Mecanismos de las Rho GTPasas en el modelo de PC12 Revisado en (Govek et al., 2005).

El tratamiento de células PC12 con NGF resulta en la formación de neuritas, de una forma dependiente de las actividades de Rac y Cdc42, ya que sus dominantes negativos, inhiben el crecimiento neurítico. Se necesita una activación localizada de dichas GTPasas, ya que inmediatamente después de la adición de NGF se observan activaciones transitorias a lo ancho de la periferia celular, generando ciclos de actividad e inactividad en las puntas movibles de las neuritas a lo largo del tiempo (Aoki et al., 2004). Además, el reclutamiento de Rac1 a la superficie celular para formar estructuras salientes ricas de filamentos de actina está asociado a una disminución concomitante de la actividad de RhoA (Yamaguchi et al., 2001). La activación de Rho

se ha asociado generalmente con inhibición de la iniciación neurítica y retracción de las neuritas ya existentes. La señalización de RhoA induce la formación de una gruesa estructura de filamentos de actina en forma de anillo alrededor de la periferia celular que inhibe el reclutamiento de Rac1 a las neuritas salientes (Yamaguchi et al., 2001). Si se inhibe Rho con C3 exoenzima de

Clostridium botulinum se mimetiza la formación neurítica inducida por Rac1 y Cdc42 (Tigyi et al., 1996). El mecanismo de actuación de las tres Rho GTPasas viene determinado por señales externas a través de factores de crecimiento. En el caso de las PC12, es el factor neurotrófico NGF el que desencadena una cascada de señalización intracelular hasta la adquisición del fenotipo neuronal. La principal serie de pasos sucesivos propuestos que involucran la vía de las Rho GTPasas son los siguientes: NGF, TrkA, Ras, PI3K, Cdc42 y Rac, juntamente con la disminución de las actividades Rho y Rho kinasa por debajo de Rac (ver Figura I12) (Kita et al., 1998; Nusser et al., 2002; Aoki et al., 2004).

Figura I12.Esquema de las vías de señalización que unen TrkA con las Rho GTPasas. TrkA, de forma independiente de Ras, activa PI3K, que a su vez activa Rac1 y Cdc42. Rac1 induce la translocación de RhoA al citoplasma, donde que une a GDIs, que la inhiben y también se inhibe su posible unión a ROK (Rho kinasa). Fuente: (Nusser et al., 2002).

A su vez, se ha descrito que la actividad de Rac1 y de Cdc42 inducida por NGF puede ser regulada por moduladores de su actividad GTPasa, tanto GAPs como GEFs. Un ejemplo es la proteína Nadrin-116 que es una Rho-GAP y que inhibe el crecimiento inducido por NGF en las PC12 (Furuta et al., 2002). Pese a que se ha descrito que Rac y Cdc42 actúan por debajo de la GTPasa Ras, sus efectos pueden venir también a través de la activación de una proteína GTPAsa similar a Ras, llamada Rin. Rin se une a calmodulina y necesita de la presencia de calcio y de la actividad de Rac y Cdc42 para mediar el crecimiento neurítico. La activación de las Rho GTPasas y la consiguiente neuritogénesis mediada por la expresión de Rin sucede de una manera independiente de la presencia de NGF y de la activación de la vía Ras/MAPK. Un punto no elucidado aún es que Rin también activa RhoA pero esta activación no antagoniza la formación de neuritas (Hoshino and Nakamura, 2003).

Una vez activadas las Rho GTPasas, Cdc42 y Rac1, éstas activan a sus proteínas efectoras, situadas por debajo de la cascada de señalización. Se ha descrito que PAK1 induce neuritogénesis cuando es dirigida a la membrana de forma independiente a su actividad kinasa (Daniels et al., 1998). Además también están las efectoras de Cdc42, N-WASP y MRCK (‘myotonic

dystrophy kinase-related Cdc42-binding kinase’), cuyos dominantes negativos no pueden unirse a Cdc42 ni a Arp2/3, por lo que se bloquea el crecimiento neurítico inducido por NGF (Chen et al., 1999; Banzai et al., 2000).

Ya hemos descrito que la activación de Rho no sólo antagoniza la promoción del crecimiento neurítico sino que causa retracción de las neuritas preexistentes. Así pues, inicialmente ya se describió que la activación de Rho por LPA provocaba un colapso en el cono de crecimiento, retracción neurítica y finalmente, la célula se redondea. Tales efectos son inhibidos por la C3 exoenzima, que ADP-ribosila e inhibe Rho (Jalink et al., 1994). Entre los moduladores de la actividad Rho, está la Rho-GAP, Grit. Se une a trkA por su extremo C-terminal y su actividad GAP, por donde inhibe las Rho GTPasas, está en el N-terminal. Como la sobreexpresión del fragmento de unión a trkA inhibe el crecimiento neurítico inducido por NGF y, en cambio, la proteína entera induce un cierto aumento de la neuritogénesis, se deduce que Grit es un modulador principalmente de Rho (Nakamura et al., 2002).

También se ha descrito que otras proteínas, aparte de las GEFs y GAPs, pueden ser activadoras de diversas Rho GTPasas. Es el caso de la familia de proteínas secretadas ricas en cisteínas Wnt, y de Dvl-1, proteína intracelular clave para la señalización de Wnt. Tanto Wnt-1,-3 y Dvl-1 bloquean la formación de neuritas inducida por el tratamiento con NGF, a través de la activación de Rho y de su kinasa (Kishida et al., 2004).

En lo que respecta a sustratos de Rho y de su kinasa, se ha descrito que la inhibición de la vía Rho-Rho kinasa inducida por el tratamiento con NGF produce una activación de la fosfatasa de la cadena ligera de la miosina (MLCP), lo que disminuye la fosforilación de MLC (Fujita et al., 2001).

Finalmente solo falta por mencionar que también se ha descrito en la bibliografía que otras Rho GTPasas, a parte de las tres principales, pueden tener efectos en la neuritogénesis. Por ejemplo, la sobreexpresión de RhoG induce neuritogénesis independientemente de estímulo, cosa que no provocan las otras tres Rho GTPasas, elevando las actividades de Rac1 y Cdc42. Un elemento importante es que un dominante negativo de RhoG inhibe la neuritogénesis inducida por Ras, por lo tanto, situamos a RhoG por debajo de Ras y por encima de Rac1 y Cdc42, siendo una pieza clave para la neuritogénesis promovida por NGF en las PC12 (Katoh et al., 2000; Katoh and Negishi, 2003). A su vez, la actividad de RhoG se regula por la proteína GEF, Trio (Estrach et al., 2002). Las proteínas Rnd son nuevos miembros de la familia de las Rho GTPAsas y tienen poca actividad GTPasa intrínseca. Se sugiere que antagonizan la señalización de RhoA y se ha descrito que Rnd1 causa la formación de numerosas neuritas que contienen muchos microtúbulos pero pocos filamentos de actina y neurofilamentos en las PC12 (Aoki et al., 2000). Por último, Tc10 y RhoT, otras pequeñas GTPAsas de la subfamilia de Cdc42, también inducen crecimiento neurítico en PC12 a través de un mecanismo que involucra a N-WASP y Arp2/3 (Abe et al., 2003).