-CoA desidrogenasa

Enoil-CoA hidratasa β-cetotiolasa

acil-CoA sintetasa

Acetil-CoA

fenoxilos, olefinas y ésteres, cuando son cultivados en sustratos conteniendo las estructuras químicas correspondientes. Los PHA que contienen grupos funcionales son de gran interés, puesto que estos grupos pueden mejorar las propiedades físicas de los PHAmcl. Además, algunos grupos funcionales pueden ser modificados por reacciones químicas para obtener más grupos útiles, que pueden extender la potencial aplicación de los PHA como polímeros biodegradables y biomateriales funcionales para aplicaciones biomédicas (Kim

et al., 2000)

2.3 METABOLISMO DE ACIDOS GRASOS

Muchas bacterias pueden crecer en ácidos grasos de cadena larga, que son oxidados a acetil-CoA por una vía llamada β-oxidación (Figura 6).

Figura 6: Vía metabólica de la β-oxidación para la formación de Acetil-CoA a partir de

Esta vía consiste en una serie cíclica de cuatro reacciones, al final de las cuales el acil-CoA es cortado en moléculas con 2 carbonos, liberados bajo la forma de Acetil-CoA (White, 2000). El acetil-CoA producido a partir de la oxidación de ácidos grasos de cadena media y larga, y del catabolismo de ácidos grasos de cadena corta, puede servir como sustrato para la biosíntesis de novo de ácidos

grasos y fosfolípidos, o puede ser metabolizado por la vía del ciclo de Krebs, para servir como fuente de carbono y energía (Black y DiRusso, 1994)

Los ácidos grasos de cadena larga entran a la célula por un sistema de transporte auxiliado por proteínas. La proteína FadL se localiza en la membrana externa, donde actúa como un receptor de ácidos grasos y auxilia su paso a través de la membrana externa. La acil-CoA sintetasa es responsable por la activación de acido graso y su paso por la membrana interna; esta molécula activada (acil-CoA) es oxidada por las enzimas acil-CoA deshidrogenasas, sintetizadas a partir de los genes fadF y fadG. Estas enzimas presentan

especificidades diferentes, puesto que la codificada por el primer gen posee especificidad por acil-CoA de cadena media o larga, mientras que la codificada por el gen fadG presenta especificidad para acil-CoA de cadena corta. El

resultado de la oxidación es un enoil-CoA (acil-CoA insaturado en la posición 2) (Silva-Queiroz, 2003).

Los siguientes pasos en la β-oxidación de ácidos grasos están asociados a un

complejo multienzimático codificado por los genes fadA y fadB. En este complejo

se encuentran las enzimas enoil-CoA hidratasa, 3-hidroxiacil-CoA hidrogenasa y 3-β-cetoacil-tiolasa. Esta última enzima está codificada exclusivamente por el

gen fadA, mientras que las otras 2 son codificadas por el gen fadB

(Silva-Queiroz, 2003).

La hidratación del enoil-CoA por la enzima enoil-CoA hidratasa es estereospecífica. Cuando se hidrata el doble enlace trans- 2 solamente se

enlace cis- 2, pero el producto es entonces el D-isómero. Esta hidratación es el

preludio de la segunda reacción de oxidación, que convierte el grupo hidroxilo del carbono 3 en un grupo ceto y genera NADH, mediada por la enzima 3-hidroxiacil-CoA hidrogenasa, que es específica para el L-isómero del sustrato hidroxiacilo (Stryer, 1998).

Las reacciones precedentes han oxidado el grupo metileno en el carbono 3 hasta un grupo ceto. La etapa final es la escisión del 3-cetoacil-CoA por el grupo tiol de una segunda molécula de CoA, que produce acetil-CoA y un acil-CoA acortado en dos átomos de carbono. Esta escisión tiolítica es catalizada por la

3-β-cetoacil-tiolasa. A diferencia de las acil-CoA deshidrogenasas, la β

-cetoacil-tiolasa tiene una especificidad muy amplia con respecto a la longitud del grupo acilo (Stryer, 1998).

