Porcentaje de infección e Índice de severidad

De acuerdo con la figura 16 A que representa al control positivo, se observó que en las primeras 24 h el fruto no presentó daño, sino 26 h después de la inoculación, pero a partir de las 48 h de incubación cuando la enfermedad progresó rápidamente, y a las 72 h el daño fue más aparente observándose una lesión más severa en el fruto, de manera que al final del experimento (96 h) la lesión abarcó la mayoría del fruto dejándolo casi totalmente macerado, además de que el hongo ya se encontraba en la fase de esporulación. Mientras que en la figura 16 B se muestra el testigo negativo en donde no se observó daño alguno, y el fruto presentaba una apariencia saludable.

Los frutos del control positivo inoculados artificialmente, presentaron un 80% de infección con un índice de severidad igual a 3.8. Este valor correspondió al máximo daño producido por R. stolonifer 96 h después de haber sido inoculado.

El desarrollo de la enfermedad en todos los tratamientos tuvo la misma tendencia, al principio lento y al final el desarrollo fue más rápido. A pesar de eso en algunos tratamientos el número de frutos infectados fue bajo. Como es el caso del quitosano a 10 mg mL-1 en donde se presentó el menor porcentaje de infección (23 %). Mientras que el mayor porcentaje de infección se presentó con canela a 300 µg mL-1 con un 56.7 % de infección. Lo que indica que casi todos los tratamientos estuvieron por debajo del 50 % de infección.

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Figura 16. Desarrollo de la pudrición blanda durante la incubación. A) Control positivo, B) Control

negativo. 1=0 h, 2=24 h. 3=48 h, 4=72 h y 5= 96 h, después de la inoculación.

Esto da lugar a decir que la mayoría de los tratamientos redujeron considerablemente la pudrición blanda causada por R. stolonifer, sin embargo, el único tratamiento que presentó diferencias estadísticas con respecto al control positivo fue quitosano a 10 mg mL-1. Quitosano a 10 mg mL-1 redujo la pudrición, presentando el mejor efecto antifúngico con respecto al control positivo y a los demás tratamientos, incluyendo las combinaciones de quitosano con los AE (cuadro 5).

También se observó que en casi todos los tratamientos el índice de severidad fue muy bajo comparado con el testigo sin tratamiento ya que todos los tratamientos presentaron un índice de severidad entre 0.67 a 1.8

2 5 3 4 A B 2 3 ₄ 1 5 1

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Cuadro 8. Porcentaje de infección e índice de severidad en jitomates inoculados con R. stolonifer después de la aplicación de quitosano combinado con los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300 µg mL-1 y dicloran.

Tratamientos Porcentaje de infección Índice de severidad

Control + 80±5.77 c 3.47±0.35c Control - 0±0 a 0±0a Dicloran 46.66±8.82 ab 1.33±0.29 ab Q10 23.33±8.82 ab 0.67±0.23 ab Ca 300 43.33±12.02 abc 1.11±0.26 ab Cl 300 56.67±3.33 bc 1.80±0.33 bc To 300 53.33±16.70 bc 1.80±0.33 bc Q10 Ca300 46.67±3.33 abc 1.33±0.29 ab Q10 Cl300 36.67±3.33 abc 1.03±0.28 ab Q10 To300 50.00±8.82 bc 1.37±0.28 ab gl= 20,9 P>0.050 H=66.82 P>0.001

Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas

Además con lo que respecta al índice de severidad, la mayoría presentaron diferencias estadísticas con respecto al control, el quitosano destaca ya que fue el tratamiento con menor índice de severidad 0.67% (Cuadro 8). Mientras que los AE de clavo y canela no presentaron diferencias estadísticas con respecto al control.

