Metilación del ADN

La metilación del ADN es una modificación post-replicativa que consiste en la adición covalente de un grupo metilo en la posición 5’ del anillo pirimidínico de citosinas seguidas de guaninas, llamadas dinucleótidos CpG (“Cytosine-phosphate-Guanine”). Estudios recientes en cerebro han demostrado la existencia de formas alternativas de metilación en citosinas no seguidas de guanina (“non-CpG methylation”), aunque su relevancia funcional no ha sido elucidada ([8668]). Por su parte, los dinucleótidos CpG no se encuentran uniformemente distribuidos en el genoma, sino que tienden a concentrarse en regiones denominadas islas CpG, formadas por entre 200-2000 pares de bases con una proporción de CpG superior al

50% y un promedio de CpG observado/esperado mayor de 0,6. A su vez, la distribución de citosinas metilables en el genoma sigue un patrón bimodal, según el cual los dinucleótidos CpG incluidos en islas CpG carecen de metilación, mientras que los que se encuentran fuera de ellas, están metilados. En base a este concepto, en el genoma humano se identifican dos tipos de genes: constitutivos y tejido-específicos. Los genes constitutivos, que corresponden al 70% de todos los genes, presentan promotores con un porcentaje normalizado de CpG en torno al 0,61 y, por tanto, sus islas CpG contienen citosinas en estado no metilado, permitiendo la transcripción génica. Por el contrario, los genes tejido-específicos presentan promotores que no suelen estar asociados a islas CpG ya que tienen un promedio de CpG alrededor del 0,23, de forma que los dinucleótidos CpG están metilados, restringiendo su expresión a determinados tejidos o tipos celulares ([8490]).

La metilación del ADN es un proceso de gran relevancia biológica que no ocurre únicamente a nivel gen-específico regulando la expresión génica, sino que también regula procesos a nivel genómico. En este sentido, se ha descrito que la metilación en regiones no codificantes, como la heterocromatina centromérica, es crucial para mantener la conformación e integridad de los cromosomas ([8492]). Del mismo modo, la metilación de secuencias repetitivas del genoma de tipo transposones, como secuencias LINE-1 (“Long interspersed nuclear element-1”) ó SINE (“Short interspersed nuclear element”), evitaría la movilización de los mismos, impidiendo fenómenos de inestabilidad cromosómica ([8493]).

En general, la metilación de citosinas se asocia con silenciamiento génico a través de distintos mecanismos. Por una parte, el ADN metilado evitaría la transcripción de forma directa dado que algunos factores de transcripción generales como Sp1, CREB, E2F ó NF-kB se unen a dominios que contienen CpG, y esta unión disminuye cuando estos dominios están metilados. Por otra parte, mediante la interacción específica de represores transcripcionales con dominios de unión a dinucleótidos CpG metilados, llamados genéricamente proteínas MBP (“methyl-CpG binding proteins”), entre las que destacarían: MeCP2 (“methyl-CpG binding protein 2”), MBD1-4 (“methyl-CpG binding domain protein 1-4”) y Kaiso también conocida como ZBTB33 (“zinc finger and BTB domain containing protein 33”). Estas MBPs, a su vez, reclutarían proteínas modificadoras de histonas formando complejos proteicos que darían lugar al establecimiento de una cromatina de alto grado de compactación y, por tanto, se reprimiría la expresión génica ([8491]).