Los ácidos grasos insaturados, presentes en la mayoría de aceites vegetales, requieren de dos nuevas enzimas, una isomerasa y una reductasa, para su total degradación. Esta degradación sigue los pasos normales de la β-oxidación, pero

al llegar a la instauración se requiere de las enzimas adicionales, puesto que la enzima encargada de la primera oxidación, la acil-CoA deshidrogenasa, no puede tomar como sustrato un cis- 3-enoil-CoA, por lo cual la isomerasa

convierte este doble enlace en un doble enlace trans- 2, logrando así que la

oxidación del ácido graso continúe normalmente. Por otra parte, cuando el ácido graso posee instauraciones en carbonos pares, luego de la acción de la acil-CoA deshidrogenasa se produce el 2,4-dienoil-intermediario, que no es un sustrato adecuado para la siguiente enzima de la vía de la β-oxidación. El obstáculo se

salva por la acción de la 2,4-dienoil-CoA reductasa, una enzima que usa NADPH para reducir el 2,4-dienoil-intermediario en cis- 3-enoil-CoA; la isomerasa lo

convierte entonces en forma trans, un intermediario habitual de la β-oxidación

Finalmente, cabe resaltar que el uso de lípidos como fuente de carbono involucra ruptura de triglicéridos por acción de lipasas bacterianas, formando glicerol y los ácidos grasos correspondientes. El glicerol es fosforilado y oxidado a dihidroxiacetona fosfato, el cual es un intermediario de la glicólisis, para convertirse posteriormente a ácido pirúvico y finalmente a Acetil-CoA, que puede tener 3 destinos: el ciclo de Krebs, la biosíntesis de PHA y la biosíntesis de ácidos grasos (Romero, 2006).

La síntesis de PHA ocurre luego de la incorporación tanto de intermediarios en el metabolismo de los ácidos grasos precursores como de sus derivados (Steinbüchel y Hein, 2001). Por tal motivo, luego de la β-oxidación de los ácidos

grasos administrados como sustrato, se espera observar una incorporación de monómeros en el PHA relacionados a la fuente de carbono adicionada, con las correspondientes estructuras químicas (Kim, et. al., 2000); estos monómeros

Tabla 1: Monómeros esperados como constituyentes en la formación de PHA, generados por la b-oxidación de ácidos grasos

Monómeros esperados Ácido

graso _{C6 C8 C10 C12}

C8 Octanóico 3HHx 3HO - -

C10 Decanóico 3HHx 3HO 3HD -

C12 Dodecanóico 3HHx 3HO 3HD 3HDd

C14 Mirístico 3HHx 3HO 3HD 3HDd

C16 Palmítico 3HHx 3HO 3HD 3HDd

C16:1 9-hexadecenóico 3HHx 3HO 3HD 3HDd∆∆5∆∆

C18 Esteárico 3HHx 3HO 3HD 3HDd

C18:1 Oleico 3HHx 3HO 3HD 3HDd

C18:2 Linoleico 3HHx 3HO 3HD 3HDd∆∆6∆∆

C18:3 Linolénico 3HHx 3HO 3HD∆∆∆∆7 3HDd∆∆6,9∆∆

C18:3 Alfa-oleosteárico 3HHx 3HO 3HD∆∆∆∆5 3HDd∆∆5,7∆∆

C18:1 Ricinolêico 3HHx 3HO 3HD/4HD 3,6dHDd

C20 Eicosanóico 3HHx 3HO 3HD 3HDd

3HHx: hidroxihexanoato. 3HO: hidroxioctanoato. 3HD: hidroxidecanoato. 3HDd: 3-hodroxidodecanoato. 3HDd∆5: 3-hidroxi-5-dodecenoato. 3HDd∆6:

3-hidroxi-6-dodecenoato. 3HD∆7: 3-hidroxi-7-decenoato. 3HDd∆6,9: 3-hidroxi-6,9-dien-dodecanoato.

3HD∆5: 3-hidroxi-5 decenoato. 3HDd∆5,7: 3-hidroxi-5,7-dien-dodecanoato. 4HD:

3. FORMULACION DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION

Debido al aumento de la población mundial, se ha generado una creciente demanda de productos derivados del petróleo, lo cual contrasta bruscamente con el agotamiento de este recurso no renovable y su consecuente aumento del precio en el mercado internacional, actualmente encima de US$ 50/barril (www.mem.gob.ve/preciopetroleo). Ante esta perspectiva, las investigaciones que involucren el descubrimiento y mejoras en la producción de productos que logren reemplazar a los derivados de este combustible fósil, han tomado un nuevo impulso, y los polihidroxialcanoatos aparecen como una alternativa altamente prometedora.

Por otra parte, la gran cantidad de residuos generados por la actividad humana, ha suscitado una preocupación extendida por el manejo y disposición de los desechos, de los cuales los plásticos están entre los que tienen más impacto ambiental por su lenta degradación y en muchos casos su difícil disposición.

