INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
EFECTO ANTIFÚNGICO IN VITRO E IN SITU DEL QUITOSANO Y ACEITES
ESENCIALES SOBRE Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRIA EN CIENCIAS
EN
MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES
PRESENTA
ALEJANDRA MARÍA ALVARADO HERNÁNDEZ
Este trabajo se realizó en el
Laboratorio de postcosecha, del Departamento de Interacción planta-insecto en el Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la asesoría de la Dra. en C. Laura Leticia Barrera Necha y el Dr. en C. Miguel Velázquez Del Valle Para la realización de los estudios se conto con el apoyo económico de CONACyT (becario No. 236967) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores de la Secretaría de investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el financiamiento otorgado por los proyectos de la SIP (No. 20090225) y CONACYT (No. 089675).
AGRADECIMIENTOS
Le estoy inmensamente agradecida a la M. en C. Leticia Bravo Luna por toda la paciencia que ha tenido para conmigo, por su atención, y todos los conocimientos que me ha compartido y que me atrevo a decir que no solo encontré a una maestra si no también a una gran amiga.
Al Dr. Montes porque me enseño muchas cosas, porque me ha brindado su apoyo y me ha otorgado confianza, gracias por los conocimientos que ha compartido conmigo.
A la Maestra Ely le agradezco las enseñanzas en el laboratorio, el apoyo, la confianza y sus puntos de vista que siempre me hacían discernir.
A mis compañeros y amigos Claudia, Saúl, Erika, Edith y Areli que compartieron conmigo, por el apoyo que recibí de ellos, por las experiencias vividas y las cosas que me enseñaron durante mi estancia en el CeProBi.
Al Dr. Miguel y a la Dra. Laura, que me permitieron realizar mi trabajo de tesis y me dieron la oportunidad de alcanzar uno de mis objetivos profesionales.
A mis sinodales, la Dra. Gaby Trejo, la Dra. Kalina, la M. en C. Lety, la Dra. Laura Barrera,
Dedicado con cariño:
A mi familia en general: Porque han creído siempre en mí, me han alentado a seguir el camino que he elegido, me han apoyado en todos los aspectos, han hecho que mi vida sea más placentera y llena de cosas buenas, además por que sin ellos yo no estuviera donde ahora estoy.
A mi madre; Juventina Aine, que nunca ha dejado de consentirme con sus caricias, que me ha dado confort con sus palabras, que siempre está atenta a mis quejas y festeja mis aciertos, porque es un ejemplo de vida que siempre llevaré en mi corazón.
A mi padre; Alejandro, porque siempre está al pendiente de mí, porque me saca de apuros, me escucha, me orienta, por que ha sido uno de mis grandes pilares y le estaré inmensamente agradecida.
A mi hermana Dulce María, por mantenerme con los pies en la tierra, saber escuchar y decir siempre con acierto lo que me hace seguir adelante, por que además es mi amiga y mi psicóloga, por su atención aunque muchas veces no me la merezca.
A mi hermana Diana María, que es la niña mas latosa que he conocido, pero que si no fuera por eso muchas cosas en mi vida no tendrían sentido, porque a pesar de sus regaños, siempre me ha apoyado, ha sido atenta conmigo y porque es uno de mis tesoros.
A mi pequeña hermana Ana María, que con tan solo 3 años de edad, ha sido el angelito que me inspira para salir adelante, por sus juegos y sus alegrías que comparte a diario conmigo, porque creo que sin ella las cosas nunca serian como son.
Al amor de mi vida Juan Manuel, por ser paciente, por darme todo ese amor que me ha dado y porque siempre ha creído en mi.
I ÍNDICE Capítulo Contenido pág. INDICES Índice de cuadros IV Índice de figuras V RESUMEN VII ABSTRACT VIII 1. INTRODUCCIÓN 1 2. ANTECEDENTES 4
2.1. Importancia de los productos hortofrutícolas. 4
2.2. Causas de las pérdidas postcosecha. 5
2.3. Condiciones que favorecen a las enfermedades postcosecha 7
2.4. Principales enfermedades postcosecha. 8
2.5. Control de las enfermedades postcosecha. 9
2.6. Rhizopus stolonifer como agente causal de la pudrición blanda. 12
2.6.1. Condiciones óptimas de crecimiento. 12
2.6.2. Características morfológicas de R. stolonifer. 13 2.6.3. Mecanismos de infección de R. stolonifer. 14 2.6.4. Síntomas de la pudrición blanda causada por R. stolonifer. 15
2.6.5. Control de R. stolonifer. 17
2.7. El jitomate como producto de interés en México. 18 2.7.1. Producción de jitomate en el estado de Morelos. 19
2.7.2. Generalidades del jitomate. 20
2.7.3. Importancia nutricional del jitomate. 21
2.8. Aceites esenciales. 23
2.8.1. Aceite esencial de canela. 24
2.8.2. Aceite esencial de clavo. 25
2.8.3. Aceite esencial de tomillo. 26
2.9. Quitosano. 26
2.10. Efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales. 27
3. JUSTIFICACIÓN 30
4. OBJETIVOS 31
II ÍNDICE Capítulo Contenido pág. 4.2. Objetivos particulares. 31 5. MATERIALES Y MÉTODOS 32 5.1. Material biológico. 33
5.2. Evaluación del quitosano y los aceites esenciales in vitro. 33
5.2.1. Elaboración de los medios de cultivo. 33
5.2.2. Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales. 35
5.2.3. Crecimiento micelial. 35
5.2.4. Esporulación. 38
5.2.5. Germinación. 38
5.2.5.1. Elaboración de la suspensión de esporas. 39
5.2.5.2. Evaluación de la germinación. 39
5.3. Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in situ. 41 5.3.1. Prueba de patogenicidad de R. stolonifer cepa R3. 41
5.3.2. Evaluaciones en jitomate. 43
5.3.3. Elaboración de los tratamientos empleados in situ. 43 5.3.4. Acondicionamiento de los frutos de jitomate para el bioensayo. 44
5.3.5. Almacenamiento. 45
5.3.6. Desarrollo de la escala de daño para evaluar índice de severidad. 47
5.3.7. Índice de severidad. 48
5.3.8. Porcentaje de infección. 48
5.3.9. Pérdida de peso. 48
5.4. Análisis estadístico. 49
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50
6.1. Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales. 50
6.2. Crecimiento micelial. 51
6.3. Esporulación. 59
III
ÍNDICE
Capítulo Contenido pág.
6.5. Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in situ. 74
6.5.1. Escala de daño. 74
6.5.2. Evaluaciones en jitomate. 75
6.5.3. Porcentaje de infección e índice de severidad. 77
6.5.4. Pérdida de peso. 86
7. CONCLUSIONES 89
8. PERSPECTIVAS 90
IV
No. ÍNDICE DE CUADROS Pág.
1 Principales enfermedades postcosecha causadas por hongos. 8
2 Composición química por cada 100 g de jitomate crudo. 22
3 Tratamientos individuales y combinados de quitosano y aceites esenciales para evaluar el efecto in vitro sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de R. stolonifer. 37 4 Tratamientos individuales y combinados de quitosano y aceites
esenciales aplicados in situ contra R. stolonifer.
43
5 Tasa de crecimiento e índice antifúngico de R. stolonifer con los tratamientos individuales.
55
6 Tasa de crecimiento e índice antifúngico de R. stolonifer con los tratamientos combinados.
57
7 Porcentaje de germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos individuales y las combinaciones de quitosano a 2 y 10 mg mL-1 con los AE a 100 µg mL-1. 66 8 Porcentaje de infección e índice de severidad en jitomates inoculados
con R. stolonifer después de la aplicación de quitosano combinado con los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300µg mL y dicloran.
79
V
No. ÍNDICE DE FIGURAS Pág.