En las figuras 17 y 18 se ilustra el daño causado por R. stolonifer en los frutos de jitomate con cada tratamiento, al final del experimento. Como ya se había mencionado en la fase in vitro, se esperaba un efecto aditivo o sinérgico al mezclar el quitosano y los AE, lo cual no

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sucedió, ya que el único tratamiento que presentó un efecto importante fue quitosano a 10 mg mL-1, inclusive fue mejor que el tratamiento con dicloran, lo que indica que es más conveniente el uso del quitosano de forma individual.

Los AE no presentaron el efecto esperado, esto pudo deberse a su naturaleza debido a que poseen una gama amplia de compuestos volátiles (Guynot et al., 2003), lo que probablemente con el paso del tiempo permitió que disminuyeran sobre la superficie del fruto, sobre todo para clavo y tomillo ya que el aceite de canela presentó mejor efecto que los otros dos AE; se considera esto porque los frutos tratados permanecieron a temperatura ambiente y se colocaron en recipientes que fácilmente permitieron la entrada y salida de aire. Lo que pudo aumentar la volatilización de los compuestos con efecto antifúngico de los aceites. Esta pudo ser una de las razones por las cuales no se vio el efecto esperado.

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Figura 17. Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de R. stolonifer con los aceites esenciales a 300µg mL -1 y los controles. A) Control positivo, B) Control negativo, C) Clavo,

D) Canela y E) Tomillo. E D C B A

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Figura 18. Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de R. stolonifer con las diferentes combinaciones de quitosano (Q10) con los aceites esenciales (Ca, Cl, y To) a 300 µg mL-1 y dicloran (D). A) Control positivo, F) Q10Cl3, G) Q10Ca3, H) Q10To3, I) Q10 y J) D.

J I H G F A F A J

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Además hay que tener en cuenta de que existen diferentes factores que intervienen sobre el efecto de los AE. Uno de ellos es el pH, ya que de acuerdo a Juven et al., (1994) se sabe que la actividad antimicrobiana del AE de tomillo se ve favorecida a pH bajo, facilitando su paso por la membrana de las bacterias, de manera que es posible que el pH del ambiente en el que actúa el AE, (que en este caso sería el fruto o la solución de quitosano) pueda modificar su mecanismo de acción en los diferentes microorganismos.

Otros datos que concuerdan con lo anterior, son referidos por Burt (2004) y Gutiérrez et al. (2009), que dan a conocer que el mejor efecto antimicrobiano de los AE se presenta a temperaturas bajas, a un pH aproximado de cinco y a bajas condiciones de oxígeno, así como la presencia de los azúcares simples presentes en el medio.

Estos estudios sugieren que los tratamientos empleados en esta investigación pudieron verse afectados, primero porque la temperatura utilizada en los ensayos in vivo fue a temperatura ambiente (25 ± 3° C), además el pH en el caso de las combinaciones con quitosano fue mayor de cinco. Con respecto al contenido de oxígeno, que no fue medido en esta investigación, pero que se considera no es el que se recomienda, ya que los frutos estuvieron en recipientes que permitieron el contacto directo con el ambiente. Por lo que se sugiere que en estudios posteriores se tomen en cuenta estas condiciones.

Es importante recalcar que las condiciones in situ empleadas son completamente diferentes a las de la fase in vitro, pues las condiciones fueron más controladas con respecto a la humedad, el contenido de nutrientes, la atmosfera y la temperatura;

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mientras que in situ las condiciones cambiaron, primordialmente por el modelo utilizado (jitomate) y la diferencia del ambiente.

Además en otros estudios se ha observado que los medios de cultivo tienen un mayor contenido de agua, lo que favorece el efecto de los aceites, mientras que en los frutos el contenido de agua puede ser menor, lo que obstaculiza el efecto de los AE (Smith-Palmer et al., 2001).