Sin embargo, el precio de los bioplásticos sigue siendo demasiado alto como para que puedan desplazar a los plásticos tradicionales, sumado al hecho que algunos pueden no cumplir con las expectativas de aplicación por sus propiedades mecánicas. Debido a esto, es necesario diseñar estrategias para obtener polihidroxialcanoatos a un costo similar y que logren satisfacer las exigencias de los procesos a los que serían sometidos para su uso.

El uso de sustratos como los aceites vegetales, muestra una perspectiva positiva para solucionar los costos de producción y las exigencias en las propiedades de los polímeros, puesto que estos sustratos permiten reducir los costos de elaboración del polímero, por ser Latinoamérica una fuente de gran abundancia vegetal. Según Akiyama et al. (2003), los aceites vegetales podrían representar

factores de producción de PHA mayores, cuando son comparados con los factores de producción usando glucosa o sacarosa como fuente de carbono, puesto que los aceites contienen mayor cantidad de carbono que los azúcares, reduciendo así los costos de producción y consumo de energía.

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL.

Determinar el efecto producido por el suministro de diversos aceites vegetales y mezclas de estos, en la biosíntesis y composición del biopolímero producido por dos linajes bacterianos del género Pseudomonas, (P. putida IPT 046 y P. aeruginosa IPT 171) conocidas por su producción de este polímero.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Evaluar cuantitativamente la formación de PHA por Pseudomonas putida IPT-046 y Pseudomonas aeruginosa IPT-171 mediante cromatografía

gaseosa con aceites vegetales como única fuente de carbono.

• Determinar los diferentes monómeros generados a partir de los aceites vegetales utilizados como sustrato (tungue, mamona, girasol, coco, linaza, palma, arroz, canola, maíz, soya y algodón) mediante cromatografía gaseosa.

• Establecer las rutas metabólicas implicadas en la degradación de los ácidos grasos y su acumulación o no dentro del PHA, mediante un análisis de flujo metabólico.

5. MATERIALES Y METODOS

El estudio fue realizado en los laboratorios del Centro Tecnológico de Procesos y Productos del Instituto de Pesquisas Tecnológicas del Estado de São Paulo, Brasil (IPT). La metodología empleada para el presente estudio se ve esquematizada en la figura 7.

Figura 7: Actividades para la determinación de producción de PHA en linajes IPT 046 e IPT 171 a partir de aceites vegetales

Linajes IPT 046 e IPT 171 en glicerol

Recuperación de linajes en Agar nutriente

Siembra en caldo nutriente

Siembra en medio mineral con los diferentes aceites vegetales y/o mezclas

Medición pH

Suspensión células en solución salina con tween 0,1m_/ v

Centrifugación Centrifugación

Suspensión células en agua destilada

Liofilización

Propanólisis Filtración

Secado

Determinación masa seca

5.1. RECUPERACIÓN DE LOS LINAJES

Se tomaron muestras conservadas en glicerol de cada linaje del banco de cepas de los laboratorios del IPT, que fueron aisladas de suelos de plantaciones de caña de azúcar (Gómez et. al., 1996).

Los linajes fueron reactivados por estriamiento en placas de Agar Nutriente (Anexo 1) y cultivados por 72h a 30o_{C. Colonias aisladas de cada cultivo se} utilizaron para inocular 125mL de Caldo Nutriente, e incubadas por 24h (30o_C, 150rpm). Una vez incubadas, se tomaron muestras para analizar la axenidad del cultivo por medio de una coloración de Gram.

5.2. PRODUCCIÓN DE PHAmcl A PARTIR DE ACEITES VEGETALES

Los aceites vegetales utilizados se observan en la Tabla 2. También se pueden observar las diferentes mezclas de los aceites vegetales que fueron empleadas en el estudio, las cuales fueron deducidas teniendo en cuenta la cantidad de los respectivos ácidos grasos en cada aceite citados por literatura (Silva-Queiroz, 2003; Vieira et al., 2005), para obtener diferentes

concentraciones y poder de esta manera correlacionar la formación de los monómeros de PHA, con la cantidad de sustrato relacionado (ácido graso) que es adicionado al cultivo (Gómez, J.G.C., 2006).

Tabla 2: Composición de los aceites vegetales a utilizar y las mezclas de estos, de acuerdo con los datos de literatura (Silva-Queiroz, 2006)

C12: ácido láurico. C14: ácido mirístico. C16: ácido palmítico. C18: ácido esteárico. C18:1: ácido oléico. C18:1A_{: ácido ricinoléico. C18:2: ácido linoleico. C18:3: ácido}

linolénico. C18:3A_{: ácido}

α-eleosteárico. *Las mezclas de aceite de linaza y de algodón

son para tener diferentes concentraciones de ácido linolénico

5.3. TRANSESTERIFICACIÓN BF3 (Trifluoruro de boro) PARA ACEITES VEGETALES

Para comprobar la composición de los aceites empleados en este estudio, se realizó el método descrito por Williams (1984), una preparación de ésteres metílicos para análisis de ácidos grasos por cromatografía en fase gaseosa.

