RNA de interferencia en vertebrados no mamíferos

Desde el descubrimiento del RNAi en invertebrados, se ha empezado a explorar su potencial para el estudio de genes en vertebrados no mamíferos. En la actualidad y contrario a lo que sucede con células de mamíferos, el RNAi en organismos como Xenopus laevis, Danio rerio y otras especies de peces no ha tenido gran impacto, debido en parte a resultados contradictorios en cuanto a la eficacia de algunas de las moléculas mediadoras de la respuesta del RNAi. Sin embargo en otros organismo como Gallus gallus y Trachemys scripta, ha mostrado ser una técnica eficiente.

4.1.7.1. Xenopus laevis

X. laevis es uno de los organismos que han sido considerados como modelo de estudio sobre todo para investigaciones en biología celular y del desarrollo. Sin embargo, una de las principales desventajas de utilizarlo como modelo de estudio es la falta de análisis genéticos y que prácticamente ha sido imposible generar knock-outs, debido principalmente a su alotetraploidia (cuatro copias de cada gen). Debido a esto, las

posibilidades de silenciar genes en este organismo se basan principalmente en técnicas de RNA antisentido y RNAi. Los primeros intentos de silenciamiento génico vía RNAi, se llevaron a cabo utilizando dsRNA. Estos primeros ensayos no fueron exitosos debido a la respuesta no específica generada por el dsRNA que generó grandes defectos en los embriones (revisado Zhou et al., 2002). Más tarde, después del descubrimiento de los siRNAs, Zhou y colaboradores (2002) publicaron un trabajo en donde logran el silenciamiento de las proteína ciclina B1 y B2 en blastómeros y en embriones en el estadio de dos células utilizando microinyecciones de siRNAs de 21 nucleótidos, abriendo el campo del silenciamiento génico en X. laevis.

4.1.7.2. Danio rerio y otros peces

Los primeros estudios que utilizaron RNAi en peces fueron realizados por Wargelius y colaboradores en 1999 con el pez cebra usando dsRNA para bloquear la transcripción de genes involucrados en el desarrollo. Los autores inyectaron el dsRNA durante los estadios de una a dos células para bloquear los genes no tail (ntl), floating head (flh) y Pax2.1 obteniendo una reducción de mRNA endógeno pero sólo 20-30% de los embriones mostró los fenotipos esperados; más adelante en un experimento posterior llevado a cabo por Li y colaboradores en el año 2000, se obtuvieron mejores resultados con una reducción significativa de mRNA endógeno en embriones de una sola célula a los cuales se les inyectó dsRNA para bloquear los genes ZF-T y Pax6.1. Sin embargo, otros estudios llevados a cabo por Oates et al. (2000) y Zhao et al. (2001) han demostrado que la inyección de dsRNA desencadena una interferencia no específica y toxicidad en los embriones atribuible probablemente a la respuesta de interferón. Aun a pesar de estos resultados, varios años más tarde Acosta y colaboradores (2005) lograron bloquear el gen de la miostatina por medio de microinyecciones de dsRNA a embriones en estadio de una a dos células produciendo hiperplasia e hipertrofia en células musculares del pez cebra, lo que se tradujo en un aumento de la masa muscular de los peces tratados.

A partir de que los siRNAs demostraron ser altamente específicos en el silenciamiento génico en mamíferos, diversos investigadores comenzaron a aplicar esta estrategia en peces y los resultados que se han obtenido han sido más consistentes. Boonanuntanasarn

y colaboradores (2003) demostraron la efectividad de los siRNAs en trucha arcoíris. Ellos co-inyectaron un plásmido de expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) y siRNAs contra esta proteína, logrando disminuir la fluorescencia en ~60% de los embriones inyectados. De igual forma los siRNAs probados también lograron silenciar la expresión de la GFP en truchas transgénicas que expresan de manera estable esta proteína, reduciendo la fluorescencia en un ~50% de los embriones tratados. Adicionalmente, los autores bloquearon la expresión del gen de la tirosinasa A (TyrA) la cual está involucrada en la síntesis de melanina, logrando una reducción en la pigmentación de ~40% de los embriones tratados y una reducción en el mRNA endógeno. Sin embargo, estos autores también reportaron efectos no específicos cuando los embriones fueron tratados con altas dosis de siRNA. En años siguientes Liu y et al. (2005) reportaron una respuesta específica inyectando siRNAs dirigidos al gen ntl a cigotos de pez cebra, en los que se reflejaba el fenotipo esperado en un 59% de los organismos, demostrando que por esta vía se podían reducir los niveles del mRNA del gen ntl en los peces tratados. Siguiendo esta misma estrategia de bloqueo, se han logrado interferir los genes de distrofina (dmd) y cdk5 también del pez cebra en ensayos in vivo (Dodd et al., 2004; Kanungo et al., 2007); de igual forma, en la trucha arcoíris se probaron inyecciones intraperitoneales de siRNAs desnudos o con liposomas policatiónicos como agente de transfección, para inhibir la expresión de una glicoproteína del virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV), mostrando que los siRNAs con los liposomas fueron mejor introducidos a las células logrando disminuir la mortalidad de los peces infectados aunque ellos también reportaron que los liposomas podían desencadenar una respuesta inmune (Schyth et al., 2007).

