Obtención de extractos.

Se utilizaron dos opciones de extracción: etanol por ser utilizado en la producción de alimentos y de ingredientes alimentarios (40). Mezcla de solventes metanol / agua 50:50 y acetona / agua 70:30 descrita por Rojas et al. (9), con algunas modificaciones.

Extracción con metanol –acetona.

Mediante el método descrito por Rojas et al. (9), con algunas modificaciones, el cual emplea la mezcla de solventes metanol / agua 50:50 y acetona / agua 70:30, se pesó 5 g para cáscara y testa, 0,5 g para pulpa y 2,5 g para grano, estas variaciones se dieron en función de la concentración de cada residuo, las muestras se colocaron en tubos de centrifuga, se les adicionó 20 ml de solución de metanol / agua 50:50, (para pulpa se adiciono 5 ml), realizando la extracción mediante agitación por 1 hora, mediante el agitador (modelo M73535, Thermolyne, USA) a 120 r.p.m., se centrifugó a 2000 r.p.m. en el equipo (modelo 420101, Dynac, USA) durante 30 minutos, se separó el sobrenadante y al residuo se realizó el mismo procedimiento indicado pero con la mezcla de acetona / agua 70:30. Finalmente se mezcló los sobrenadantes, en los que se determinó la capacidad antioxidante y cuantificación de fenoles totales (Anexo 1).

Extracción con Etanol.

Se pesó 2,5 g de muestra para todos los residuos. Se adicionó 50 ml de etanol dejando macerar con agitación constante durante 24 horas a temperatura ambiente. Se filtró mediante un papel filtro (MN 615, Macherey-Nagel, Germany) y se concentró a vacío en un rota evaporador (modelo R-200, Buchi, Suiza), con baño de calentamiento (modelo B- 490, Buchi, Suiza), a temperatura de 37 °C (41), se obtuvo un extracto semisólido; se determinó el peso de este extracto para cuantificar el rendimiento en peso de compuestos solubles en etanol; se aforó éste extracto a 10 ml ya partir de éste se realizó la determinación de la actividad antioxidante y cuantificación de fenoles (Anexo 2).

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4.7 Cuantificación de la actividad antioxidante.

La actividad antioxidante total se determinó mediante tres métodos espectrofotométricos basados en la capacidad de reducción férrica (FRAP), inhibición del radical ácido 2,2`- azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico (ABTS), (2,2- Difenil-1-picrihidrazilo) (DPPH) y Fenoles Totales.

4.7.1 Método ABTS.

Se determinó siguiendo la metodología de Arnao et al. -citada y modificada por Thaipong et al. (42) con algunas modificaciones, se preparó una solución de ABTS 7,4 mM y una solución de persulfato de potasio 2,6 mM. Se mezclaron las soluciones en igual cantidad y se dejó reaccionar durante 12 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Para preparar la solución de trabajo, se mezcló 70 ml de metanol y 2 ml de solución ABTS, se realizó la lectura en el espectrofotómetro (modelo 6400, Jenway, New York, U.S.A) a una longitud de onda de 734 nm verificando que se obtenga una absorbancia de 1,105 ± 0,01. Para cada muestra se tomó 150 µl de extracto y 2850 µl de la solución de trabajo, dejando reaccionar durante 7 minutos antes de realizar la lectura. Se empleó una curva estándar con trolox (20-

800 μM). Los resultados fueron expresados en μmol equivalente de Trolox (TE) / g de

muestra en base seca (BS), reportándose el valor promedio de tres repeticiones y su desviación estándar (Anexo 3).

4.7.2 Método DPPH.

Se determinó siguiendo la metodología de Brand-Williams et al. -citada y modificada por Thaipong et al. (42) con algunas modificaciones, se preparó una solución stock disolviendo 0,024 g de DPPH en 100 ml de metanol, que se guardó en refrigeración hasta su uso. De la solución stock se tomaron 10 ml y se diluyo con 70 ml metanol. Verificando que se obtenga una absorbancia de 1,1 ± 0,01 a 515 nm. Para cada muestra se tomó 150 µl de

extracto y 2850 µl de la solución DPPH, dejando reaccionar durante 30 minutos,

procediendo a realizar las lecturas correspondientes en el espectrofotómetro (modelo 6400, Jenway New York, USA) a 515 nm. Se empleó una curva estándar con Trolox (20-800

20

μM). Los resultados son expresados en μmol TE / g BS, reportando el valor promedio de

tres repeticiones y su desviación estándar (Anexo 4).

4.7.3 Método FRAP.

Se determinó siguiendo la metodología de Benzie y Strain-citado y modificado por Thaipong et al. (42). Se utilizó una solución de acetato buffer 300 mM (3,1 g C2H3NaO2 _ 3H2O y 16 ml C2H4O2) lo cual debe tener un pH 3,6. Solución TPTZ con una concentración 10 mM utilizando HCl 40 mM como solvente y solución de cloruro de hierro hexahidratado 20 mM. La solución de trabajo fue preparada mezclando 25 ml acetato buffer, 2,5 ml de solución de TPTZ, y 2,5 ml de solución de cloruro de hierro hexahidratado, se calentó a 37 ºC antes de usar. Para cada muestra se tomó 150 µl de

extracto y 2850 µl de la solución FRAP, dejando reaccionar durante 30 minutos en la

obscuridad, procediendo a realizar las lecturas correspondientes en el espectrofotómetro (modelo 6400, Jenway, New York, USA) a una longitud de onda de 593 nm. Se empleó una curva estándar con Trolox (20-800 μM). Se expresó los resultados en μmol TE / g BS,

reportando el valor promedio de tres repeticiones y la desviación estándar (Anexo 5).

4.7.4 Determinación de Fenoles Totales.

La cuantificación de fenoles totales fue determinada por el método Folin-Ciocalteu adaptado por Swain and Hillis -citado por Thaipong et al. (42), Para cada muestra se tomó 150 µl de extracto, 2400 µl de agua destilada y 150 µl de la solución 0,25 N de Folin-

Ciocalteu, mezclando a temperatura ambiente por 2 minutos utilizando el agitador (modelo M73535, Thermolyne, USA) a 120 r.p.m., se dejó reaccionar por 3 minutos y se agregó 300 µl de carbonato de sodio 1 N, se agitó durante 2 minutos, dejando reaccionar durante 2

horas a temperatura ambiente en la obscuridad. Se realizó las lecturas en el espectrofotómetro (modelo 6400, Jenway, New York, USA) a 725 nm empleando una curva estándar de ácido gálico (l-20 mg/l). Los resultados son expresados en mg equivalentes de ácido gálico (GAE) / 100g BS, reportando el valor promedio de tres repeticiones y su desviación estándar (Anexo 6).

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4.7.5 Muestra control.

Se utilizó el antioxidante sintético butil hidroxi tolueno (BHT) como muestra control, para lo cual se preparó una concentración 0,01 M disolviendo 0,055 g en 25 ml de metanol, a partir de esta solución se realizó las diferentes cuantificaciones ABTS, DPPH, FRAP y Fenoles Totales de manera análoga a los procedimientos descritos para los extractos.

4.7.6 Obtención del rendimiento.

Para determinar el rendimiento se realizó mediante la diferencia de la actividad antioxidante obtenida mediante los dos métodos de extracción metanol / agua 50:50 –

acetona / agua 70:30 y etanol tomando como referencia del 100% la extracción con metanol – acetona, expresando los resultados en porcentaje.