Se pesaron 0,3g de cada uno de los aceites empleados en beaker de 50mL, a los cuales se les adicionó 6mL de solución de NaOH al 20% en metanol y fue

PORCENTAJE DE ACIDOS GRASOS (%m/m) ACEITE VEGETAL

O MEZCLA _{C12 C14 C16 C18 C18:1 C18:1}A _{C18:2 C18:3 C18:3}A

Tungue 4,0 1,0 8,0 4,0 3,0 80

Mamona 1,2 1,0 3,3 89,2 3,6 0,2

Girasol 0,1 7,0 3,3 14,3 75,4

Linaza 5,5 3,5 19,1 15,3 56,5

Palma 50,9 18,4 8,7 1,9 14,6 1,2

Arroz 17,5 1,3 39,9 39,1 0,3

Canola 5,4 1,6 56,3 25

Maíz 11,5 2,2 26,6 58,7

Soya 10,5 3,2 22,3 54,5 8,3

Algodón 1,0 25,0 2,8 17,1 52,7

Coco 48,2 16,6 8,0 3,8 5,0 2,5

Mamona (20%), Palma (80%) 35,4 3,8 33,5 8,3

Arroz (50%), Maíz (50%) 14,5 1,8 33,3 48,9

Palma (15%), Canola (85%) 5,9 1,6 50 21,4

Palma (50%), Soya (50%) 9,8 2,7 19,2 33,2 5,0

Girasol (80%), Soya (20%) 8,4 3,3 17,5 67,04 3,3

Linaza (25%), Algodón (75%)* 14,5

Linaza (40%), Algodón (60%)* 22,6

Linaza (50%), Algodón (50%)* 28,3

Linaza (70%), Algodón (30%)* 39,6

agitado y calentado cada beaker en baño de maria por 5 minutos. Se agregaron 8mL de BF3-metanol al 20% y esta mezcla se hizo hervir por 3 minutos, luego de enfriar a temperatura ambiente, se adicionaron 5mL de éter de petróleo y 3mL de solucón saturada de NaCl, descartando el precipitado formado y recuperando el sobrenadante, al cual le fue agregado sulfato de sodio para retirar agua residual. Finalmente, la fracción etérea resultante fue analizada por cromatografía gaseosa, en un cromatógrafo gaseoso Hewlett Packard HP 6890 Series equipado con una columna HP-20M, con 1mL/min de nitrógeno como fase móvil (Silva-Queiroz, 2006).

5.4. DETERMINACION MASA SECA CELULAR

Se tomaron 10mL de cada cultivo y se centrifugaron 10min (10000rpm, 10o_C). Se resuspendió el pellet en solución salina con Tween 0,1%m_/

v y nuevamente se centrifugó por 10min (10000rpm, 10oC); se suspendió en agua destilada y se filtró en membranas de poro 0,45µm (Millipore). La membrana junto con las

células se secó por 4h a 100oC; luego de ser retiradas del horno, este conjunto permaneció 20min en desecador y, después de este período, se determinó la masa seca celular (MS) por la siguiente ecuación:

1000

x

VOL

UM

MM

MMC

MS

₌

−

+

Ecuación 1: Determinación de masa seca.

En donde:

MMC: Masa de la membrana y células después del secado (g) MM: Masa de la membrana (g)

5.5. CARACTERIZACIÓN DEL POLÍMERO

5.5.1. Liofilización

Se tomaron 10mL de cada cultivo y se centrifugaron 10min (10000rpm, 10oC). Se resuspendió el pellet en solución salina con Tween 0,1%m/v y nuevamente se centrifugó por 10min (10000rpm, 10o_{C); se suspendió en 2mL de agua destilada} y fue congelado a -20o_{Cpara su posterior liofilización, que fue realizada en un} equipo Labconco modelo 5-75050/75150 con cámara de control de temperatura durante 24h (Silva-Queiroz, 2003).