Siguiendo otra estrategia de RNAi, Sung y colaboradores (2009) lograron determinar el papel de la proteína Jak2a en la hematopoyesis y en la formación de vasos sanguíneos durante el desarrollo embrionario al inyectar los shRNAs en cigotos, de manera similar también se ha logrado silenciar el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) al inyectar un plásmido de expresión de un shRNA específico a este gen en embriones en estadios tempranos, obteniendo el fenotipo esperado (Yang et al., 2009). Finalmente Dong y colaboradores (2009) mostraron que varios shRNAs podían ser expresados con un solo vector pudiendo bloquear más de un gen a la vez, adicionalmente diseñaron un

vector dirigido por un promotor específico de un linaje celular lo que representa una herramienta muy valiosa ya que demostraron la posibilidad llevar a cabo el silenciamiento génico de manera tejido-específico en el pez cebra.

Por otro lado Gruber y colaboradores (2005) propusieron que el bloqueo con siRNAs podía ser más efectivo en cultivo celular por microinyección ya que ellos lograron silenciar en casi el 100% de las células los genes laminina A, laminina B2 y el gen de la proteína motora Eg5 del pez cebra. De la misma manera, Xie y colaboradores (2005) lograron bloquear la principal proteína de la cápside del iridovirus de la rana tigre por medio de siRNAs transcritos in vitro en células musculares de la carpa Pimephales promelas. En un trabajo más reciente, Zenke y Kim (2008) caracterizaron el promotor U6 de Takifugu rubripes y lo utilizaron para diseñar un plásmido de expresión de un shRNA anti GFP. Ellos demostraron que el promotor U6 del fugu expresaba los shRNAs de manera más eficiente que el promotor U6 de ratón, logrando silenciar un gen exógeno de la GFP en varias líneas celulares de diferentes especies de peces como el “bluegill” (Lepomis macrochirus), el “grunt fin” y el “Chinook salmon” (Oncorhynchus tshawytscha).

Aun a pesar de estos resultados exitosos logrando knock-downs de genes importantes en varias especies de peces, existen algunos estudios recientes que muestran resultados contradictorios. Un ejemplo es la construcción de un plásmido de expresión de siRNAs contra algunos genes bien caracterizados en el pez cebra dirigidos por el promotor de mamíferos U6. Estos plásmidos fueron introducidos en embriones del pez cebra a través de microinyecciones, obteniendo un silenciamiento parcial de la expresión de los genes endógenos, en donde se observó que la eficiencia del silenciamiento variaba dependiendo de la secuencia blanco. Sin embargo, la introducción del promotor U6 probablemente indujo también algunos efectos no específicos (Wang et al., 2010). Esta respuesta no específica se puede explicar con el trabajo de Zhao y colaboradores (2008). En su trabajo, los autores reportan que tras la inyección de siRNAs a embriones de pez cebra de una a dos células se produce una reducción significativa del miR-430, que es el miRNA más abundante en los primeros estadios de desarrollo de este pez, el cual es esencial para la remoción del mRNA materno durante la transición del huevo de materno a zigoto. Este papel tan importante del miR-430 apoyó sus resultados y posteriormente

demostraron que la co-inyección de los siRNAs con miRNAs pre-procesados eficientemente restablecía el desarrollo de los embriones; por lo que sugirieron que los siRNAs inyectados, compiten con los miRNAs naturales por los componentes de la maquinaria de RNAi necesarios para el correcto procesamiento y funcionamiento de los miRNAs (Zhao et al., 2008).