1 Morfología microscópica y colonial de R. stolonifer. 16
2 Esquema general del trabajo experimental. 32
3 Capacidad infectiva de R. stolonifer al inicio del experimento. 42
4 Capacidad infectiva de R. stolonifer después de 72 h de incubación. 42
5 Sistema de almacenamiento empleado para el bioensayo 45
6 Crecimiento micelial de R. stolonifer después de 48 h de la aplicación de los aceites esenciales a tres concentraciones.
50
7 Dinámica de crecimiento micelial de R. stolonifer al ser incubado en quitosano y Aceites esenciales a 28°.
53
8 Crecimiento micelial de R. stolonifer después de 48 h de incubación con los tratamientos combinados de quitosano y aceites esenciales.
59
9 Esporulación de R. stolonifer con los tratamientos individuales. 60
10 Esporulación de R. stolonifer con los tratamientos combinados de quitosano y los AE a 100 µg ml-1.
62
11 Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos individuales a las 9 h de incubación.
64
12 Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos combinados a las 9 h de incubación.
68
13 Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos combinados a las 9 h de incubación.
69
14 Escala de daño propuesta para determinar el índice de severidad. 75
15 Frutos de jitomate en dos estados de madurez infectados por
R. stolonifer a las 96 h de incubación.
76
VI
No. ÍNDICE DE FIGURAS Pág.
17 Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de
R. stolonifer con los aceites esenciales a 300µg mL -1 y los controles.
81
18 Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de
R. stolonifer con las diferentes combinaciones de quitosano con los
aceites esenciales a 300 µg mL-1 y dicloran.
82
19 Pérdida de peso de los frutos de jitomate inoculados con R. stolonifer, después de aplicar quitosano a 10mg mL-1 y las combinaciones de quitosano con aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300 µg mL-1.
VII
RESUMEN
El jitomate es uno de los cultivos hortícolas más importante en México. Sus frutos son afectados por hongos como Rhizopus stolonifer agente causal de la pudrición blanda, enfermedad postcosecha que ocasiona pérdidas económicas importantes. Durante varios años los fungicidas sintéticos han sido utilizados para controlar las enfermedades postcosecha; sin embargo, diversos estudios han demostrado que los compuestos empleados en estos fungicidas representan un riesgo potencial para el ambiente y la salud humana. Por lo tanto, ha aumentado la búsqueda de alternativas naturales de control. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo individualmente y combinados sobre R. stolonifer. Se evaluó quitosano a dos concentraciones 2 y 10 mg mL-1, aceites esenciales a 100 y 300 μg mL-1 y combinaciones de quitosano con los aceites esenciales sobre el desarrollo in vitro de R. stolonifer (crecimiento micelial, esporulación y germinación). Se utilizaron frutos de jitomate para evaluar el efecto antifúngico del quitosano y los aceites esenciales in situ (porcentaje de infección, índice de severidad y pérdida de peso). Los resultados de los experimentos in vitro demostraron que los tratamientos más efectivos fueron obtenidos con los aceites esenciales (clavo, canela y tomillo) a 300 μg mL-1 y con quitosano a 10 mg mL-1, así como las combinaciones de estos en donde se observó un efecto aditivo en la mayoría de los tratamientos y un efecto sinérgico en la combinación de quitosano con el aceite esencial de tomillo. Los experimentos in situ mostraron que el quitosano a 10 mg mL-1 fue el tratamiento más efectivo para reducir la pudrición fúngica y la pérdida de peso de los frutos de jitomate. In situ no se observó efecto sinérgico con ninguna combinación de quitosano y aceites esenciales, mientras que in vitro se presentó efecto aditivo e incluso en algunos casos hasta sinérgico. Los resultados mostraron que el quitosano ofrece una alternativa natural a los fungicidas sintéticos para controlar la pudrición blanda en frutos de jitomate.
VIII
ABSTRACT
The tomato is one of the most important horticultural crops in Mexico. Fruits are affected by fungi such as Rhizopus stolonifer causal agent of soft rot, postharvest disease that causes important economic losses. During a number of years synthetic fungicides have been used to control postharvest diseases; however, several studies have been shown that the compounds used in these fungicides representing a potential risk for the environment and human health. Therefore, the search of natural alternatives for the control has been improved. The aim of this work was to evaluate the antifungal effect of chitosan and essential oils of clove, cinnamon and thyme, individually and in combination on Rhizopus stolonifer. Two chitosan concentrations 2 and 10 mg mL-1, essential oils at 100 and 300 μg mL-1 and combinations of chitosan with essential oils were evaluated on the in vitro development of R. stolonifer (mycelial growth, sporulation and germination). Tomato fruits were used to evaluate antifungal effect of chitosan and essential oils in situ (percentage of infection, severity index and weight loss). The results of the in vitro experiment demonstrated that the most effective treatments were obtained with the essential oils (clove, cinnamon and thyme) at 300 μg mL-1 and with chitosan at 10 mg mL-1, as well as the combinations of these where it was observed an effect additive in the majority of the treatments and a synergic effect in the combination of quitosano with the essential oil of thyme. The in situ experiment established that chitosan at 10 mg mL-1 was the most effective treatment to reduce fungal decay and weight loss of tomato fruits. In vitro no synergistic effect was observed with any combination of chitosan and essential oils. Results show that chitosan offers a natural alternative to synthetic fungicides to control soft rot in tomato fruits.
1
1. INTRODUCCIÓN
México es uno de los países con alto potencial agrícola, produciendo una amplia gama de frutas y verduras en diferentes épocas del año. La actividad hortícola es una de las más dinámicas en la agricultura mexicana y con mayor capacidad de exportación (Carrillo, 2004), México se considera como uno de los más importantes exportadores al mercado estadunidense, el cultivo de jitomate es uno de los productos hortícolas que sobresale (SAGARPA 2006, 2007). Este producto tiene importancia para la salud del humano, ya que de ellos se obtienen nutrientes esenciales, vitaminas y minerales; además de proveer compuestos antioxidantes y un alto contenido de agua (Spadaro y Gullino, 2004; Candelas-Cadillo et al., 2005; De la Torre-Ibarra et al., 2008).
El jitomate es uno de los productos económicamente más importantes en México, se producen más de 2 millones de toneladas y de éstas se exportan más de 900 000 (SAGARPA, 2006a), sin embargo, se ha reportado que 30% de la cosecha se pierde primordialmente por pudriciones causadas por microorganismos fitopatógenos; el 80% de estas pérdidas son ocasionadas por Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. y Alternaria alternata (Nees) (Hahn, 2006).
R. stolonifer causa la enfermedad denominada pudrición blanda, afectando al jitomate así como a una gama de productos hortofrutícolas, generando pérdidas económicas considerables en poco tiempo (Bonaterra et al., 2003; Zhang et al., 2004 y Hahn, 2006). Estas pérdidas se producen en un periodo de aproximadamente 4 a 6 días, debido a que este hongo tiene un crecimiento rápido y es de fácil transmisión por heridas producidas
2
durante la manipulación del fruto, principalmente en frutos maduros (Northover y Zhou, 2002; Bonaterra et al., 2003; Hahn, 2006; Hernández-Lauzardo et al., 2008; Velázquez del Valle et al., 2008). Tradicionalmente se han usado fungicidas químicos sintéticos como dicloran (Botran), iprodione, fludioxonil (Scholar 50WP), tebuconazol (Elite) entre otros, para controlar las pudriciones causadas por R. stolonifer con los beneficios y riesgos que implica el uso de los mismos (Adaskaveg et al., 2005). Actualmente, se buscan alternativas naturales que no afecten la salud del humano y al medio ambiente; algunas de ellas son el uso de quitosano y aceites esenciales (AE), los cuales se han utilizado de manera individual en diferentes áreas (Bautista-Baños et al., 2006; Lárez, 2006). Algunos estudios han demostrado que ambos productos por separado presentan actividad antifúngica; en el caso de quitosano se ha probado contra Botrytis cinerea Pers.:Fr., Aspergilus flavus Link, Rhizoctonia solani Kûnh, Fusarium oxisporum Link: Fr., Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. In Penz, Penicillum sppentre otros (El Ghaouth et al., 1992a; Barrera-Necha et al., 2008; Barrera-Barrera-Necha y García-Barrera, 2008). Mientras que los AE se han evaluado sobre el desarrollo de hongos como B. cinerea, Fusarium spp, A. flavus, Alternaria spp., Curvularia spp., Cercospora spp. y Monilinia fructicola Honey (El Ghaouth et al., 1992b; Rabea et al., 2003; Tripathi et al., 2004; Kishore y Pande, 2007; Xu et al., 2007). Sin embargo, el efecto que han tenido sobre estos hongos no ha sido suficiente para su control, por lo que en este trabajo se pretendió aumentar el efecto de los productos empleados, mediante la combinación de quitosano y aceites esenciales para combatir a R. stolonifer y evitar la pudrición blanda en frutos de jitomate. El objetivo de
3
este trabajo fue determinar el efecto del quitosano y de los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo de manera individual y combinada sobre el crecimiento micelial, la esporulación y la germinación de R. stolonifer así como evaluar el porcentaje de infección, el índice de severidad y la pérdida de peso en frutos de jitomate.