5.5.2. Cantidad y composición del PHA

Para determinar la cantidad y la composición del PHA, se realizó el método de propanólisis descrito por Riis y Mai (1988), en donde se tomaron 20mg de células liofilizadas, se les adicionaron 2mL de solución de ácido clorhídrico (HCl) 0,1N en propanol (1:4v_/

v), 2mL de 1,1-dicloroetano (solvente que extrae el polímero) y 200µL de solución de 40g/L de ácido benzoico en propanol, como

patrón interno. Los tubos fueron cerrados, agitados y sometidos por 3 horas a 100oC en baño de María, agitándolos después de los primeros 30 minutos. Se enfriaron a temperatura ambiente y se adicionaron 4mL de agua Milli-Q, agitando vigorosamente por 30seg. La fase acuosa (superior) se descartó y la fase orgánica (inferior) que contiene los propil-ésteres fue analizada con un cromatógrafo gaseoso Hewlett Packard HP 6890 Series equipado con una columna HP-5 (Gomez et al., 1996), con ácido benzóico como patrón interno y

polímeros producidos por P. oleovorans fueron utilizados como patrones

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Determinación de la composición de los aceites vegetales

Para confirmar la composición de los ácidos grasos contenidos en los aceites, estos fueron analizados por cromatografía gaseosa. Los resultados son presentados en la Tabla 3.

Comparando las tablas 2 y 3, se puede observar que la composición de ácidos grasos obtenida para los aceites de algodón, arroz, coco, girasol, maíz, soya y palma, a pesar de no ser exactamente iguales a los datos de literatura, presentaron grande semejanza.

Para el aceite de canola, se observó una grande diferencia entre los datos de la literatura y los resultados del análisis. Se esperaba encontrar un alto contenido de acido oleico (aproximadamente 50%) y un contenido de acido linoleico de 25%; sin embargo, la composición de ácidos grasos fue mucho mas semejante a aquella encontrada en el aceite de soya o maíz, es decir, cerca de 25% de ácido oleico y 50% de acido linoleico.

en el acido linoleico a partir de la oxidación del acido linolenico (Schönemann et. al., 2006)

Para los aceites de mamona y tungue se esperaba encontrar dos componentes en cantidades elevadas que no estarían presentes en los demás aceites. En el caso del aceite de mamona, el pico más expresivo del análisis cromatográfico presentaba el mismo tiempo de retención el ácido linoleico. Así, fue interpretado que este pico correspondería al ácido ricinoléico, lo que impidió determinar la cantidad de ácido linoleico presente en la muestra. Adicional a ello, la cantidad de ácido ricinoléico detectada fue bastante menor que aquella esperada en la literatura, siendo detectado el ácido oleico en cantidades mucho mayores que las esperadas.

En el caso de aceite de tungue, el pico más expresivo del análisis cromatográfico presentaba el mismo tiempo de retención del ácido linolénico. De esta manera, fue interpretado que este pico correspondería al ácido α

-eleosteárico, lo que impidió determinar la cantidad de ácido linolénico presente en la muestra. Otro punto a tener en cuenta es que la cantidad de acido α

-eleosteárico detectada fue bastante menor que la esperada con base en la literatura (aprox. 80%) (Schönemann et. al., 2006), siendo detectados los ácidos

Composición de ácidos grasos de los aceites vegetales (% m/m)

Aceites octanóico decanóico Láurico Mirístico Palmítico Esteárico Oleico Ricinoleico Linoleico Linolênico α-eleosteárico

Algodón 0,00 0,00 0,00 0,27 14,64 3,78 21,77 0,00 55,08 4,46 0,00

Arroz 0,00 0,00 0,00 0,00 16,79 3,96 36,99 0,00 39,77 2,49 0,00

Canola 0,22 0,26 4,05 1,55 11,60 3,97 20,65 0,00 51,32 6,38 0,00

Coco 2,21 2,63 43,15 16,32 9,68 3,71 18,94 0,00 3,33 0,04 0,00

Girasol 0,00 0,00 0,00 0,08 8,95 4,16 20,70 0,00 62,42 3,70 0,00

Linaza 0,00 0,00 0,00 0,00 11,29 3,26 21,29 0,00 57,30 6,86 0,00

Mamona 0,00 0,00 0,00 0,00 10,66 6,55 27,74 49,71 ? 5,35 0,00

Maíz 0,13 0,15 2,37 0,91 11,38 3,93 24,83 0,00 50,84 5,45 0,00

Palma 0,02 0,02 0,25 0,82 41,42 4,99 42,35 0,00 9,89 0,24 0,00

Soya 0,00 0,00 0,00 0,00 11,16 3,73 24,46 0,00 54,87 5,78 0,00

Los resultados obtenidos de la producción de polihidroxialcanoato son presentados en las tablas 4 y 5, para P. putida IPT 046 y P. aeruginosa IPT171

respectivamente. Fue observado una acumulación mucho más expresiva por el linaje IPT 046 que por el linaje IPT 171. Mientras que P. putida IPT 046 alcanzó

hasta 62% de PHA acumulado, los valores obtenidos con P. aeruginosa IPT 171

fueron inferiores a 20%.

