Mutante condicional en la Importina α de A nidulans

Una de las herramientas más utilizadas en los estudios de transporte nuclear mediado por la Importina α en S. cereviseae es la mutación termosensible denominada srp1-31 60. La mutación que porta el alelo srp1-31 causa la sustitución del residuo serina 116 por una fenilalanina. Este residuo está conservado entre los diferentes ortólogos de la Importina α y se sitúa en la primera de las repeticiones armadillo (figura II.7A). Este cambio puntual provoca que, a la temperatura restrictiva de 37ºC, Srp1-31p no sea capaz de interaccionar con las NLSs y por lo tanto las proteínas destinadas a ser transportadas por la Importina α pierdan su localización nuclear 154_{. Sin embargo, a}

25ºC la proteína es suficientemente funcional como para promover la localización nuclear de proteínas portadoras de NLSs clásicas.

Figura II.7: Generación de un alelo mutante de la Importina α. A) Alineamiento mostrando

la localización de la mutación srp1-31 en la Importina α de S. cerevisiae. La mutación genera en la proteína Srp1p una sustitución de la serina conservada 116 por una fenilalanina, dando lugar a termosensibilidad por la pérdida de la capacidad de interaccionar con las NLSs a la temperatura restrictiva de 37ºC. Scer, Saccharomyces cerevisiae; Ncra, Neurospora crassa; Spo1, Importina α 1 de Schyzosaccharomyces pombe; Spo2, Importina α 2 de

Schyzosaccharomyces pombe; Hsa1, importina α 1 de Homo sapiens; Hsa2, importina α 2 de Homo sapiens. B) Cambio introducido en la secuencia de kapA de A. nidulans para generar en

alelo mutante kapA31. C) Fenotipo de termosensibilidad producido por la presencia del alelo

kapA31.

2.1 Generación del alelo termosensible kapA31.

Una vez caracterizada la región codificante de kapA se pudo determinar la presencia de un residuo de serina en la posición 111, que se correspondía con la serina 116 de Srp1p. Basándonos en los resultados obtenidos en S. cerevisiae con el mutante srp1-31 se decidió generar un cambio Ser111-Phe en la secuencia de kapA. Para ello se amplificó la región codificante, usando DNA genómico, del locus kapA y se introdujo en un plásmido que contenía el marcador de selección pyr-4 de N. crassa. Utilizando este plásmido se generó la versión mutante utilizando mutagénesis dirigida mediante PCR con oligonucleótidos específicos (oligonucleótidos α31UP y α31DW de la Tabla 2) que convertían el codón Ser111 (TCC) en un codón para fenilalanina (TTC) (Fig. II.7B). El plásmido se transformó en la cepa MAD1425 y se seleccionaron transformantes protótrofos para pirimidinas, los cuales fueron posteriormente analizados a 42ºC para comprobar su termosensibilidad (Fig. II.7C). De aquellos que mostraban este fenotipo condicional se aisló DNA y se secuenció el locus kapA para comprobar la

presencia de la mutación y a continuación se verificó la correcta inserción del plásmido por Southern-blot. Este alelo mutante se designó como kapA31. Adicionalmente se realizó un “pop-out” para generar un reemplamiento de la secuencia original del gen kapA por la secuencia mutante (ver sección 5.2 de Materiales y Métodos y apartado 2 de la Parte I para más detalle) y se continuó trabajando con esta nueva cepa (MAD1545) portadora del alelo kapA31.

Figura II.8: Efecto del alelo termosensible kapA31. Análisis de la localización subcelular de

las proteínas de fusión cNLS::GFP y cNLS::NES::GFP en una cepa silvestre y en una cepa

kapA31 mutante. Se muestra una germínula representativa para cada una de las condiciones

ensayadas. Las puntas de flecha blancas señalan los núcleos vacíos de fluorescencia y las grises los núcleos llenos.

2.2 Efecto del alelo termosensible kapA31 en la ruta de importación nuclear. Para estudiar el efecto del alelo mutante kapA31 en la ruta de importación nuclear mediada por el heterodímero Importina α/β1, se utilizaron como herramientas las proteínas quiméricas NLS::GFP y NLS::NES::GFP, las cuáles habían servido para determinar el efecto del alelo kapK1, sensible a la leptomicina B, en la ruta de exportación nuclear (Fig. I.10A). A la temperatura permisiva de 25ºC, la proteína quimérica NLS::GFP mostró una localización nuclear tanto en los núcleos de las células de la cepa kapA+ _{como kapA31, aunque la intensidad de la fluorescencia era menor en}

la NLS::GFP en la cepa kapA+_{, sin embargo, en la cepa kapA31 la fluorescencia pasó a}

distribuirse uniformemente a lo largo de toda la hifa, no pudiendo distinguirse la localización de los núcleos (Fig. II.8). Esta distribución de la fluorescencia es similar a la que presenta GFP cuando carece de una señal de importación nuclear exógena 155. En la cepa kapA+_{, la presencia de una NES en la proteína quimérica hizo que ésta se}

distribuyera de forma similar entre el citoplasma y el nucleoplasma a las dos temperaturas ensayadas. Sin embargo, en la cepa portadora del alelo kapA31, la proteína apareció excluida del núcleo, siendo esta localización más pronunciada cuando se incubó la cepa mutante a 42ºC. El conjunto de estos resultados mostraban que la proteína mutante KapA31 causa un defecto en la importación nuclear de una proteína quimérica portadora de una NLS clásica. A pesar de que este defecto es más evidente a la temperatura restrictiva, no se puede descartar un efecto menor de la mutación a la temperatura permisiva, fenotipo que es previsible en fondos genéticos con mutaciones condicionales.

3. Distribución en la célula de los elementos de la ruta clásica de