4
2. ANTECEDENTES
2.1. Importancia de los productos hortofrutícolas.
Además de la importancia económica, los productos hortofrutícolas tienen una gran relevancia en la salud del humano. Se considera que tanto frutas como verduras, son parte importante en la dieta, porque de ellas se obtienen nutrientes esenciales, vitaminas y minerales; además de proveer otro tipo de compuestos como los antioxidantes (Spadaro y Gullino, 2004; De la Torre-Ibarra et al., 2008), la mayoría de estos productos son reconocidos como alimentos básicos, que al consumirlas contribuyen al buen estado de salud, reforzando el sistema inmunológico, reduciendo el daño celular por efectos de radicales libres, además de reducir el riesgo de sufrir enfermedades crónico-degenerativas como cardiopatías, cáncer, diabetes y obesidad (Zhuang y Barth, 2003; Albert et al., 2002; Pomerleau et al., 2004).
Las hortalizas contienen gran cantidad de agua, generalmente entre el 85% y el 95% de su peso total y que su valor calórico suele ser bajo, pues no supera las 50 calorías por cada 100 g de parte comestible. También se consideran una fuente importante de vitaminas, ya sean hidrosolubles (vitamina B y C) o liposolubles (Vitaminas A, D, E y K) y de minerales como potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro, fósforo, yodo, cromo, selenio entre otros (Anaya y Romero, 1999; Zhuang y Barth, 2003; Salinas-Hernández, 2007; Bautista-Baños et al., 2008).
Debido a estas características, las hortalizas son altamente consumidas; es por eso que resulta importante que estos productos sean totalmente inocuos. Sin embargo, la mayoría
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de los productos hortícolas son afectados por una gran cantidad de microorganismos a lo largo de la cadena postcosecha, debido a la susceptibilidad que presentan por sus características nutrimentales, por su alto contenido de agua o bien por un mal manejo postcosecha (Agrios, 2007).
2.2. Causas de las pérdidas postcosecha.
Las frutas y hortalizas frescas son los alimentos más perecederos debido a sus características relacionadas al contenido de agua y a su actividad metabólica aún después de la cosecha, generando pérdidas postcosecha que es uno de los principales problemas para que estos productos lleguen a los consumidores y aunque estas pérdidas no pueden ser calculadas con precisión, se estima que el 25 % del total de los productos en países industrializados se pierden durante el almacén, el transporte y la comercialización; mientras que en países subdesarrollados las pérdidas exceden del 50% (Spadaro et al., 2004). Se cree que la mayor causa de las pérdidas identificadas se debe a una mala manipulación y/o mala aplicación de tecnologías postcosecha así como la clasificación y conservación de los productos (Vero et al., 2002; Neri et al., 2006).
El deterioro de los productos hortofrutícolas se clasifican de acuerdo al tipo de alteración que se presenta en los productos, que pueden ser alteraciones fisiológicas o patológicas. Las alteraciones fisiológicas son determinadas por anomalías en los procesos metabólicos ya sea por el mismo proceso de envejecimiento del vegetal, que incluye sus actividades metabólicas, como la respiración, la transpiración, la biosíntesis de etileno o bien por
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factores exógenos como temperaturas inadecuadas, nutrición, evaporación, almacenamiento etc. (Zaccari, 2003)
Las alteraciones físicas son aquellas producidas por agentes mecánicos, que provocan machucones, heridas, así como el manejo inadecuado que causa aberturas en los productos, entre otras circunstancias. Y las alteraciones patológicas que son originadas por agentes bióticos como hongos, bacterias, virus, ácaros e insectos (Spadaro y Gullino, 2004; Rivera, 2008; Zaccari, 2003). Se debe destacar que las alteraciones físicas favorecen la manifestación de las alteraciones patológicas, ya que se sabe que diversos hongos principalmente se ven favorecidos por las lesiones físicas que sufren los productos ocasionando lesiones más graves, hasta producir enfermedad en dichos productos (Zaccari, 2003).
Es importante resaltar que el mayor porcentaje de pérdida de los productos postcosecha se debe a las alteraciones patológicas, primordialmente a las pudriciones causadas por hongos y bacterias fitopatógenas (Vero et al., 2002). El grado de daño depende de la especie hortícola, de los organismos patógenos y de las condiciones del almacenamiento; lo que causa una gama diferente de enfermedades (Agrios, 2007).
Los hongos fitopatógenos son los que generan mayor cantidad de pérdidas en los productos hortofrutícolas, hasta ahora se conocen más de 100 especies responsables de la mayoría de las enfermedades postcosecha (Tripathi y Dubey, 2004).
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2.3. Condiciones que favorecen las enfermedades postcosecha.
Diversos hongos de la fase postcosecha están presentes en los productos desde antes de la cosecha, sin que éstos presenten algún signo o síntoma referente al patógeno que les invade, esto sucede porque en la mayoría de las ocasiones las condiciones ambientales se vuelven favorables para el patógeno (Rivera, 2008).
Los productos hortícolas cambian su metabolismo a lo largo de su vida, sobre todo en la fase postcosecha, generando metabolitos secundarios que al ser secretados pueden favorecer que el patógeno invada al producto; o bien el simple envejecimiento natural puede disminuir las defensas naturales que se presentan durante su estado inmaduro. Las condiciones ambientales cambian cuando los productos son recolectados, lo que da lugar a una tasa de respiración más alta, una transpiración elevada, pérdida de agua etc. La temperatura de almacenamiento es determinante para que se presente la enfermedad, ya que la mayoría de los hongos pueden desarrollarse a temperaturas ambientales con condiciones de alta humedad.
Los hongos causantes del deterioro postcosecha muestran crecimiento óptimo de 20 a 25 °C. En general, las temperaturas máximas que toleran los hongos para su crecimiento fluctúan entre los 32 a 38°C y la temperatura mínima es de 15° C ya que por debajo de esta, usualmente se inhibe el desarrollo de los hongos fitopatógenos aunque existen algunas excepciones como Penicillium spp. y B. cinerea que pueden crecer a temperaturas de 4° C (Rivera, 2008).
8
2.4. Principales enfermedades postcosecha.
Los hongos más comunes que causan enfermedades postcosecha en una variedad de productos son; A. alternata, B. cinerea, Fusarium oxisporum, Geotrichum spp., Penicillium spp, Sclerotinia spp., C. gloesporiodes y R. stolonifer (cuadro 1).
Cuadro 1. Principales enfermedades postcosecha causadas por hongos
Pudriciones Hongo Producto postcosecha Literatura citada
-Pudrición de los limones -Pudrición negra -Pudrición de los tomates -Pudrición de los tubérculos
Alternaria alternata Limón, naranja, tomate, pimientos, berenjenas, manzanas, pepinos, calabaza, melones, col, cerezas, uva y fresas.