Con el objetivo de analizar las diferencias en la eficiencia de incorporación de monómeros por los linajes bacterianos, fue correlacionado el valor obtenido de cada monómero a partir de un mismo aceite vegetal o mezcla (Figura 8). Se observó una tendencia de incorporación más eficiente de 3HO y 3HDd en el linaje IPT 171 en comparación con la IPT 406 (Figura 8B y 8D). Por otro lado, el sistema de biosíntesis de PHA de éste último linaje fue más eficiente en la incorporación de 3HHx, 3HD y 3HDd∆6 (Figura 8A, 8D y 8F). Estos resultados son confirmados por el experimento realizado por Silva-Queiroz (2003), en donde el linaje IPT 171 acumuló hasta 35% de 3HO, mientras que en el linaje IPT 046 el PHA contenía mayor cantidad de 3HD (hasta 50%), confirmado también por los ensayos realizados por Ballisteri et al. (2001). Para el

monómeros 3HD∆5 no se observó diferencia en la eficiencia de incorporación de estos monómeros por el sistema de biosíntesis de los dos linajes evaluados (Figura 8). En la figura 8-G, se observa una mayor eficiencia en la incorporación de monómeros insaturados por el sistema de biosíntesis de PHA de P. putida

IPT 046, comparada con P. aeruginosa IPT 171.

Los precursores para la biosíntesis de ácidos grasos vienen del Acetil-CoA generado de varios sustratos como carbohidratos. El Acetil-CoA es convertido a alonil-CoA, que es usado para alargar la cadena de carbonos del ácido graso en dos átomos (Sanchez et al, 2003); esta vía biosintética produce moléculas

alifáticas de (R)-3-hidroxiacil-ACP que son convertidas a R-3-hidroxiacil-CoA por una transacilasa codificada por el gen phaG, que actúa como sustrato para la

PHA polimerasa (Tobin y O’connor, 2005).

En el PHA producido a partir de aceite de tungue por el linaje IPT 046, fue observado un pico próximo a la región con monómeros insaturados de 12 carbonos, no detectado en los PHA producidos en los otros aceites. Una vez que el aceite de tungue presentaría el ácido α-eleosteárico, este pico fue

MSC – Masa Seca Celular; 3HB – 3-hidroxibutirato; 3HHx – 3-hidroxihexanoato; 3HO – 3-hidroxioctanoato; 3HD – 3-hidroxidecanoato; 3HDd – 3-hidroxidodecanoato; 3HDd∆5,7 – 3-hidroxi-5,7-dodecenoato;

3HDd∆5 – 3-hidroxi-5-dodecenoato; 3HDd∆6 – 3-hidroxi-6-dodecenoato. PHA – polihidroxialcanoato; Xr – biomasa residual.

Composición PHA (mol%)

ACEITES MSC (g/L) 3HB 3HHx 3HO 3HD 3HDd 3HDd∆5,7 3HDd∆5 3HDd∆6

PHA (%MSC)

Xr (g/L)

