Parámetros de análisis de Melt Curve Genotyping para el Screening de la Multi-

Para el análisis de Melt Curve Genotyping se tienen en cuenta dos variables que le generan

astringencia al análisis. Para el caso del Screening de la Multi-target de maíz, se aumenta

el Score Theshold a 0.80 y se mantienen la Resolution Theshold de 0.10. Estas variables

garantizan una mayor sensibilidad para evitar al máximo la prevalencia de falsos positivos y falsos negativos (Roche, 2010b).

5.3.4. Criterios de evaluación para la estandarización de la PCR-HRM

De acuerdo a los datos obtenidos en la estandarización, se tienen tres análisis de los resultados que son importantes para definir la mejor concentración de ADN del método Múltiplex Multi-Target del Screening de maíz: la Desviación Estándar de los Cp de la

b. b.

c. c.

Amplificación, el agrupamiento de los resultados en de la HRM y la evaluación de la Homogeneidad de picos de la HRM. Teniendo en cuenta que el uso de volúmenes de reacción tan pequeños, aumenta el riesgo de errores de pipeteo (Norambuena P, et. al.,

2009), la Desviación Estándar a partir de los Cp de la amplificación no se considerará un análisis de resultados que represente un factor principalmente determinante para la escogencia de la técnica PCR-HRM. Particularmente, el análisis de cálculo de incertidumbre para el laboratorio de Detección de OGM del INVIMA esta soportado en

“Guidance document on measurement uncertainty for GMO testing laboratories” la cual es

la guía oficial publicada por el IRMM para el cálculo de la estimación de la incertidumbre para los laboratorios de la ENGL. La figura 20 es el diagrama causa-efecto para determinar las posibles fuentes de incertidumbre a partir de los ensayos de detección de OGM. En esta figura se observan factores agrupados en cuatro características: Resultados de la medición PCR, Extracción de ADN y Calibración. Cada factor agrupado en esas características, puede ser controlado con el uso de equipos indicados de alta resolución y precisión como un Nadodrop® para la cuantificación de ADN, equipos y Software de análisis reconocidos y robustos como el análisis de segunda derivada del el Software LightCycler ® 480 SW 1.5 y el equipo LightCycler 480, equipos para la molienda/homogenización de material de alta eficiencia como el molino de bolas OrthoAlresa, la medición de volúmenes exactos con micro pipetas con alta precisión y exactitud como las Eppendorf Research sometidas a mantenimientos preventivos y calibraciones a los volúmenes recomendados por el fabricante con laboratorios acreditados para esta magnitud, el uso de procedimientos de extracción estandarizados y validados, procedimientos de amplificación que disminuyen los tiempos de almacenamiento controlando la disminución de la viabilidad del ADN extraído previamente y normalizan las concentraciones de las extracciones previas a su amplificación, y uso de Materiales de Referencia o Certificados para la detección de OGM. De acuerdo a lo anterior, la única fuente de incertidumbre que no se pueden controlar de ninguna manera, es el error sistemático derivado de pipeteo el cual está inmerso en factores como Diluciones, Condiciones de PCR y cantidad de ADN, lo cual es transversal al ensayo. Al realizar el diagrama causa-efecto de los factores que pueden generar incertidumbre a la precisión de la medición volumétrica para la detección de OGM en el laboratorio de OGM del INVIMA (Figura 21), un programa de entrenamiento y calificación de personal, la disponibilidad de equipos que cumplan las funciones indicadas para su uso y con un programa de gestión metrológica, pueden controlar la mayoría de factores. Pese a que la desviación estándar de los Cp en una amplificación está asociada fundamentalmente a la resolución de la medición y al algoritmo del análisis de los datos, que en este caso el módulo de cuantificación absoluta por segunda derivada (Software LightCycler ® 480 SW 1.5), existe un problema fundamental que afecta la medición y que se ve reflejada en los Cp luego de la amplificación y es la formación de gotas en extremo de la punta o efecto gota representado como un sub-factor que afecta la rutina de pipeteo. Pese a que algunas marcas de puntas facilitan el pipeteo y las micro pipetas cuentan con un sistema de expulsión del volumen tomado, este no garantiza que se pipetee correctamente el volumen indicado, generando una variación entre el 1.4-2.5% para el montaje en la placa del ADN y el 1.0- 1.5% para el pipeteo del máster mix en la placa (Eppendorf, 2007). Esta variación afecta directamente los Cp en la amplificación, debido a que el Cp es inversamente proporcional a la concentración de ADN en la muestra (Querci M., et. al., 2007), afectando directamente

Figura 20. Diagrama causa-efecto de acuerdo a las posibles contribuciones a la Medición de la Incertidumbre para los ensayos cuantitativos. Lo que se encuentra dentro del círculo son las contribuciones por reproducibilidad. Tomado del Procedimiento de estimación de la incertidumbre de los ensayos de

cuantificación de OGM PA02-PM-OGM-P002 Versión 00.

Figura 21. Diagrama causa efecto de las posibles contribuciones a la incertidumbre en la medición volumétrica para el montaje de la detección de OGM.