Papa, camote, etc.
-Agrios, 2007 -Bruton, 1996 -Maass, 1998 -Hahn, 2006 -Pudrición del moho gris
Botrytis cinerea Fresa, cebolla, lechuga, vid, manzana, peras, manzanas, cítricos, tomates, cebollas entre otros.
-Adaskaveg et al., 2005 -Bartz, 2003.
-Chu et al., 2001 -El Ghaouth et al., 1992ª Pudrición café
(mohos rosados)
Fusarium oxysporum Naranjas, limones, papá, bulbos de ornamentales, raíces, cucurbitáceas y tomates.
-Barrera-Necha et al., 2009.
Pudriciones ácidas Geotrichum spp. Tomates, zanahorias, entre otros frutos y hortalizas. -Bruton, 1996 -Pudrición del moho azul -Pudrición del moho verde Penicillium digitatum Penicillum expansum
Todo tipo de cítricos; manzanas, peras, membrillos, uvas, cebollas, melones, higos, camotes etc.
-Neri et al., 2006 -Palou, 2007 -Pudrición algodonosa -Pudrición blanda aguanosa Sclerotinia spp. Limones
Frijol, crucíferas, cucurbitáceas, fresas, entre muchas más.
-Bruton, 1996 -Maass, 1998
Antracnosis Colletotrichum gloeosporioides
Papaya, berenjena, tomate, cucurbitáceas , mango, plátano
-Bautista-Baños et al., 2003.
Pudrición blanda R. stolonifer Fresas, camotes, duraznos, cerezas, papaya, cacahuates, maíz, tomate, jitomate, melón, zanahoria, sandía, frijol, chícharo, berenjena, ciruela, plátano, mango, aguacate, uva etc.,
-Abd Alla et al., 2008 -El Ghaouth et al., 1992ª -Hahn, 2006
-Mari et al., 2004 -Zhang et al., 2004
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Los diferentes tipos de pudriciones que se presentan en los productos hortofrutícolas causan las pérdidas de mayor importancia. Uno de los principales hongos fitopatógenos que causa pudrición es R. stolonifer ya que afecta a una gama amplia de productos hortofrutícolas, como son ciruela, uva, plátano, mango, frijol, melón, zanahoria, por mencionar algunos productos, así como jitomate (Bonaterra et al., 2003; Zhang et al., 2004 y Hahn, 2006). Los cuales pueden ser afectados en poco tiempo por las características del hongo, originando la pérdida total del producto y por consecuente pérdidas económicas considerables.
En México se calcula el 30 % de la cosecha de jitomate se pierde debido a las enfermedades postcosecha y aproximadamente el 80% del total de las pérdidas se deben primordialmente a dos hongos; Alternaria alternata y R. stolonifer (Hahn, 2006).
2.5. Control de las enfermedades postcosecha
La pérdida de productos por las enfermedades postcosecha, genera pérdidas económicas importantes, por lo que el hombre ha tratado de evitar este tipo de problemas usando diferentes métodos de conservación, uno de ellos es el uso de compuestos químicos sintéticos que se utilizan como un método principal. Anualmente se aplican 23 millones de Kg de estos compuestos a frutas y verduras (Tripathi et al., 2004), que son incorporados comúnmente antes y durante la cosecha, por lo que el hombre está directamente expuesto a estos productos, siendo una de las razones más importantes para evitar el uso de fungicidas químicos sintéticos, ya que presentan efectos nocivos a la salud como; la carcinogénesis, la teratogénesis así como toxicidad residual cuando se consumen frutas y
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verduras que han sido expuestas y prontamente consumidas, como es el caso de los productos para el consumo en fresco, siendo una problemática la aplicación de agroquímicos que resulta especialmente importante durante la fase postcosecha, ya que es cuando el producto está más próximo al consumidor; además se han desarrollado cepas fúngicas resistentes y han ocasionado contaminación ambiental (Bautista-Baños et al., 2000; Cia et al., 2007; Spadaro et al., 2004, Tripathi et al., 2004; Vero et al., 2002). Por lo que actualmente se buscan alternativas que sean menos riesgosas para la salud y el medio ambiente, pero efectivas para el control de las enfermedades postcosecha.
Muchos estudios postcosecha sugieren el empleo de métodos físicos como el curado, la irradiación, la conservación frigorífica, el uso de atmósferas controladas, entre otros; algunos más proponen el control biológico o bien el uso de sustancias naturales o de síntesis química, que presenten los mínimos efectos secundarios sobre el medio ambiente y los seres vivos (Burt, 2004; Hussain et al., 2008; Kordali et al., 2008; Spadaro y Gullino, 2004; Lurie, 2001; Wisniewski et al., 2001; Tripathi y Dubey, 2004 y Vero et al., 2002 ).
Esto ha dado lugar a que se estudien sustancias presentes de forma natural tanto en plantas como en animales e incluso de microorganismos. Las sustancias naturales obtenidas de las plantas, son primordialmente metabolitos secundarios obtenidos como extractos vegetales, aceites esenciales, fitoalexinas y compuestos aromáticos, entre otros. Ya que se ha observado que éstos presentan efectos fungicidas e insecticidas (Win et al., 2007; Kordali et al., 2008; Domingo y López-Brea, 2003). Con lo que respecta a las sustancias obtenidas de los animales podemos mencionar a algunos péptidos
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antimicrobianos, proteínas, e incluso polímeros como el quitosano que presentan actividad antifúngica contra diversos patógenos postcosecha (González-Candela et al., 2001).
El uso de los diferentes métodos antes mencionados difícilmente cubre el espectro de acción, los niveles de efectividad y la persistencia que proporcionan los fungicidas químicos sintéticos convencionales. Así que actualmente se dedican esfuerzos para evaluar la integración de varios métodos o tratamientos que sean compatibles o complementarios entre sí. Buscando dos tipos de efecto; un efecto sinérgico o aditivo (efecto curativo) y un efecto persistente (efecto preventivo) haciendo que el tratamiento combinado controle las infecciones en el momento y a lo largo de la cadena postcosecha (Palou, 2007). Lo que contribuiría a disminuir el uso de los fungicidas químicos sintéticos y así reducir su efecto nocivo y residual; y poder integrar los tratamientos combinados a un manejo de tecnología postcosecha.
De manera que en este trabajo se emplea la combinación de dos sustancias naturales como el quitosano (de origen animal) y los aceites esenciales (origen vegetal), para inhibir la pudrición blanda causada por R. stolonifer en jitomate, de los cuales se sabe que tienen efecto fungicida, que no causan daño a la salud del humano ni al medio ambiente de acuerdo a Velázquez del Valle et al. (2008).
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2.6. Rhizopus stolonifer como agente causal de la pudrición blanda
Rhizopus stolonifer, significa “Que en el pie de la raíz lleva un vástago”, su significado proviene del griego rhíza ριζα (raíz) y poûs πους (pie) y del latín stolo-onis (vástago, retoño) y fero (portar) (Pontón et al., 2002).
Se encuentra clasificado dentro del Phylum: Zygomycota; Orden: Mucorales; Familia: Mucoraceae; Género: Rhizopus; Especie: Rhizopus stolonifer (Pontón et al., 2002; Agrios 2007).
R. stolonifer es conocido también como moho negro del pan, se considera como un hongo que provoca una importante enfermedad postcosecha en frutos maduros, en todas las áreas de producción alrededor del mundo. Se han registrado pérdidas desde un 50 hasta el 100 % en el área de producción (Ogawa, 1995). Además de que es un hongo que se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza (Northover y Zhou 2002; Zhang et al., 2004). Comúnmente vive como saprófito y en ocasiones como parásito (Carlile y Watkinson 1994). A pesar de eso puede afectar a un gran número de productos agrícolas.