Algodón 2,90 0,9 5,0 22,6 45,3 9,1 0,0 3,1 14,0 48,63 1,49

Arroz50/Maiz50 5,40 0,8 5,6 23,7 48,8 8,1 0,0 3,6 9,4 43,20 3,07

Arroz 3,97 0,9 5,1 23,7 49,1 10,7 0,0 2,8 7,8 40,40 2,37

Canola 4,00 0,4 4,8 24,8 44,8 15,6 0,0 2,8 6,8 19,81 3,21

Coco 4,98 0,6 5,6 26,8 49,1 16,0 0,0 1,5 0,4 56,70 2,16

Girasol80/Soya20 5,25 1,3 6,5 25,8 47,4 6,2 0,0 2,8 9,9 36,20 3,35

Girasol 3,95 1,0 5,6 24,0 47,3 6,9 0,0 3,4 11,7 26,06 2,92

Linaza25/Algodón75 4,39 1,1 6,8 27,5 45,7 6,4 0,0 3,2 9,3 44,08 2,46

Linaza40/Algodón60 5,78 1,0 6,4 25,8 47,0 6,8 0,0 3,3 9,6 42,67 3,32

Linaza50/Algodón50 4,96 0,9 6,4 25,8 46,1 7,2 0,0 3,5 10,1 45,84 2,69

Linaza70/Algodón30 5,18 0,9 6,1 24,9 46,4 7,1 0,0 3,9 10,7 46,89 2,75

Linaza80Algodón20 5,05 1,0 6,5 26,4 46,9 6,2 0,0 3,3 9,7 45,32 2,76

Linaza 5,06 0,9 6,3 25,9 46,8 6,2 0,0 3,5 10,5 41,59 2,96

Mamona 3,06 1,3 6,9 31,4 53,9 3,0 0,0 1,6 N.D 41,54 1,79

Maiz 4,51 1,3 6,2 25,0 45,7 8,3 0,0 3,4 10,1 41,91 2,62

Palma15/Canola85 5,28 0,6 4,9 24,2 49,8 9,3 0,0 3,5 7,7 62,19 2,00

Palma50/Soya50 5,00 1,3 8,6 28,9 46,2 7,9 0,0 2,5 4,6 25,45 3,73

Palma80/Mamona20 5,12 0,7 5,8 26,2 50,2 12,6 0,0 2,1 2,4 49,12 2,61

Palma 5,29 0,7 5,8 25,7 51,0 13,1 0,0 1,8 1,9 52,34 2,52

Soya 3,02 1,0 6,2 25,0 46,0 7,2 0,0 3,5 11,0 42,88 1,73

Tabla 5: Producción de PHA por P. aeruginosa IPT 171 a partir de diferentes aceites vegetales y/o combinaciones de estos

MSC – Masa Seca Celular; 3HB – 3-hidroxibutirato; 3HHx – 3-hidroxihexanoato; 3HO – 3-hidroxioctanoato; 3HD – 3-hidroxidecanoato; 3HDd – 3-hidroxidodecanoato; 3HDd∆5,7 – 3-hidroxi-5,7-dodecenoato;

3HDd∆5 – 3-hidroxi-5-dodecenoato; 3HDd∆6 – 3-hidroxi-6-dodecenoato. PHA – polihidroxialcanoato; Xr – biomasa residual.

Composición PHA (mol%)

ACEITES MSC (g/L) 3HB 3HHx 3HO 3HD 3HDd 3HDd∆5,7 3HDd∆5 3HDd∆6

%PHA

(%MSC) (g/L) Xr

Algodón 2,58 0,88 3,60 33,27 45,64 9,86 0,00 2,33 4,42 11,51 2,29

Arroz50/Maiz50 2,69 0,83 3,28 30,51 48,96 9,46 0,00 3,16 3,80 14,15 2,31

Arroz 2,49 0,76 3,49 28,14 50,65 11,32 0,00 2,69 2,96 16,62 2,08

Canola 4,61 0,00 4,24 34,36 44,57 9,68 0,00 2,47 4,69 6,80 4,30

Coco 2,40 1,05 4,87 44,07 35,02 14,99 0,00 0,00 0,00 18,45 1,96

Girasol80/Soya20 2,61 0,88 3,75 30,69 46,73 9,06 0,00 3,28 5,59 13,79 2,25

Girasol 2,69 0,94 3,72 35,11 43,57 9,95 0,00 1,47 5,25 11,78 2,38

Linaza25/Algodón75 2,66 1,01 4,46 40,47 35,84 9,83 0,00 1,91 6,49 13,94 2,29

Linaza40/Algodón60 2,43 1,11 4,90 38,65 35,72 9,72 0,00 3,18 6,71 13,03 2,12

Linaza50/Algodón50 2,58 2,28 4,31 38,55 37,51 10,30 0,00 1,55 5,51 11,05 2,30

Linaza70/Algodón30 2,72 0,00 4,87 34,95 41,67 9,22 0,00 3,31 5,98 10,95 2,43

Linaza70/Algodón30 2,72 0,00 5,06 35,35 42,93 10,55 0,00 1,35 4,76 8,38 2,50

Linaza80Algodón20 2,67 1,12 4,38 38,92 37,53 9,19 0,00 2,87 5,99 12,53 2,34

Linaza 2,19 0,00 4,87 29,07 38,32 18,56 0,00 3,59 5,60 6,22 2,06

Mamona 2,03 0,00 3,88 33,39 49,17 9,39 0,00 2,82 1,35 10,76 1,81

Palma15/Canola85 2,30 0,76 3,63 35,12 41,24 11,90 0,00 3,11 4,23 11,04 2,05

Palma50/Soya50 3,28 0,77 3,73 33,64 46,67 10,99 0,00 2,10 2,08 15,25 2,78

Palma80/Mamona20 4,07 0,64 3,24 31,30 50,01 12,62 0,00 1,62 0,56 15,93 3,42

Palma 2,73 0,00 4,12 37,14 41,89 13,88 0,00 1,42 1,56 17,29 2,26

Soya 4,97 0,00 3,70 30,12 50,85 9,23 0,00 2,52 3,58 6,05 4,67

Figura 8: Comparación entre la composición de monómeros en los PHA sintetizados por