Las enzimas responsables de la metilación del ADN reciben el nombre de ADN metiltransferasas (DNMT), catalizando la transferencia de un grupo metilo del donador S- adenosil-L-metionina (SAM) hasta la posición 5’ del anillo de la citosina, dando lugar a la

base 5-metilcitosina (5mC). En mamíferos, se han descrito 5 miembros de la familia DNMT: DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b y DNMT3L. Sin embargo, únicamente poseen actividad metiltransferasa DNMT1, DNMT3a y DNMT3b. Pese a esto, se ha descrito que DNMT3L actuaría como cofactor interaccionando con DNMT3a y DNMT3b y, a su vez, ejercería una función de represión epigenética al reclutar enzimas modificadores de histonas a las regiones promotoras metiladas ([8494], [8495]). Por otro lado, DNMT2 sería la responsable de catalizar la metilación del ARN de transferencia, evitando así su degradación por ribonucleasas. Por lo que respecta a DNMT1 ó metiltransferasa de mantenimiento, cabe decir que es la ADN metiltransferasa más abundante, cuya transcripción tiene lugar mayoritariamente durante la fase S del ciclo celular. Esta DNMT es la responsable de la metilación asociada al proceso de replicación del ADN, de forma que cataliza la metilación de las posiciones hemimetiladas generadas durante la replicación semi-conservativa del ADN. Esto es posible dado que interactúa con el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) que es la proteína encargada de anclar la ADN polimerasa a la horquilla de replicación. Por último, DNMT3a y DNMT3b, comúnmente llamadas metiltransferasas de novo, presentan afinidad por dinucleótidos CpG no metilados y, por tanto, son las responsables del establecimiento de los patrones de metilación durante el desarrollo embrionario, encontrándose altamente expresadas en células embrionarias e infra-expresadas en células diferenciadas. Pese a esto, cada vez son más las evidencias que indicarían que DNMT1 podría jugar un papel en la metilación de novo, así como DNMT3a y DNMT3b podrían contribuir en la metilación de mantenimiento ([8496]).

Tal y como se ha comentado previamente, la metilación del ADN es una marca epigenética reversible, pudiendo ser restituida por procesos de pérdida de metilación o desmetilación del ADN. Se han propuesto mecanismos de desmetilación pasiva que implicarían la pérdida de metilación durante la replicación del ADN por inhibición de la acción de DNMT1 sobre la cadena hemimetilada. De este modo y, tras varios ciclos de replicación, se conseguiría eliminar la metilación del ADN de esa región genómica. Otros mecanismos alternativos para explicar la re-expresión de genes silenciados por metilación, sobretodo en células diferenciadas que carecen de replicación, implican el proceso llamado desmetilación activa (Figura 6).

Figura 6. Mecanismos de desmetilación del ADN de forma activa. (Imagen modificada de [8497]).

Un elemento clave este proceso son los miembros de la familia de proteínas TET (“Ten- eleven translocation”). Se conocen 3 miembros de esta familia (TET1, TET2 y TET3) capaces de oxidar la 5mC convirtiéndola en 5-hidroxi-metilcitosina (5hmC). Tanto la 5hmC, como la propia 5mC, podrían ser sustrato de distintos elementos enzimáticos, tales como desaminasas del complejo AID (“Activation-induced cytidine deaminase”)/APOBEC (“Apoprotein B mRNA-editing enzyme complex”) ó bien, podrían ser las propias enzimas TET las responsables de convertirlas en formil-citosinas (fC) y carboxil-citosinas (caC). En los tres casos, el proceso final implicaría la actuación del sistema de reparación por escisión de bases (BER), dando lugar a la citosina libre de grupo metilo. Por otro lado, hay evidencias que demuestran que las propias DNMT3a y DNMT3b podrían ejercer la función de agentes desmetiladores en situaciones de oxidación y de ausencia del donador de grupos metilos SAM, catalizando la conversión de 5hmC en citosina, posteriormente a la actuación del complejo TET. Del mismo modo, se ha descrito que tanto las DNMT de novo como DNMT1, podrían catalizar directamente la desmetilación de las 5mC en presencia de iones calcio y bajo condiciones no reductoras en ausencia de SAM. El último mecanismo de desmetilación activa, descrito hasta el momento, implicaría la actuación de la maquinaria de reparación del ADN comúnmente llamada NER (“Nucleotide excision repair”) ([8497]).