Existen reportes en los que los AE por si solos son capaces de contrarrestar enfermedades postcosecha, como es el caso de la aplicación de los AE de clavo y canela que fueron efectivos contra C. musae, Lasiodiplioidia theobrome Pat y F. proliferatum (T. Matsushima) Nirenberg en frutos de plátano (Ranasinghe et al., 2002, 2005). A diferencia de los resultados de este trabajo en donde los AE de clavo y tomillo no presentaron diferencias estadísticas con respecto al control. En otro estudio con el AE de clavo, se observó un efecto antifúngico significativo, pero este efecto no fue mayor al del fungicida químico sintético utilizado.

De acuerdo a estos resultados con respecto al dicloran, se observó que difieren de los resultados previamente encontrados por Bautista-Baños y Bravo-Luna (2004), que reportaron que el dicloran redujo de manera efectiva la pudrición blanda en frutos de jitomate en comparación con el quitosano a 2.0%. No obstante, existe concordancia con lo reportado por Badawy y Rabea (2009) en donde demostraron que el quitosano aplicado

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en concentraciones de 2 a 4 mg mL-1 pudo controlar de manera efectiva infecciones fúngicas en frutos de jitomate dañados e inoculados con B. cinerea.

Existen algunos reportes en donde el quitosano fue combinado con otros compuestos como los extractos. Sus resultados concuerdan con los nuestros ya que la combinación de quitosano con extractos acuosos de papaya no presentó un efecto sinérgico como se esperaba, ya que el mejor efecto se presentó al utilizar quitosano de manera individual (Bautista-Baños et al., 2003).

Cuando el quitosano se combinó con calcio se encontró un efecto positivo sobre las fresas, ya que aumento la calidad en sabor y tamaño (Hernández-Muñoz et al., 2006). De la misma manera Romanazzi et al. (2007) encontró que al combinar al quitosano con etanol a dosis reducidas, se presentó un efecto aditivo, o hasta sinérgico contra el moho gris de las uvas de mesa y que los resultados obtenidos fueron mejores que cuando se aplicaron de manera individual.

Las combinaciones empleadas en este trabajo no resultaron como se esperaba, lo cual no significa que el quitosano no se pueda combinar con otros compuestos para tener un mejor control de la pudrición blanda. Sin embargo, en este estudio se encontró que el quitosano usado de manera individual a concentraciones de 10 mg mL-1 puede combatir de manera eficiente la pudrición blanda.

Y aunque no se conoce cuál es el efecto del quitosano sobre los frutos, se infiere que el quitosano disminuye la producción de enzimas pectinolíticas o el incremento de

E

D A

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hidrolasas fúngicas (Zhuang y Quantick, 1998), por lo que se favorece el efecto antifúngico del quitosano.

Estudios previos demuestran que la aplicación del quitosano como control de enfermedades pre y post cosecha ha mejorado la calidad de frutas y vegetales, lo que da lugar a una alternativa viable que no causa toxicidad en mamíferos, el medio ambiente y además es un medio seguro para el control (Badawy y Rabea, 2009; Dutta et al., 2008).

6.5.4. Pérdida de peso

En el control positivo que es el que se inoculó con esporas de R. stolonifer se observó la mayor pérdida de peso y un grado de infección importante, lo contrario a lo que sucede en el control negativo en donde por no haber sido infectado, se esperaría que la pérdida de peso fuera menor en todos los tratamientos; sin embargo, la menor pérdida de peso se presentó con quitosano a 10 mg mL-1.

Aunque la pérdida de peso de los frutos no se encuentra separada del desarrollo de la enfermedad, aquí se hace énfasis al respecto ya que como se observa en la figura 19 el único tratamiento que presentó diferencias con respecto al control, fue quitosano a 10 mg mL-1. Queda claro que además de ser diferente con respecto al control positivo se observó que presenta menor pérdida de peso que los frutos sin tratamiento y sin enfermedad (control negativo). Estos datos confirman que el quitosano es capaz de mantener los frutos reduciendo las alteraciones fisiológicas por la madurez del fruto, es decir que puede retardar la senescencia del fruto, como confirman Bautista-Baños et al. (2005), quienes

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reportan que el quitosano es capaz de formar películas semipermeables cuando se aplican sobre frutas y verduras permitiendo que estos tengan una mayor vida de almacenamiento, que la maduración se retrase y se prevenga la pérdida de agua por efecto de transpiración y por lo tanto retarda la senescencia.