P. putida IPT 046 y P. aeruginosa IPT 171 a partir de un mismo aceite vegetal

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

IPT171 IP T 04 6 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

IPT171 IP T 0 46 3HD (mol%) 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0

IPT171 IP T 04 6 3HDd (mol%) 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0

IPT171

IP

T

04

6

3HDd∆∆∆∆5 (mol%)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

IPT171

IP

T

04

6

3HDd∆∆∆∆6 (mol%)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

IPT171

IP

T

04

6

3HA Insaturados (mol%)

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0

novo de ácidos grasos (Huijberts et al., 1992), siendo normalmente detectado en

los PHA producidos a partir de carbohidratos (Sanchez et. al., 2003), y también

de otras fuentes de carbono que son metabolizadas a acetil-CoA, como gluconato, acetato y etanol (Rehm et. al., 2001). Para todas las muestras de

aceite fue observada la presencia del monómero 3HDd∆5, probablemente proveniente de la síntesis de novo de ácidos grasos a partir del Acetil-CoA

derivado de la β-oxidación de los ácidos presentes en los aceites, o de la

oxidación del glicerol proveniente de los triglicéridos. En el PHA producido a partir de carbohidratos por P. putida IPT 046, fue detectado cerca de 4-5mol%

de este monómero (Sanchez et al., 2003). Utilizando aceite de tungue, se

observó un valor significativamente mayor de 3HDd∆5 tanto para el linaje IPT 046 como para el IPT 171, en comparación con los demás aceites; Este valor observado es mucho mayor del reportado a partir de carbohidratos como sustrato, lo que sugeriría la presencia de un ácido graso en el aceite de tungue que sería precursor de este monómero, una vez que la fracción molar obtenida no podría ser explicada considerando su síntesis solamente a partir del Acetil-CoA resultante de la β-oxidación y de la oxidación del glicerol. Tsuzuki y

colaboradores (2003) verificaron la presencia del ácido 9,11-octadecenóico en el hígado y lípidos plasmáticos de ratones alimentados con ácido α-eleosteárico; si

esa conversión también ocurriera en bacterias, la metabolización subsiguiente del ácido 9,11-octadecenóico por el ciclo de la β-oxidación llevaría a la formación

del monómero 3HDd∆5.

6.3 Influencia del pH

De acuerdo a lo propuesto anteriormente por Gomez et. al., (1997), el pH ideal

Después de 72h de cultivo, se midió la variación de pH. Los resultados están presentados en la Tabla 6

Tabla 6: Variación del pH luego de 72h de cultivo

Se observa que todos los cultivos de P. aeruginosa IPT171 presentaron un

descenso mayor en el pH comparados con los cultivos de P. putida IPT046. Esto

pudo repercutir en la formación de PHA, lo que se puede inferir por las bajas concentraciones de polímero acumulado por el linaje IPT 171, puesto que en el ensayo realizado por Silva-Queiroz (2003), se acumuló hasta 23% de PHA con este linaje, cuando el pH bajó hasta 5,7, mientras que en este ensayo la media de pH es de 5,083. El descenso del pH puede ser atribuido al consumo de los iones de amonio, bien como al metabolismo de los ácidos grasos libres provenientes de la ruptura de los triglicéridos por acción de las lipasas bacterianas (Romero, 2006).

LINAJE ACEITE Y/O

MEZCLA IPT171 IPT046

Soya 4,896 6,512

Canola 4,097 6,527

Arroz 4,606 6,532

Palma 4,779 6,543

Linaza 6,142 6,476 Girasol 5,021 6,668 Mamona 4,979 6,446 Algodón 4,892 6,503 Palma80/Mamona20 4,738 6,442 Arroz50/Maiz50 4,643 7,267 Palma15/Canola85 4,980 6,606 Palma50/Soya50 4,940 6,219 Girasol80/Soya20 4,644 7,288 Linaza25/Algodón75 5,304 6,563 Linaza40/Algodón60 5,288 6,392 Linaza50/Algodón50 5,154 6,326 Linaza70/Algodón30 5,146 6,387 Linaza80Algodón20 5,138 5,360 Tungue 6,638 6,493

Coco 5,960 6,572