Se determinó NT en 0,5 g de muestra mediante el método de Kjeldahl (AOAC, 1993. Sec. 920.152). Para la determinación de NNP, se trataron 25 g de muestra con 25 mL de solución de TCA (7,5 %), se centrifugó a 3000 rpm por 10 min y se filtró el sobrenadante. Se repitió el procedimiento de extracción con TCA 7,5 % en el precipitado. Se tomó una alícuota de 10 mL del sobrenadante y se determinó el contenido de Nitrógeno mediante el método de Kjeldahl (Hernández- Herrero y col., 1999b).
II.2.3.6 Determinación de la composición de ácidos grasos
Los lípidos totales se extrajeron a partir de 100 g de muestra utilizando una mezcla cloroformo-metanol-agua (2:2:1,8), de acuerdo al método de Bligh y Dyer (1959). Para ello se obtuvieron dos extractos independientes por cada muestra
analizada, los cuales fueron almacenados bajo atmósfera de nitrógeno y en oscuridad a -18 ºC para su posterior análisis.
El perfil de ácidos grasos fue determinado mediante cromatografía gas- líquido, utilizando KOH en metanol como agente de transesterificación, de acuerdo a la norma ISO 5509 (International Organization for Standardization, 2000). Se disolvieron 100 mg de extracto graso en hexano y se trataron con KOH 1M (en metanol) durante 10 min a 70 ºC. Se realizó la separación de los ácidos grasos en un cromatógrafo gaseoso (Shimadzu® GC-17A, Kyoto, Japón) equipado con columna capilar de sílica fundida (Omegawax 320, Supelco, Bellefonte, PA, USA) (30 m x 0,32 mm d.i.; 0,25 µm film) y detector de ionización en llama (FID). El programa de temperatura utilizado fue: temperatura inicial, 190 ºC; rampa 1,5 ºC/min; temperatura final, 225 ºC (isoterma de 13 min); temperatura del inyector y del detector, 250 ºC. El volumen inyectado fue 1 µL y el gas portador utilizado, nitrógeno. Los tiempos de retención y áreas de los picos se procesaron utilizando el software Shimadzu® SMI Class – GC 10. Para la identificación de los ácidos grasos se compararon los tiempos de retención y las áreas de las muestras con la mezcla de estándares de referencia PUFA-1, Marine Source (Supelco®), diluida en hexano, de concentración 50 mg/mL. Los ácidos grasos se cuantificaron a través de la relación porcentual de las áreas de los picos con respecto al área total.
II.2.3.7 Determinación de sustancias reactivas al ácido 2–tiobarbitúrico
Se utilizó el número de TBA (nº TBA) como indicador de la oxidación lipídica a lo largo de la maduración. Este valor se relaciona con la cantidad de malonaldehído y otros productos de oxidación presentes en la muestra (Pokorný y col., 2005).
Para la cuantificación de las sustancias reactivas al TBA se utilizó el método de extracción ácida, de acuerdo a Tironi y col. (2007). Se homogeneizaron 2 g de muestra con 16 mL de ácido tricloroacético (TCA) 5 % P/V. Los homogenatos se mantuvieron en hielo durante 30 minutos y
posteriormente se filtraron. Se tomó una alícuota de 2 mL del filtrado y se agregaron 2 mL de solución de TBA 0,5 % P/V. Se incubaron las mezclas a 70 ºC durante 30 minutos en tubos cerrados y en oscuridad (Botsoglou, 1994). Se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro (Shimadzu® UV-1601 PC, Kyoto, Japón) a 532 nm (pigmento rosado) para malondialdehído (MDA) y a 455 nm (pigmento amarillo) para aldehídos, de acuerdo a Meir y col. (1992) (Zhuang y col., 1997). En los casos en que la absorbancia no se encontrara en el rango 0,15-1 se corrigieron los volúmenes de la alícuota tomados.
Se calculó el nº TBA a ambas longitudes de onda de acuerdo a la ley de Lambert y Beer (Ec. II.8).
ε
× × × × × × = Ec. II.8siendo: Abs: absorbancia medida
PM: peso molecular de las sustancias reactivas al TBA. A 532 nm, PM del MDA (72g); a 455 nm, promedio de los PM del propanal, butanal, hexanal, heptanal y propanal-metilacetal (89,6 g) (Meir y col., 1992) Vt: volumen de alícuota del extracto+volumen de solución de TBA
Ve: volumen del extracto (16 mL)
Va: volumen de la alícuota
m: masa de muestra b: camino óptico (1 cm)
ε: coeficiente de extinción molar del compuesto coloreado. ε532nm= 1,56 x 105 M-1 cm-1 (correspondiente al MDA); a ε455nm= 0,457 x 105 M-1 cm-1 (correspondiente al promedio de los aldehídos mencionados anteriormente).
I
III..22..44CCaalloorriimmeettrrííaaDDiiffeerreenncciiaallddeeBBaarrrriiddoo
La calorimetría diferencial de barrido (DSC) permite determinar las temperaturas a las cuales ocurren procesos endo o exotérmicos en una muestra sometida a un programa de temperatura, frente a una sustancia de referencia, así como obtener las entalpías asociadas a dichos procesos.
A tal efecto, se utilizó esta técnica para determinar las temperaturas y entalpías de desnaturalización de las proteínas musculares de la anchoíta, así como analizar los posibles cambios en estos parámetros en función del tiempo de maduración. Esta técnica presenta la ventaja de posibilitar el análisis de las proteínas in situ, sin necesidad de llevar a cabo la solubilización del tejido muscular. A partir del análisis de los termogramas obtenidos es posible extraer información acerca de la estabilidad proteica en términos de la temperatura de pico (Tmáx) y de los correspondientes cambios de entalpía asociados a las distintas proteínas presentes (actina, fragmentos de miosina y proteínas sarcoplasmáticas). Así, la técnica de DSC ha sido ampliamente utilizada en el estudio de las propiedades térmicas de las proteínas musculares de diferentes especies pesqueras así como ha permitido obtener información acerca del efecto de diferentes procesos sobre las mismas (Thorarinsdottir y col., 2002; Jensen y Jørgensen, 2003; Medina-Vivanco y col., 2004; Tironi y col., 2007; Tironi y col., 2010).
A tal fin, se determinó la estabilidad térmica de las proteínas del músculo de anchoíta a distintos tiempos de madurado, así como también bajo diferentes condiciones de procesamiento. Mediante esta técnica se analizaron los lotes 07t- P80-T15, 07F-P80-T15 (Experiencia 3), 08t-P80-T15, 08t-P30-T15 y 08t-P80-T5 (Experiencias 4 y 5), tomando porciones de músculo de la zona del lomo del filete (25-30 mg de muestra húmeda) colocándolas en cápsulas de aluminio, las cuales fueron cerradas herméticamente. Para efectuar el análisis se utilizó un Calorímetro Diferencial de Barrido DSC Q100-1072 (TA Instruments®, USA). Las corridas de las distintas muestras se realizaron por triplicado. Se trabajó en un rango de temperaturas de 0 a 100 ºC, con una isoterma de 2 minutos a 0 ºC y una velocidad de calentamiento β = 10 ºC/min. Posterior a la corrida, las cápsulas
fueron perforadas y colocadas en estufa a 105 ± 1 ºC hasta peso constante, a fin de obtener las masas secas respectivas.
Los termogramas obtenidos fueron analizados mediante el programa informático TA Instruments® Universal Analysis, obteniéndose las temperaturas de desnaturalización de las proteínas a partir de las Tmáx, así como las entalpías de desnaturalización correspondientes a través del cálculo del área bajo la curva obtenida.
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