2.6.1. Condiciones óptimas de crecimiento.
R. stolonifer es uno de los mucorales más frecuentes que tiene una distribución amplia en todo el planeta. Su temperatura de crecimiento varía desde los 10 hasta los 33° C, con una temperatura óptima de 25° C. Este hongo se ve afectado severamente por temperaturas menores de 5° C. Con frecuencia se encuentra en suelos con arena, en la composta, en el polvo de las casas, en la pulpa de la madera, estiércol, panales de abejas, nidos y plumas de aves, así como en diferentes frutos y semillas (Pontón et al., 2002). Las esporas de R.
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stolonifer no son abundantes en el aire libre, aunque su frecuencia aumenta en lugares donde hay humedad y se acumula vegetación muerta (Velázquez del-Valle et al., 2008). Cuando se establece en los productos agrícolas aprovecha las lesiones que provocan algunos insectos o que fueron provocadas por el mal manejo de los productos. Una vez establecido, el hongo coloniza rápidamente a su hospedero dando lugar al establecimiento y desarrollo de la enfermedad, lo que provoca que de 4 a 6 días se hayan contaminado la mayoría de los productos y se tengan considerables pérdidas postcosecha (Velázquez-del Valle et al., 2008).
2.6.2. Características morfológicas de R. stolonifer.
R. stolonifer es un hongo filamentoso, presenta un micelio que carece de septos y produce esporangióforos largos, aéreos sin ramificar (Carlile y Watkinson 1994; Agrios, 2007), de color pardo oscuro que nacen de un nudo de rizoides bien desarrollado, hasta formar en la punta los esporangios, que son esféricos pequeños con columnela y contienen en su interior a las esporangiosporas (Figura 1), que pueden ser de diferentes formas como; elipsoidales, globosas y angulares, en la superficie presenta ornamentaciones, que son estriadas y lisas, se encuentran a lo largo de la espora y son de color oscuro (Bartz, 2003; Hernández-Lauzardo et al., 2006). Cuando estos esporangiosporas se encuentran sobre una superficie que mantiene las condiciones adecuadas para la germinación y desarrollo del hongo, las esporas germinan y se forman los estolones que son hifas que se adaptan a la superficie y que junto con los rizoides
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forman puntos de contacto con la superficie y se da lugar a la formación de más estolones que se desarrollan en todas direcciones (Villanueva, 2004; Agrios, 2007).
Produce esporas sexuales denominadas, zigosporas que tienen una pared celular gruesa, rugosa y de color negro, representan la etapa latente o invernante del hongo, que cuando germina forma el esporangióforo, esporangio y gran cantidad de esporas (figura 1e). Generalmente lo esporangióforos se unen en grupos de tres (figura 1a y 1b) (Villanueva, 2004; Agrios 2007). Actualmente se conocen 13 especies del género Rhizopus, algunos saprófitos y otros parásitos de frutas y otros órganos vegetales (Smith, 1992; Abe et al., 2006; Jennessen et al., 2008).
2.6.3. Mecanismos de infección de R. stolonifer
Generalmente la infección por R. stolonifer en frutos y vegetales ocurre primordialmente durante la fase postcosecha, dado que en esa fase los productos sufren lesiones que permiten la entrada del hongo (Bartz, 2003; Bautista-Baños et al., 2008). Es importante que las heridas sean recientes para que las esporas germinen. Una vez germinadas las esporas se producen hifas, estas secretan enzimas pectinolíticas que degradan y disuelven las sustancias pécticas de la lámina media en las células, dando lugar a la perdida de cohesión entre ellas, provocando que las rodee una sustancia líquida, lo que da como resultado la pudrición blanda. Posteriormente, secreta enzimas celulolíticas que provocan la completa desintegración de las células de los tejidos vegetales (Maass, 1998; Barkai-Golan, 2001).
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2.6.4. Síntomas de la pudrición blanda causada por R. stolonifer
Una vez que el hongo se ha establecido en el producto, la zona de infección se torna oscura, como si estuviese embebida en agua, por consecuencia se torna blanda y acuosa. Mientras las células vegetales no hayan muerto el micelio crece intercelularmente sin invadirlas hasta que mueran, los productos infectados rápidamente se colapsan y derraman un líquido claro, de lo que resulta una grave contaminación para los productos vecinos cuando alcanzan su maduración, así la pudrición avanza con gran rapidez (Maass, 1998; Bartz, 2003; Abd Alla et al., 2008).
En poco tiempo las hifas del hongo crecen hacia fuera a través de las heridas del fruto y cubren las zonas afectadas con la producción de esporangióforos; el hongo se extiende hasta la superficie de las porciones sanas de los frutos afectados; al principio se desprende un olor ligeramente agradable y posteriormente un olor a rancio; finalmente los órganos vegetales se momifican, se degradan o desintegran formando una masa aguanosa (Ogawa et al., 2004; Agrios 2007).
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Figura 1. Morfología microscópica (40 X) y colonial de R. stolonifer. 1a) esporangióforos (Es) aéreos agrupados en tres, 1b) Esporangios de color negro (Eo), 1c) Columnela (Co), 1d) Rizoides (Ri), 1e) Zigosporas (Z), 1f) Esporangiosporas (Ep) y 1g) Colonia de R. stolonifer ocupando toda la superficie de una caja con PDA.
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2.6.5. Control de R. stolonifer
Se sabe qué R. stolonifer es capaz de afectar a una gran cantidad de frutas y hortalizas, como ya se ha mencionado anteriormente, por lo que para su control se debe tomar en cuenta el tipo de fruta u hortaliza que está siendo afectado. En el caso del durazno se han empleado tres prácticas principales, primero el tratamiento pre cosecha con un fungicida químico sintético aplicado en aerosol, posteriormente puede emplearse la cosecha temprana o bien un tratamiento pre almacenamiento y en tercer lugar un tratamiento en frío después del almacenamiento, tratando los frutos conjuntamente con cera antes del embalaje (Northover y Zhou, 2002). En otras frutas y hortalizas como camote, papaya jitomate entre otros se han aplicado las dos primeras prácticas de control. Los fungicidas químicos comúnmente utilizados son el dicloran, iprodione, fludioxonil y tebuconazol (Adaskaveg et al., 2002).
El dicloran ha sido considerado muy eficaz contra la pudrición causada por R. stolonifer, se ha utilizado tanto en la fase pre cosecha en forma de aerosol (ajo, algodonero, apio, batata, berenjena, cacahuate, calabacín, cebolla, endibia, fresa, frutales de hueso, frutas de caña, girasol (para multiplicación de simiente), judía, lechuga, ornamentales, patata, pepino, pimiento, tomate, vid, zanahoria, etc.), como en la fase postcosecha sumergiendo los frutos (ciruela, tomates, jitomates, nectarinas, duraznos, cítricos, fruta de hueso y pepita etc.) en una solución con este agente químico; aunque es un fungicida residual, lo que da lugar a que los frutos tratados presenten residuos color amarillo que hace que a la vista del consumidor tengan un mal aspecto. El iprodione también es considerado como un
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fungicida eficaz contra R. stolonifer. En Canadá ha sido utilizado durante la pre cosecha con resultados aceptables. Se considera que el tebuconazol y el propiconazol (Orbit) son tan represivos contra este fitopatógeno, como el iprodione y el dicloran durante 6 días, pero su control es inferior después de 8 días de incubación a temperaturas de 16-26° C (Adaskaveg et al., 2002; Northover y Zhou, 2002).
También se ha utilizado la combinación de dos o más fungicidas químicos sintéticos, siendo que en la actualidad se ha registrado la resistencia de las cepas a los diferentes tratamientos químicos antes expuestos, además de que la mayoría son residuales y por lo tanto pueden causar efectos secundarios en el consumidor. Por esto se han hecho varios estudios para combatir a R. stolonifer de manera natural. Esto incluye el uso de métodos físicos como son las atmósferas controladas, tratamientos con calor y las radiaciones. También se han usado alternativas naturales como control biológico usando algunas levaduras propias de los frutos o productos hortícolas (Qing y Shiping, 2000). De la misma manera se ha evaluado el uso de sustancias provenientes de plantas que presentan características fungicidas, como algunos extractos, aceites esenciales, acetaldehído, etc. así como el quitosano (Northorver y Zhou, 2002; Hernández-Lauzardo et al., 2007; Abd Alla et al., 2008).