4.1.7.3. Gallus gallus

Por mucho tiempo, el embrión de pollo (Gallus gallus) fue el clásico modelo de estudio en trabajos de desarrollo embrionario en vertebrados, debido quizá a su fácil acceso durante el desarrollo. Estudios in ovo así como técnicas de cultivo ex ovo han sido desarrolladas y ofrecen la posibilidad de una manipulación in vivo a lo largo del desarrollo. En los últimos años, se han desarrollado diversas metodologías para el silenciamiento génico por RNAi, sin embargo, los resultados existentes son contradictorios. Por un lado Bueno y su grupo de trabajo (2005) realizaron una serie de experimentos con las diferentes moléculas que desencadenan el RNAi: dsRNA, siRNA o shRNA producido por un vector de expresión. Enfocándose en el bloqueo de la proteína fgf8, ellos muestran que no se produce ningún defecto morfológico y que la expresión de fgf8 no es silenciada ni por microinyección de los dsRNA ni por electroporación de los siRNA y los vectores de expresión del shRNA. Con base a estos resultados, sugieren que con las herramientas y las técnicas disponibles, el número de células en la que la expresión de fgf8 disminuyó, si acaso hubo algunas, no son suficientes para generar un fenotipo mutante. Por todo esto, ellos concluyen que el RNAi in ovo no es útil como un método rutinario para análisis de genética funcional en embriones de pollo (Hernández & Bueno, 2005).

Por el contrario Stoekli y su grupo, en dos trabajos diferentes, reportan que sin importar el tipo de molécula utilizada (dsRNA, siRNA o shRNA) el silenciamiento génico vía electroporación ha sido muy eficiente, ya que para los tres genes silenciados (axonin-1, NrCAM y NgCAM) encuentran un fenotipo mutante correspondiente a la función del gen, que además, coincide con el fenotipo reportado en un trabajo anterior donde bloquean la función de estos mismos genes pero a nivel proteína. Ellos recalcan la importancia de que el silenciamiento ocurra justo antes del comienzo de la expresión del

gen de interés, ya que el RNAi, no tiene la capacidad de remover proteínas ya existentes. En sus trabajos, describen además las ventajas y desventajas del RNAi in ovo y ex ovo, siendo la mayor ventaja el gran control de la expresión génica que se tiene tanto espacial como temporalmente, mientras que su principal desventaja es que ambas metodologías requieren de una gran destreza manual para manipular embriones vivos. Por lo tanto, ellos concluyen que el RNAi in ovo representa una herramienta útil para la genómica funcional (Pekarik et al., 2003; Beriswyl & Stoeckli, 2006). Es importante remarcar las diferencias entre estos dos estudios, mientras que en el trabajo de Hernández y Bueno (2005) únicamente trabajan con un gen, Beriswyl y Stoeckli (2006) lo hacen con tres. Hay que recordar que la eficiencia del RNAi depende en gran parte del tipo de proteína que se pretende bloquear, donde las proteínas más abundantes y estables son las más difíciles de silenciar. Fgf8 es una proteína miembro de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos que poseen actividad mitogénica y que están involucradas en una gran variedad de procesos biológicos. Mientras que axonin-1, NrCAM y NgCAM son proteínas más especializadas involucradas en la adhesión neuronal. Esta gran diferencia en cuanto al tipo de proteína o gen blanco pudiera quizá explicar los resultados tan contrastantes entre estos dos trabajos. Finalmente en otra variación de la tecnología de RNAi, Smith y colaboradores (2009) usaron el vector retroviral de aves RCASP(B) para introducir miRNAs o shRNAs para bloquear el gen Dmrt1(un determinante testicular en aves) co-expresando la proteína reportera GFP. Los embriones infectados con el virus en el día 0 mostraron expresión global de GFP y por lo tanto de los siRNAs o shRNAs. Y para el día 10, encontraron una alta expresión de GFP en el tracto urogenital. Las gónadas que mostraron una elevada expresión de GFP también mostraron una disminución significativa del transcrito de Dmrt1 (60%) lo que produjo una feminización de las gónadas en machos. Esta respuesta al bloqueo de Dmrt1 en las gónadas de macho, indica que este gen es necesario para la determinación testicular en el pollo. Además, los autores mostraron tanto la efectividad de los shRNAs y siRNAs así como los efectos estables que pueden ser inducidos por medio de vectores virales. 4.1.7.4. Trachemys scripta

