El poro nuclear durante la mitosis

Durante la mitosis se han de producir cambios en la localización de numerosas proteínas. Este es el caso de la tubulina 47 y varios reguladores del ciclo celular, como las ciclinas 48. En las plantas 49, metazoos 50 y hongos basidiomicetos 51, este cambio de composición del contenido núcleo-citoplasmático durante la mitosis se produce, principalmente, por la desaparición de la envoltura nuclear. Al inicio de la profase se produce la separación gradual de algunas nucleoporinas del NPC, seguido del completo desensamblaje del NPC y la desaparición de la envoltura nuclear, que vuelve a reorganizarse durante la telofase 52. A este tipo de mitosis en las que se elimina la separación física entre el ambiente nuclear y citoplasmático se las conoce como mitosis abiertas.

En los hongos ascomicetos, como A. nidulans y S. cerevisiae, la envoltura nuclear permanece íntegra. Por esta razón, la mitosis en estos organismos recibe la denominación de mitosis cerrada. Sin embargo se ha comprobado que cambios en la composición del NPC de estos organismos durante la mitosis hacen variar su permeabilidad y constituyen un importante factor para la regulación de la localización de factores mitóticos. Concretamente, en el caso de la levadura S. cerevisae, la entrada en mitosis coincide con la pérdida de la interacción interfásica entre las nucleoporinas Nup53p y Nup170p, lo que da lugar a la inhibición de las rutas de transporte dependientes de la importina Kap121p 53_{, hecho que ha sugerido que durante la mitosis}

de transporte concretas, mientras que sus características y propiedades básicas permanecen inalteradas.

Figura 6: Desensamblaje parcial del poro nuclear durante mitosis en A. nidulans. Imágenes

de microscopía confocal in vivo durante el proceso de mitosis en A) una cepa con la nucleoporina con repeticiones FG SONBnNup98 fusionada a GFP; y B) una cepa con la nucleoporina estructural SONBcNup96 fusionada a GFP. En la parte superior de cada imagen se muestra el tiempo en minutos. En el panel A, la fase del ciclo celular se indica con G1 y G2 y los dos nuevos núcleos que aparecen tras la mitosis como 1 y 2. Tomado de la referencia 54.

A diferencia de lo que ocurre en S. cerevisiae, en el hongo filamentoso A. nidulans la modificación del NPC es mucho más radical. En el trabajo publicado por De Souza et al. 54 se demuestra que la entrada en mitosis coincide con el desensamblaje de diversas nucleoporinas con repeticiones FG, con lo que el NPC pierde sus propiedades

selectivas y queda reducido a sus componentes estructurales. Las nucleoporinas con repeticiones FG: SONBnNup98, Gle2p/SONA, AnNsp1, AnNup159 y AnNup42 se disocian del NPC dispersándose en el citoplasma al inicio de la mitosis y recuperando su localización perinuclear al finalizar el proceso de división (Fig. 6A). Por el contrario, las nucleoporinas estructurales SONBcNup96, AnNup133 y AnPom152, mantienen su localización en la periferia nuclear sin aparente variación durante todo el ciclo mitótico (Fig. 6B). De Souza et al., también comprobaron que la proteína citoplasmática AnRanGAP, encargada de mantener el gradiente núcleo-citoplasmático de RanGTP, es capaz de acceder al interior del núcleo de A. nidulans durante la mitosis. La presencia de RanGAP en el núcleo sería, en principio, incompatible con el mantenimiento de un gradiente núcleo-citoplásmico de RanGTP y con el desarrollo de ciclos de transporte activo durante este periodo del ciclo celular del hongo. El conjunto de los resultados obtenidos por este grupo les permitió concluir que en A. nidulans se da una situación intermedia entre la mitosis abierta de vertebrados y la cerrada de S. cerevisiae. Al iniciarse la mitosis en el hongo la quinasa NIMA cambia su localización citoplasmática y se sitúa en la periferia nuclear, donde fosforila a SONBnNup98. La fosforilación de esta nucleoporina promueve su desensamblaje del NPC, así como el de, al menos, otras cuatro nucleoporinas con repeticiones FG. Como consecuencia, el NPC durante la mitosis, que mantiene sus componentes estructurales, permite la libre difusión de macromoléculas, entre las que se encuentra RanGAP. La combinación de la pérdida de puntos de interacción para las carioferinas en el poro y la desaparición del gradiente de RanGTP resulta en la desactivación de los procesos de transporte activo presentes en interfase. En estas condiciones, los factores mitóticos y otras proteínas son capaces de difundir libremente entre citoplasma y núcleo, lo que explica, por ejemplo, el fenómeno de entrada al núcleo de subunidades de tubulina durante mitosis 47.

El desensamblaje parcial del complejo del poro nuclear durante la mitosis en A. nidulans se asemeja mucho a las primeras fases de la mitosis de metazoos, en las que la desaparición completa de la envoltura nuclear viene precedida por el desensamblaje de algunas nucleoporinas del NPC 55. En este sentido, el mecanismo de regulación del transporte nuclear en mitosis del hongo supondría una situación evolutiva intermedia entre la mitosis totalmente abierta de vertebrados y la mitosis completamente cerrada de S. cerevisiae.

OBJETIVOS DE LA TESIS

Con esta tesis doctoral se inició el desarrollo de una nueva línea de investigación dedicada a analizar los sitemas de transporte entre el núcleo y el citoplasma en A. nidulans. Este tema no había sido abordado por ningún otro grupo de investigación por lo que no existían datos previos sobre los sistemas de transporte en este hongo ni en ningún otro hongo filamentoso. Debido a ello, los objetivos que se plantearon fueron:

i) Estudiar los sistemas de transporte núcleo-citoplásmico en un organismo multinucleado.

ii) Identificar y caracterizar el exportador general del sistema, el homólogo de CRM1/Exportina-1 en A. nidulans.

iii) Identificar y caracterizar el principal importador del sistema de transporte, los homólogos del heterodímero Importina α/Importina β1.

iv) Generar formas mutantes en cada uno de los sistemas de transporte.

v) Identificar cargas (proteínas) que sean exportadas del núcleo al citoplasma por la ruta de exportación general mediada por el homólogo de CRM1/Exportina-1.

vi) Identificar cargas importadas al interior del núcleo por los homólogos del heterodímero Importina α/Importina β1.

vii) Caracterizar las señales que determinan la localización subcelular de las cargas identificadas.