2.7. El Jitomate como producto hortícola de interés en México.
A nivel mundial el jitomate ocupa el segundo lugar entre las hortalizas; y aunque México ocupa el décimo lugar en producción, le corresponde el tercero en comercialización del fruto. En México el jitomate es considerado como la segunda especie hortícola más
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importante por la superficie sembrada y como la primera por su valor de producción (Arrellano y Gutiérrez, 2006).
En el periodo comprendido a los años 2000-2005 la producción de jitomate fue de dos millones 160 mil toneladas (SAGARPA 2006a; Martínez-Romero et la., 2008), de las cuales se exportaron a los mercados internacionales más de 902 mil 515 toneladas de esta hortaliza, lo que representó divisas por el orden de mil 131 millones de dólares durante el 2005 (SAGARPA, 2006b). En el 2007, México exportó jitomate a EU con un valor cercano a los 1,200 millones de dólares, lo que representó el 8% de las exportaciones totales de productos agropecuarios del país que equivale al 80% del jitomate que importa EU (Martínez-Romero et al., 2008). Finalmente la rentabilidad del cultivo está en función entre otros factores de la vida postcosecha, pues de ella depende el éxito de comercialización, que es generalmente largo y el consumidor es exigente (Arellano y Gutiérrez, 2006). Igualmente el jitomate es la hortaliza más importante para procesamiento en términos de valor, volumen y actividad, que redunda en la generación de empleos (Chauvet y Massieu, 1996).
2.7.1. Producción de jitomate en el estado de Morelos
En el estado de Morelos, el jitomate se produce a cielo abierto; ya sea en temporal o de riego y en invernadero; su producción representa 2 mil 591 hectáreas cultivadas a cielo abierto en el ámbito estatal, con una derrama económica de 170 mil pesos por ha. Con base en los registros realizados por el Distrito de Desarrollo Rural Zacatepec-Galeana en el
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año 2002, en el estado de Morelos se produce jitomate en 18 municipios, entre los que destacan: Atlatlahuacan con 1 502 hectáreas, Tepoztlán (136 ha), Cuautla (69 ha) y Cuernavaca (51 ha). En estos cuatro municipios se encuentra el 80% de la superficie sembrada y se obtiene el 80% de la producción de jitomate del estado (León y Guzmán, 2004). La producción de jitomate bajo condiciones de riego se localiza en los Municipios de Cuautla (69 ha), Ayala (47 ha) Tepalcingo (47 ha) y Coatlán del Río (35 ha), principalmente. La diferencia con las zonas de temporal es más marcada en rendimiento por hectárea que en el precio de venta; en este sentido, en algunos municipios se registran rendimientos mayores hasta en 100% con respecto a la producción en temporal (Morelos-POA, 2008).
En el estado de Morelos, la producción de jitomate se mantiene durante todo el año, con incrementos en los meses de agosto, septiembre y octubre; tiempo en que se cosecha el jitomate que se produce a cielo abierto (León y Guzmán, 2004; Morelos-POA, 2008; SAGARPA, 2003c).
2.7.2. Generalidades del jitomate
El jitomate o “tomate rojo” es una planta originaria de América tropical, cuyo origen se localiza en la región de los Andes (Chile, Colombia, Ecuador, Bolivia y Perú), en donde encuentra la mayor variabilidad genética y abundancia de tipos silvestres (Peralta y Spooner, 2007). México al igual que Perú se considera a nivel mundial como el centro más importante de domesticación del jitomate. Esta hortaliza fue llevada a Europa en 1554
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empezando a comercializarse en Estados Unidos hacia el año 1835 (Peralta y Spooner, 2007).
El jitomate se clasifica en el orden Solanales, familia Solanaceae; género Solanum y especie Solanum lycopersicum L. , también conocido como Lycopersicum esculentum Mill., es una planta herbácea perenne que produce una baya que va de un color amarillo hasta rojo y que por sus características nutritivas es altamente consumida alrededor del mundo (Peralta y Spooner, 2007).
La palabra jitomate procede del náhuatl xictli, ombligo y tomātl, tomate, que significa tomate de ombligo. Como una curiosidad, debe notarse que aunque la palabra tomate viene del náhuatl tomatl, en el sur de México el tomate es conocido como jitomate, mientras que se le llama tomate al tomatillo o tomate verde (Physalis ixocarpa L.).
2.7.3. Importancia nutricional del jitomate.
El jitomate es un alimento con escasa cantidad de calorías, la mayor parte del peso del fruto es agua y el segundo constituyente en importancia son los hidratos de carbono, los que le confieren un sabor dulce, también contiene algunos ácidos orgánicos que le proporcionan el sabor ácido característico; el jitomate es una fuente importante de minerales como el potasio y el magnesio, tienen vitaminas como la B1, B2, B5 y la vitamina C, también presenta carotenoides como el licopeno (pigmento rojo). La vitamina C y el licopeno son excelentes antioxidantes que pueden tener una función protectora para el organismo (Ejechi-Bernard et al., 1998; Gebhardt y Thomas, 2002). Este último es
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un compuesto que además de poseer propiedades antioxidantes, actúa protegiendo a las células humanas del estrés oxidativo, producido por la acción de los radicales libres que son uno de los principales responsables de las enfermedades cardiovasculares, del cáncer y del envejecimiento. Además, actúa modulando las moléculas responsables de la regulación del ciclo celular y produciendo una regresión de ciertas lesiones cancerosas (Gebhardt y Thomas, 2002).
Cuadro 2. Composición química por cada 100g de jitomate crudo
Componente Cantidad Componente Cantidad
Agua 94g Carbohidratos 4.3 g Calcio 7.0 mg Sodio 1.2 mg Magnesio 10 mg Fibra 0.5 g Fierro 0.4 mg Grasa 0.2 g Fósforo 23 mg Proteínas 0.9 g Potasio 204.0 mg
Acido ascórbico 17.6 mg Provitamina A 0.38 mg
Glúcidos 2.8 g Vitamina B1 0.06 mg
Vitamina B2 0.04 mg Vitamina B6 0.11 mg
Vitamina C 0.7 mg Energía 19.0 Kcal
Fuente: Ensmigner et al., 1995
Se sabe que por cada 100 g de tomate se consumen solamente 18 Kcal. En el cuadro 2 se provee información sobre los principales constituyentes nutritivos del jitomate.
Por otro lado, el jitomate inmaduro contiene solanina que resulta ser tóxica para el humano, por lo que no debe consumirse en ese estado de madurez (Peralta y Spooner,
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2007). Aunque el jitomate en estado maduro es altamente recomendable para el consumo humano además de que se puede consumir fresco y procesado.
2.8. Aceites esenciales
Los aceites esenciales son líquidos oleosos, aromáticos, volátiles, obtenidos de diferentes partes de la planta, como tallos, flores, hojas, raíces, semillas, frutos etc. Pueden obtenerse por diferentes métodos pero el más común es por destilación utilizado primordialmente para la producción (Burt, 2004; Al-Bayati, 2008). Se estima que aproximadamente se conocen más de 3000 aceites esenciales y que 300 de ellos tienen importancia comercial, ya que se usan en diferentes productos ya sean de belleza, en alimentos, como condimentos o sabores entre otros usos (Burt, 2004; Maguna et al., 2006; Tullio et al., 2007). Se sabe que algunos aceites esenciales tienen efecto antibacteriano, antifúngico, antiviral, insecticida y además poseen propiedades antioxidantes así como antiinflamatorias (Chericoni et al., 2005; Kordali et al., 2008; Inoyue et al., 2006; Maguna et al., 2006; Matan et al., 2006).