Efecto gota Analista Equipos Precisión de la medición volumétrica Capacitación Rutina de pipeteo Uso de equipos indicados Puntas Calibración Precisión y exactitud Condiciones de uso y almacenamiento Homogeneidad de la solución a pipetear Estado general del equipo (Mantenimiento) Suministros Concentración OGM Análisis de datos Resultados de la medición PCR Extracción de ADN Calibración Repetibilidad Cantidad de ADN Calidad y pureza del ADN Instrumento de PCR Almacenamiento del ADN extraído Condiciones de PCR Inhibición de la PCR Tamaño de la partícula Igualdad en la extracción de ADN de las muestras de análisis Homogeneidad de la muestra Inhibición de la PCR Equipo de PCR Condiciones de PCR Diluciones Almacenamiento de MR Tipo de MR

la incertidumbre de la medición. Por esta razón, la variación representada en la desviación estándar de los Cp no es un análisis determinante al momento de definir la concentración de ADN indicada para el estandarizar el Multiplex Multi-Target de maíz. Por su parte, el análisis de los resultados en de la HRM de acuerdo al uso del Software del equipo (LightCycler ® 480 SW 1.5), muestra la posibilidad de comparar los perfiles de fusión de manera Auto agrupada, con las tendencias de los resultados en cada corrida, con

controles En Corrida, asignados previamente al análisis o con Controles Externos, los

cuales son administrados como datos especiales en la carpeta de estándares de melting. La comparación con los controles se realiza de acuerdo a un algoritmo interno en el cual el analista puede manipular la astringencia aumentando o disminuyendo el coeficiente de similaridad con la curva de comparación principal (Score) o con el coeficiente de

similaridad con la curva secundaria (Resolution). El resultado de ese análisis, es la

asignación de cada curva en cada pozo, a un grupo de acuerdo a las características de los datos de la derivada negativa de la fluorescencia por temperatura (Roche, 2010a). Teóricamente se espera que las muestras que cuentan con amplicones muestren el pico de melting en la temperatura esperada, sin embargo, la alta sensibilidad y susceptibilidad a pequeñas variaciones en las concentraciones de los reactivos que intervienen en la amplificación en el análisis por HRM, hace que se puedan presentar amplificaciones positivas de acuerdo al Análisis Cuantitativo de Segunda Derivada y agrupaciones negativas o desconocidas para el análisis de perfiles de fusión en HRM. Por tal razón y teniendo en cuenta que en algunos ensayos preliminares se evidenciaron agrupaciones negativas o desconocidas por la variación en la Tm entre réplicas en el análisis de los perfiles de fusión, este análisis no es determinante como criterio de evaluación para la estandarización de PCR-HRM. Por esta razón, fue necesario diseñar una metodología para poder analizar la dispersión de los picos y ponderarlos de tal forma que se puedan controlar los factores asociados a esa desviación.

La metodología de ponderación de dispersión de picos consiste en definir cuantos picos se encuentran bajo el cono influencia del perfil de fusión con mayor fluorescencia a la Tm determinada para cada montaje. Como se puede observar en la figura 22, el diagrama de la derivada negativa de la fluorescencia por temperatura para la detección de OGM, muestra un pico en la parte inferior delineado por la línea del pico la cual diferencia el área de influencia del perfil de fusión con la que está por fuera de esa influencia. Es importante aclarar, que lo que define que un pico sea más profundo es específicamente la fluorescencia final determinada luego del proceso de amplificación.

Como se puede observar en la Tabla 17, si solo un pico se encuentra a la Tm determinada para el montaje, la ponderación de calificación de esa concentración de ADN para el amplicón es de 1,0. En la ponderación de 1,0 gráfica a., se observa que únicamente se tienen un pico que se encuentra aproximado a 66.5°C que es el pico esperado para el perfil de fusión. De igual forma, en la gráfica b. un solo pico se encuentra a la Tm esperada, sin embargo, dos picos de aproximadamente 65°C se encuentran cerca al cono del pico de mayor fluorescencia. Para estos casos, si el pico del perfil se ubica sobre la línea del pico de mayor fluorescencia, se considera que esa réplica aporta un valor para la ponderación de

0,5. Si el pico se encuentra por fuera del área de influencia del cono, la ponderación para esa réplica es de 0,0. Por tal razón, como las dos replicas se encuentran por fuera del área de influencia del pico de mayor fluorescencia, cada una lleva un valor de 0,0 y el pico contemplado aporta 1,0 para un ponderado final por las tres réplicas de 1,0. Por ejemplo, en el caso de la ponderación de 1,5 la gráfica b., la Tm práctica esperada es de 66,7 en promedio, lo que corresponde al pico del centro del gráfico. Como el pico del tercer perfil se encuentra sobre el trazado de la línea del pico, este aporta un valor de 0,5 para el ponderado total de la réplica; por esta razón, el total de la réplica es de 1,5. Debido a que el objeto del análisis es determinar la concentración de ADN óptima para realizar la amplificación eficaz y que le aporte la menor cantidad de variación al pico en HRM, la concentración definitiva deberá ser la que para la mayoría de amplicones muestre la mayor ponderación con respecto a los otros.

Figura 22. Partes del pico esperado para HRM en la detección de OGM.