La tortuga de agua dulce T. scripta, en los últimos años se ha convertido en un buen modelo para estudiar fenómenos tales como la determinación sexual por temperatura y

la anoxia. Haciendo referencia a este último, Nayak y colaboradores (2009) reportaron la represión de la neuroglobina (Ngb) en cultivos primarios de neuronas. Ellos utilizaron siRNA de 25 nucleótidos específicos a Ngb de T. scripta, los cuales fueron transfectados usando Lipofectamina, logrando una disminución del 70% de la síntesis de la proteína. Además, este mismo grupo de investigación, ha logrado el knock-down de la proteína Hsp72 también en cultivos primarios de neuronas con un protocolo similar al anterior, es decir, utilizando siRNAs específicos a Hsp72 de T. scripta, obteniendo un 60% de disminución en los niveles de la proteína (trabajo en proceso). Estos dos trabajos, representan el primer reporte de silenciamiento génico vía RNAi en un reptil, abriendo la posibilidad de utilizar esta técnica para estudiar otros procesos biológicos como la determinación sexual por temperatura.

T. scripta es un organismo cuya determinación sexual es dependiente de la temperatura, en donde se ha establecido que la TPH es de 31 °C y la TPM es de 26 °C, además, se sabe que el sexo se determina en el segundo tercio de la incubación correspondiente al PST, el cual abarca de los estadios 15 al 19 a TPH y del 15 al 20 a TPM (Wibbels et al., 1991).

T. scripta es un modelo que ha sido muy utilizado para estudios de expresión diferencial de genes involucrados en la determinación sexual por temperatura. Entre los genes que se han identificado que se expresan de manera diferencial se encuentran Wnt4, FoxL2 y Rspo1, cuyos niveles de expresión son mayores a TPH, favoreciendo a la ruta ovárica (Shoemaker et al., 2007a; Smith et al., 2008); mientras que Amh, Dmrt1 y Sox9 presentan niveles de expresión mayores a TPM, siendo candidatos para genes de determinación testicular y como se había mencionado anteriormente, al ser Sox9 el gen blanco de Sry, es el principal candidato para cumplir esta función.

En mamíferos Sox9 ha sido muy estudiado en donde existe información disponible desde patrones de expresión hasta análisis funcionales y se sabe que ratones nulos a Sox9 presentan reversión sexual (Sim et al., 2008). Tomando en cuenta que los patrones de expresión de Sox9 en T. scripta y L. olivacea son similares a los encontrados en ratón, es posible esperar que una pérdida de función de Sox9 en estos últimos lleve también a una

reversión sexual, en donde organismos incubados a TPM presenten características de hembra.

En estudios previos se ha demostrado que la expresión de Sox9 responde a cambios en la temperatura en ensayos in vitro tanto en T. scripta (Shoemaker et al., 2007a) como en L. olivacea (Moreno-Mendoza et al., 2001), donde se ha visto el decremento o incremento en la expresión de Sox9 como respuesta a cambios de temperatura de incubación de TPM a TPH y de TPH a TPM, respectivamente. Esto indica que los mecanismos moleculares que regulan la expresión de Sox9 permanecen activos aun en condiciones de cultivo. De esta manera en el presente trabajo se estableció un protocolo para el silenciamiento post-transcripcional del gen Sox9 en un sistema de cultivo gonadal de T. scripta y L. olivacea, con el fin de bloquear la expresión de Sox9 y poder analizar la respuesta tanto a nivel molecular como morfológico.

4.2. Metodología

4.2.1. Material biológico

Un nido (100 huevos) de Trachemys scripta fueron adquiridos de la granja tortuguera Clark (Hammond, LA) en mayo del 2010 y fueron trasladados al laboratorio de la Dra. Sarah Milton en Florida Atlantic University, Boca Raton, Florida. Los huevos fueron incubados a TPM (26°C) y a TPH (31°C), previamente reportadas para T. scripta. Sesenta huevos de tortuga golfina L. olivacea se obtuvieron de la playa “La Escobilla”, Oaxaca en abril del 2011 con el permiso SGPA/DGVS/09109/11 otorgado por la Subsecretaría de Gestión para la Protección Ambiental, Dirección General para Vida Silvestre, SEMARNAT. Los huevos fueron separados en dos grupos e incubados a temperatura promotora de macho (TPM, 26 °C) y de hembra (TPH, 33 °C) en el laboratorio del Dr. Horacio Merchant Larios, del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM. Los huevos incubados a TPH fueron utilizados como control negativo de Sox9.