Los aceites esenciales están constituidos por una mezcla compleja de compuestos, principalmente terpenos, alcoholes fenólicos como es el caso del timol, carvacrol, eugenol; alcoholes no fenólicos como el geraniol, linalol, aldehídos, cetonas, ácidos y ésteres, entre otros y cada planta puede tener hasta 100 sustancias químicas distintas en diferentes cantidades y que en conjunto proporcionan al aceite esencial características propias (Tripathi et al., 2004; Ortuño, 2006). Se considera que de manera natural juegan
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un papel importante en los mecanismos de defensa de la planta en contra de microorganismos fitopatógenos, algunos tienen efecto antifúngico; reducen el crecimiento de las hifas, inducen la lisis provocando la evacuación citoplásmica del hongo e involucra cambios en la composición de la célula, ruptura de la membrana plasmática, desorganización estructural de la mitocondria e interferencia de las reacciones enzimáticas de la membrana mitocondrial (Kishore y Pande, 2007). Además de que los aceites esenciales son compuestos naturales y por consecuencia son biodegradables, no son residuales y no afectan al ambiente (Tripathi et al., 2004).
De ahí la importancia del uso de los aceites esenciales para el control de enfermedades fúngicas. En este trabajo se evaluaron los aceites esenciales de canela (Cinnamomum zeylanicum Blume), tomillo (Thymus vulgaris L.) y clavo (Syzygium aromaticum L.), los cuales se eligieron por su capacidad antifúngica mostrada con diferentes hongos de acuerdo a Barrera-Necha et al. (2008).
2.8.1. Aceite esencial de canela.
La canela es de la familia Lauraceae, del género Cinnamomum que comprende aproximadamente 250 especies, él árbol es nativo de la India e Indochina, las tres especies importantes de donde se obtienen AE de interés son C. zeylanicum, C. cassia Blume y C. camphora L. La canela tiene efectos biológicos como la analgesia, es antiséptico, antiespasmódico, afrodisiaco, astringente, carminativo, hemostático, insecticida y parasiticida (Jayaprakasha et al., 2003; Santos et al., 2008).
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El aceite de esta especie se puede extraer de la hoja, del tallo o de la raíz, lo que da lugar a diferencias en sus características de aroma, sabor y composición química principalmente (Jayaprakasha et al., 2007). El uso más común es la perfumería, así como saborizantes en la industria de los alimentos, en farmacéuticos, preparaciones dentales y bebidas, entre otros productos, además, se caracteriza por que tiene un aroma dulce, picante y de gran alcance (Kubeczka y Formacek, 2002; Santos et al., 2008).
Dentro de los principales constituyentes del aceite de canela se tienen al cinnamaldehído, linalol, eugenol y en menor cantidad terpenos hidrocarbonados, varios aldehídos aromáticos y ésteres (Jayaprakasha et al., 2006; Santos et al., 2008).
2.8.2. Aceite esencial de clavo.
El clavo (Syzygium aromaticum) es un árbol tropical, originario de las islas Molucca, las islas Zanzíbar y en las islas vecinas de Bemba, pertenece a la familia Myrtaceae, se cultiva en muchas ciudades de clima tropical, es una especie herbolaria muy conocida, por su amplio uso como condimento, principalmente en el arte culinario o bien para elaborar productos como cremas, jabones, perfumes así como en el área médica (Santos et al., 2008; García-González y Vázquez-Sánchez, 2006).
El clavo comprende de un 14-21% de aceite esencial, el cual es más denso que el agua y fácilmente se oscurece al contacto con el aire, además tiene un olor fuerte, aromático y picante. El aceite esencial de clavo comprende principalmente fenoles (78-98%), como el eugenol y el acetileugenol, también contiene sesquiterpernos, algunos ésteres, cetonas y alcoholes (Kubeczka y Formacek, 2002; García-González y Vázquez-Sánchez, 2006).
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2.8.3. Aceite esencial de tomillo.
El tomillo es de la familia Lamiaceae, es un arbusto herbáceo perenne, es una planta nativa de la región del mediterráneo pero es cultivada en distintas regiones como España, Grecia, Italia, algunas ciudades del centro de Europa, Turquía, Israel, Norte América solo por mencionar algunas; en Irak es usado como expectorante, antibroncolítico, antiespasmódico, antihelmíntico, carminativo y como antidiurético (Al- Bayati, 2008).
El tomillo es una especie comúnmente usada de diversas maneras, una de ellas es como aceite esencial el cual es ampliamente utilizado como saborizantes de alimentos, preparación farmacéutica, enjuagues, desinfectantes además algunas veces como perfumes (Ortuño, 2006).
El aceite esencial contiene como componentes principales al timol y carvacrol; en menor cantidad es el p-cimeno, limoneno, carvacrol, linalol carbolifeno, etc. (Murray, 2000; Tripathi et al., 2004).
2.9. Quitosano
La quitina (del griego tunic, envoltura) se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza y después de la celulosa es el segundo polisacárido de mayor abundancia, sus fuentes principales son el exoesqueleto de muchos crustáceos, alas de insectos, paredes celulares de hongos, algas etc., de la quitina se deriva el quitosano que a su vez se puede encontrar de forma natural en paredes celulares de algunas plantas y hongos. Sin embargo, su fuente más importante a nivel industrial lo constituye la quitina, mediante el proceso de desacetilación química o enzimática se ha producido a gran escala. El
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quitosano, polímero constituido fundamentalmente por unidades de glucosamina (2-amino-2-desoxi-D-glucosa) con uniones β (1-4), presenta propiedades policatiónicas que le confieren características únicas de funcionalidad, además de ser biodegradable y no tóxico, aspectos que le dan un gran potencial de aplicación en diferentes áreas; en la agricultura, en la medicina, tratamientos de aguas, cosméticos, biosensores, etc. (Bautista-Baños et al., 2006; Lárez, 2006).
El quitosano se ha empleado como película comestible siendo una alternativa de conservación en cultivos agrícolas durante la fase postcosecha (Hernández-Muñoz et al., 2006).
2.10. Efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales.
El quitosano y los aceites esenciales nos interesan principalmente por una de sus características; su efecto fungicida. Se sabe que estos productos presentan actividad contra diferentes microorganismos. A continuación se describen algunas investigaciones realizadas con los productos de interés para este trabajo, con la finalidad de conocer cómo se comportan el quitosano y los aceites esenciales (AE).
Recientemente, Hernández-Lauzardo et al. (2008) estudiaron el efecto del quitosano con diferentes pesos moleculares sobre el desarrollo in vitro de R. stolonifer; los autores reportaron que el quitosano de bajo peso molecular fue más efectivo para inhibir el crecimiento micelial, mientras que el quitosano de alto peso molecular afectó la producción y germinación de las esporas. Por otra parte, se analizó el efecto del quitosano en el control de la pudrición blanda producida por R. stolonifer en jitomates almacenados
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a 14° C durante 48, 72 y 96 h, observándose que la presencia de este polímero retrasó el desarrollo de la pudrición (Bautista-Baños y Bravo-Luna, 2004). Asimismo, el recubrimiento con quitosano en fresas y cerezas durante su almacenamiento, mostró no sólo reducción en la enfermedad, sino que incrementó la actividad de algunas enzimas relacionadas con la inducción de resistencia vegetal (quitinasas y 1-3 glucanasas) (Zhang y Quantick, 1998).
