Mecanismos implicados en la regulación de la localización nuclear de

La localización nuclear que presenta NapB durante la interfase parecía ser la consecuencia de su importación nuclear por parte de KapA, ya que como se ha demostrado anteriormente ambas proteínas interaccionan de manera específica. Con el fin de verificar esta hipótesis se decidió analizar el efecto del mutante kapA31 en la localización subcelular de NapB, ya que como se ha demostrado en el apartado 2.2 dicho mutante produce un defecto en la importación nuclear de la proteína quimérica NLS::GFP. Para ello se generó mediante cruzamiento génico una cepa que expresaba la proteína NapB::GFP en un fondo genético kapA31. Dado el carácter termosensible de la mutación kapA31, conidiosporas de una cepa napB::gfp silvestre y otra napB::gfp, kapA31 fueron germinadas a 25ºC y después transferidas a la temperatura restrictiva de 42ºC. La observación de las muestras al microscopio no mostró una diferencia significativa en la localización subcelular de NapB::GFP entre ambas cepas, observándose niveles similares de fluorescencia tanto en el núcleo como en el citoplasma en todas las fases del ciclo celular (Fig. II.23A). Estos resultados mostraban que la localización nuclear de NapB se mantenía aún en presencia de una forma mutante de la Importina α por lo que se podría pensar en una ruta alternativa de transporte llevada a cabo por otro transportador. Sin embargo, tampoco se podía descartar la posibilidad de que la mutación no mostrase fenotipo alguno en las condiciones de cultivo utilizadas ya que se han observado diferencias significativas en el grado de termosensibilidad de las cepas portadoras del alelo kapA31 en diferentes medios de cultivo.

Figura II.23: Efecto de KapA31 y la ausencia de la NLS en la localización nuclear de NapB. A) Efecto del alelo kapA31 en la localización subcelular de NapB. Los gráficos muestran

los niveles de fluorescencia del núcleo y del citoplasma en cada uno de los momentos del ciclo celular, en las dos cepas analizadas. A la derecha se muestra una foto representativa de cada caso. B) Igual que en A pero comparando la localización subcelular de NapB::GFP con NapB∆nls::GFP. Las medidas corresponden a la intensidad de los píxeles situados a lo largo de una linea virtual que atraviesa longitudinalmente la zona donde se sitúa el núcleo en cada imagen.

A la vista de estos resultados se decidió abordar el análisis de la localización subcelular de NapB alterando directamente la proteína en lugar del transportador. Los resultados obtenidos en los experimentos de “pull-down” han demostrado que la NLS del extremo C-terminal de NapB es necesaria para que se produzca la interacción con KapA. Por tanto, se decidió analizar la localización subcelular de una versión de NapB que careciera de esta NLS. Para ello, se generó una cepa que expresaba la proteína quimérica NapB∆nls::GFP. Siguiendo el protocolo de Yang et al. 67 _{se reemplazó la}

región codificante del locus napB por la construcción nap∆nls::gfp::pyrGA.fum _generada

mediante PCR de fusión y los transformantes obtenidos fueron analizados por Southern- blot para verificar que se había producido un correcto reemplazamiento génico. El análisis al microscopio de la nueva cepa generada reveló que la proteína NapB∆nls::GFP mostraba la misma localización subcelular que NapB::GFP, tanto en interfase como durante mitosis, observándose niveles de fluorescencia similares en todos los casos (Fig. II.23B). Estos resultados demostraban que la ausencia de la posible NLS de NapB no afectaba a su localización nuclear lo que podía ser debido a que la importación nuclear de NapB implicara otras regiones de la proteína o a que dicha localización nuclear no dependiera de la existencia de procesos de transporte activo, lo que explicaría también los resultados obtenidos con el mutante kapA31.

Con el fin de averiguar si la localización nuclear de NapB en interfase era dependiente de los procesos de transporte activo se decidió analizar la localización subcelular de la proteína en condiciones de ausencia de energía. Para ello se trató un cultivo de la cepa que expresa NapB::GFP con una mezcla de azida y fluoruro sódico y tras 10-15 minutos de incubación se procedió a observar las muestras al microscopio. La preferente localización nuclear de NapB::GFP en interfase no se vio afectada por la ausencia de procesos dependientes de energía en la célula (Fig. II.24A), lo que sugería que NapB estaba siendo retenido en el núcleo, posiblemente por su capacidad de interaccionar con la cromatina. Como controles del experimento se analizaron una cepa que expresa la forma PacC27, capaz de interaccionar con el DNA, una cepa que expresa la forma mutante de este factor transcripcional, Pro138Phe PacC27, incapaz de unirse al DNA, así como la localización de la nucleoporina Nic96::GFP. En el caso de PacC27, la ausencia de energía no afectó su localización preferentemente nuclear gracias a su capacidad de unión al DNA (Fig. II.24B). Por el contrario, la forma mutante de PacC27 no pudo ser retenida en el núcleo en ausencia de procesos de transporte activo (Fig.

Figura II.24: Efecto de la falta de energía en la localización subcelular de NapB. Células

que expresaban las diferentes proteínas de fusión indicadas fueron incubadas en medio con una mezcla de azida (15mM) y NaF (15mM) y se examinó la localización subcelular de las proteínas fluorescentes. A) La localización de NapB::GFP no se vio afectada por el tratamiento.

B) Localización subcelular de la proteína quimérica GFP::PacC27. C) Pérdida de la localización subcelular en el mutante de PacC que es incapaz de unirse al DNA. D) Localización subcelular de la nucleoporina AnNic96::GFP.

II.24C). La localización perinuclear de Nic96::GFP tampoco se vio afectada en presencia de la mezcla de azida y NaF (Fig. II.24D). Esta nucleoporina pierde su localización perinuclear durante la mitosis cuando se produce el desensamblaje del poro nuclear 100, sin embargo, su localización durante la interfase fue independiente de

energía, lo que demostraba que es el desensamblaje del poro nuclear lo que conduce a la pérdida de los procesos de transporte activo y no a la inversa.

El conjunto de estos resultados sugieren que durante la interfase la localización nuclear de NapB dependería de su capacidad de interaccionar con elementos nucleares y, durante la mitosis, se deberían producir cambios postraducionales que prevendrían la retención de NapB en el interior del núcleo, de forma adicional a la pérdida de los procesos de importación nuclear.

4.3. Velvet, VeA: la proteína que regula morfogénesis en respuesta a luz es