Figura 19. Pérdida de peso de los frutos de jitomate inoculados con R. stolonifer, después de aplicar quitosano a 10mg mL-1 y las combinaciones de quitosano con aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300 µg mL-1. N= 10. Las letras diferentes significan diferencias estadísticas significativas.

Como ya se menciono anteriormente las combinaciones no presentaron efecto aditivo o sinérgico en la aplicación sobre los frutos, ya que solo se observó que disminuyeron el daño presentado por los frutos pero no el número de frutos infectados y mucho menos presentaron un efecto significativo en la pérdida de peso del fruto.

c bc a bc bc bc bc bc bc b

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Por lo que se cree que ambos productos, pueden presentar cierta incompatibilidad ya que en las combinaciones a pesar de tener quitosano, no se observó un efecto parecido al presentado por quitosano utilizado de manera individual, sino que en las combinaciones el porcentaje fue mayor y no menor al presentado con los AE y quitosano empleado de forma individual, aunque esto no concuerda con lo observado en la fase in vitro. Sin embrago es importante recalcar que el comportamiento presentado in vitro puede ser distinto cuando se lleva a cabo en los organismos vivos, como lo reportan Juven et al. (1994), que los compuestos fenólicos de los aceites esenciales (como el caso del timol, eugenol, carvacrol) reaccionan con los aminoácidos de los medios de cultivo, y esta reacción reduce la efectividad de estos compuestos fenólicos, como sería el caso del timol en este trabajo. Si tomamos en cuenta que los aceites esenciales de clavo y tomillo presentan compuestos fenólicos como eugenol y timol respectivamente, que para estos AE son los principales componentes y que en el quitosano en disolución se protonan los grupos aminos (Orozco, 2007), es muy probable que exista una reacción parecida a la mencionada por Juven et al. (1994) lo que en este trabajo provocó que el efecto de los aceites esenciales fuera menor en la fase in situ.

Finalmente, se observó que los resultados in vitro no fueron reproducibles en la fase in situ de este trabajo, ya que se esperaba que los tratamientos combinados resultaran ser un mejor tratamiento para combatir la pudrición blanda en jitomate, no obstante el mejor tratamiento fue el empleo de quitosano a 10 mg mL-1 inhibiendo el desarrollo de R. stolonifer, incluso redujo considerablemente la pérdida de peso de los frutos de jitomate.

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7. Conclusiones

El quitosano a 10 mg mL-1 y los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300 µg mL-1 de manera individual presentaron el mejor efecto antifúngico in vitro, inhibiendo el crecimiento micelial, la esporulación y la geminación de las esporas de R. stolonifer.

En condiciones in vitro las combinaciones de quitosano y los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo presentaron un efecto aditivo e incluso sinérgico sobre el crecimiento micelial, la esporulación y la germinación de esporas de R. stolonifer.

En la fase in situ las combinaciones de quitosano y los aceites esenciales no presentaron un efecto antifúngico en contra de R. stolonifer.

El quitosano a 10 mg mL-1 resultó ser el mejor tratamiento en la fase in situ para inhibir la pudrición blanda y disminuir la pérdida de peso de los frutos de jitomate.

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8. Perspectivas

Evaluar el tiempo que dura el efecto del quitosano sobre los frutos de jitomate y determinar que tan rentable es el uso del quitosano para combatir la pudrición blanda.

Investigar los mecanismos de acción del quitosano sobre R. stolonifer in situ. Determinar si los frutos de jitomate sufren alteraciones organolépticas al aplicarles quitosano a concentraciones de 10 mg mL-1.

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