De todos los AE que se han estudiado, destacan los aceites de clavo (Syzygium aromaticum), canela (Cinnamomum zeylanicum) y tomillo (Thymus vulgaris); entre otros como los de epazote, menta, ajo, lima y eucalipto, observándose que los últimos tres aceites mencionados inhibieron el crecimiento micelial y la esporulación de los conidios de C. gloeosporioides, a concentraciones de 200, 250 y 300 µg mL-1. De la misma manera, se observó un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de Fusarium oxisporum f. sp. gladioli (Massey) Snyder and Hansen, con los mismo AE a las mismas concentraciones (Barrera-Necha et al., 2008; Barrera-(Barrera-Necha et al., 2009). García-Camarillo et al. (2006), evaluaron el efecto del AE de canela sobre A. flavus utilizando una dosis mínima de 100 ppm y una máxima de 500 ppm. Dimitra-Daferera et al. (2003), observaron que el aceite de tomillo presentó uno de los mejores efectos inhibitorios sobre Fusarium spp. y B. cinerea, así como en el control de la pudrición por moho gris en fresas (Chu et al., 1999) y en el control de la pudrición café causado por M. fructicola (Chu et al., 2001).
Rasooli y Razzaghi (2004), reportaron a nivel in vitro la actividad fungicida e inhibitoria de la producción de aflatoxinas en A. parasiticus Speare con el AE de tomillo; Plotto et al.
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(2003), determinaron el efecto de varios AE, incluyendo tomillo y canela para el control de enfermedades en tomate y observaron que el AE de canela fue uno de los mejores para el control de B. cinerea. Tsao y Zhou (2000), reportaron que el timol (constituyente del AE de tomillo) presenta actividad fungistática sobre B. cinerea y M. fructicola.
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3. JUSTIFICACIÓN
Los productos hortofrutícolas son afectados por pudriciones postcosecha que tradicionalmente se han controlado mediante el empleo de fungicidas sintéticos con los beneficios y riesgos que implica el uso de los mismos. Actualmente, se buscan alternativas naturales que no afecten a la salud del humano y al medio ambiente. Hasta el momento los AE y el quitosano se han utilizado de manera individual y se ha visto que presentan resultados favorables en contra de hongos postcosecha, sin embargo, se busca amplificar el efecto para tener el control de estos hongos, evitando grandes pérdidas postcosecha. De manera que el quitosano y los aceites esenciales utilizados de forma individual o combinada representan alternativas interesantes para inhibir in vitro e in situ el desarrollo de R. stolonifer. Además de que no existen reportes previos del uso de esta combinación (quitosano-aceites esenciales) para inhibir el desarrollo de R. stolonifer in vitro o en frutos de jitomate.
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4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Determinar in vitro e in situ el efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo, de manera individual y combinada sobre Rhizopus stolonifer.
4.2. Objetivos particulares
Evaluar in vitro el efecto del quitosano y de los aceites esenciales de tomillo, clavo y canela sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de R. stolonifer
Evaluar in vitro el efecto antifúngico de las combinaciones de quitosano-aceites esenciales de clavo, canela y tomillo sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de R. stolonifer.
Evaluar el efecto antifúngico del quitosano y aceites esenciales de manera individual y combinada contra R. stolonifer en frutos de jitomate.
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5. MATERIALES Y MÉTODOS
Figura 2. Esquema general del trabajo experimental. El cual se divido; in vitro, en donde se evaluaron al
quitosano y a los AE utilizados individualmente y combinados; e in situ donde se evaluaron los mejores tratamientos obtenidos in vitro
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5.1. Material biológico
Se empleó la cepa de R. stolonifer R3 aislada de frutos de jitomate (Lycopersicon esculentum) del tipo “Saladette” provenientes de Yautepec, Morelos (Hernández-Lauzardo et al., 2006).
Los aceites esenciales para las evaluaciones con R. stolonifer, se obtuvieron de forma comercial en la compañía de aceites y esencias S.A. de C.V., México, D.F.; se utilizaron tres aceites esenciales que son tomillo, canela, y clavo.
Se utilizaron frutos de jitomate del tipo “Saladette”, los cuales fueron seleccionados con las siguientes características; tamaño uniforme, estado rojo maduro, sin lesiones y ausencia de enfermedad, los frutos fueron cultivados y cosechados en Tlayacapan, Morelos en una huerta familiar.
5.2. Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in vitro
5.2.1. Elaboración de los medios de cultivo.
Los medios de cultivo, Papa Dextrosa Agar (PDA) y Caldo de Papa Dextrosa (PDB) se elaboraron de acuerdo a las condiciones indicadas por el fabricante (Bioxon). Se utilizó quitosano de bajo peso molecular para los medios de PDA adicionados con quitosano los cuales se prepararon a dos concentraciones 2 y 10 mg mL-1. Para ello se elaboró una solución stock de quitosano a una concentración de 20 mg mL-1; se pesaron 2 g de quitosano y se disolvieron en 2 mL de ácido acético glacial, con 50 mL de agua destilada, se agitó durante 24 h posteriormente se ajustó el pH a 5.6 con NaOH 0.1 N
(Hernández-34
Martínez, 2005), finalmente la solución se aforó a 100 mL con agua destilada. Para obtener las concentraciones de 2 y 10 mg mL-1, se diluyó el quitosano con el medio de cultivo, no sin antes haberlos esterilizado por separado a 15 lb pul2 durante 15 min, finalmente en condiciones controladas de esterilidad se mezclaron y se vaciaron en cajas Petri de 100X 15 mm.
Por separado se pesaron los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo para obtener las concentraciones de 100, 200 y 300 µg mL-1 a evaluar y se disolvieron en 1 mL de agua destilada con tween 20 (Aldrich) en una relación 1:6 (1 parte de tween en 5 partes de aceite); posteriormente, por separado se llevaron a un volumen final de 150 mL de medio de cultivo (PDA) y se esterilizaron a 15 lb pul2 de presión durante 15 min, finalmente se vaciaron en cajas Petri de 100 X 15 mm.
Para los medios combinados, se colocó el quitosano en un matraz de 50 mL y se esterilizó a 15 lb pul2 durante 15 min. Por otro lado los aceites esenciales se pesaron y se diluyeron con tween en 1 mL de agua destilada, posteriormente se agregaron por separado al PDA y se esterilizaron (Kumar et al., 2008). Finalmente se mezcló el quitosano con el PDA adicionado con los aceites esenciales, todo en condiciones de esterilidad y contínua agitación, el medio combinado se vació en cajas Petri de 100 X 15 mm y se dejaron solidificar. Una vez solidificados los medios con los tratamientos se sometieron a prueba de esterilidad, la cual consistió en dejarlos en incubación a 25° C durante 24 h.
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5.2.2. Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales.
Las concentraciones de AE de canela, clavo y tomillo utilizadas en los ensayos, se determinaron a partir de tres diferentes concentraciones evaluadas, que fueron 100 µg mL-1, 200 µg mL-1y 300 µg mL-1, las cuales presentan antecedentes de efecto antifúngico, que ya han sido descritos anteriormente en este trabajo.
Los AE se incorporaron al medio de cultivo PDA como se describió en el punto 6.2.1., después de la prueba de esterilidad se colocó un inoculo de R. stolonifer de 6 mm de diámetro, en la parte central de la caja Petri, durante la incubación se determinó el crecimiento micelial con ayuda de un Vernier cada 8 h durante 48 h de incubación. Finalmente se eligieron solo dos concentraciones; 100 µg mL-1 y 300 µg mL-1, que fueron utilizadas en los ensayos posteriores.
5.2.3. Crecimiento micelial
A partir de un cultivo de R. stolonifer con 72 horas de incubación se obtuvieron discos de 6 mm de diámetro con un horadador, los discos se colocaron en el centro de las cajas Petri con los diferentes tratamientos (referidos en el punto 5.2.1.). Las cajas Petri con PDA fueron utilizadas como control positivo y las cajas con PDA más dicloran a 1 mg mL-1 representaron al control negativo. Aquí cabe mencionar que se preparó una solución Stock de dicloran a 10 mg mL-l de acuerdo a las condiciones del fabricante (Gowan) posteriormente se diluyó con agua destilada hasta obtener una concentración de 1 mg ml -1. Las cajas con PDA más tween, se utilizaron como control para descartar que el tween
