Sitios de expresión de Sox9

Para analizar los sitios de expresión del gen Sox9, se utilizaron gonadas y mesonefros de L. olivacea incubados a TPH y TPM. Estos fueron analizados durante el PST y el PDS por medio de hibridación in situ con las sondas “sense” o “antisense” generadas para este gen.

3.3.3.1. Hibridación in situ Sox9

Consistente a lo que se obtuvo en el PCR cuantitativo, la hibridación in situ con la sonda “antisense” de Sox9 en gónadas incubadas a TPH durante el periodo sensible a la temperatura (E24), muestra una expresión baja, localizada en células de la región medular que se encuentran formando los cordones medulares de la gónada indiferenciada (Fig. 37A y C).

Sin embargo, durante el periodo de diferenciación sexual (E27), cuando los cordones medulares se han fragmentado, se observa que los niveles de expresión de este gen disminuyen a niveles casi imperceptibles, localizándose principalmente en el tejido estromático (Fig. 37B y D), sin embargo, la expresión no desaparece por completo como lo reportan Moreno-Mendoza y colaboradores (1999).

Esta disminución notoria en la expresión de Sox9, podría significar que este gen no contribuye a la fragmentación de los cordones medulares ni a la proliferación de las células del córtex, es decir, quizá su represión sea necesaria para la activación de otros genes que son los responsables de la diferenciación ovárica. Los resultados anteriormente descritos, quizá, nos podrían dar la falsa impresión de que la represión de Sox9 a TPH se presenta hasta el E27, durante el periodo de diferenciación sexual. Sin embargo, en un trabajo previo realizado en L. olivacea, en el que se hicieron ensayos de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-Sox9 de humano (Moreno-Mendoza et al., 1999), se encontró que la proteína Sox9 comienza a disminuir en gónadas incubadas a TPH durante el E25, esto es, al final del periodo sensible a la temperatura. Es por esto que en el presente trabajo sólo se pudo observar los efectos de la represión o regulación negativa de Sox9, al analizar únicamente los estadios 24, al inicio del periodo sensible a la temperatura y 27, al inicio del periodo de diferenciación sexual. En la figura 37E y F, se muestra la hibridación in situ con la sonda “sense” de Sox9 en gónadas

incubadas a TPH durante los estadios 24 y 27 (E y F, respectivamente) mostrando en ambas una señal negativa.

Por otro lado, en gónadas incubadas a TPM durante el periodo sensible a la temperatura (E23), Sox9 se expresa a bajos niveles en las células que forman el tejido estromático localizándose aparentemente en los nucleolos de las células pre-Sertoli (Fig. 38A y C). Una vez que la gónada comienza su diferenciación en testículo (E27), la expresión de Sox9 muestra un notable incremento y se observa en las células del epitelio superficial y también en el interior de la gónada, tanto en núcleo como citoplasma de células presuntamente pre-Sertoli, que se encuentran formando los cordones medulares, contribuyendo quizá a su diferenciación (Fig. 38B y D). En la figura 38E y F, se muestra la hibridación in situ con la sonda “sense” de Sox9 en gónadas incubadas a TPM durante los estadios 23 y 27 (E y F, respectivamente), mostrando en todos una señal negativa. Además del dimorfismo en los niveles de expresión que presentó Sox9 durante el E27 entre ambas temperaturas de incubación, también es importante resaltar el aparente dimorfismo espacial que mostró la expresión de este gen, en donde a TPM, durante el E23, la expresión se localizó en tejido estromático y en los nucleolos de las células pre- Sertoli, mientras que para el E27 la expresión se observó tanto en núcleo como citoplasma de células pre-Sertoli. Por el contrario, a TPH durante el E24 la expresión se observó en las células medulares mientras que durante el E27, la expresión se localizó principalmente en tejido estromático. Aparentemente cuando Sox9 se expresa en células medulares podría estar ejerciendo una función específica, por ejemplo, es probable que durante el E24 a TPH, cuando Sox9 se está expresando en células presuntamente pre- granulosas, éste podría estar reprimiendo a los genes involucrados en la diferenciación ovárica, por lo que para el E27, es necesaria la represión de Sox9 en éstas células y de esta manera promover la fragmentación de cordones medulares y con esto iniciar la diferenciación del ovario, por lo que la expresión de Sox9 aparte de disminuir se localiza en tejido estromático. Sería interesante investigar si el aparente cambio en el sitio de expresión de Sox9 de células medulares a tejido estromático coincide con la regulación negativa de este gen durante el E25 reportado por Moreno-Mendoza y colaboradores (1999) y Torres-Maldonado y colaboradores (2001 y 2002). Por otro lado a TPM, Sox9 se expresa a bajos niveles principalmente en tejido estromático en la gónada

indiferenciada, sin embargo al iniciar el periodo de diferenciación sexual E27, Sox9 no sólo incrementa notoriamente sus niveles de expresión sino que también aparentemente cambia su sitio de expresión hacia las células medulares en donde probablemente esté promoviendo su diferenciación a células de Sertoli y el inicio del desarrollo testicular. Este papel de Sox9 en la diferenciación testicular ha sido ampliamente documentado encontrándose incluso en organismos que presentan distintos mecanismos de determinación sexual por ejemplo en ratón y gallo (Kent et al., 1996), lagarto (Western et al., 1999) y tortugas de agua dulce (Shoemaker et al., 2007a y b).

El dimorfismo espacial en la expresión de Sox9, se ha reportado también en T. scripta (Shoemaker et al, 2007b), sin embargo esta distribución espacial no se da en relación al tejido que lo expresa sino en relación a la distribución de las células que lo están expresando. En ese trabajo, además de encontrar niveles de expresión diferentes al final del periodo sensible a la temperatura a TPM con respecto a la TPH, los autores encuentran que a TPM a mitad del periodo sensible a la temperatura, Sox9 se expresa en agregados celulares, mientras que a TPH, la expresión es difusa y no presenta ningún arreglo específico. El patrón de expresión espacial encontrado en el presente trabajo no coincide con el anteriormente reportados para T. scripta esto debido quizá, a que el estadio analizado (E23), perteneciente al periodo sensible a la temperatura a TPM, corresponde al inicio de este periodo. Por otro lado, resultados similares se han reportado en ratón, en donde se ha visto que la proteína Sox9 presenta una localización subcelular sexo-específica. Es decir, en machos, durante la diferenciación testicular y al momento de la expresión de Amh, Sox9 se localiza en el núcleo de las células de Sertoli, mientras que en hembras, Sox9 permanece en el citoplasma donde esta proteína no puede ejercer su función como factor de transcripción (De Santa Barbara et al., 2000). Sin embargo es necesario mencionar que Moreno-Mendoza y colaboradores (1999) no reporta ningún arreglo espacial como en el presente trabajo o como en T. scripta (Shoemaker et al, 2007b); ni tampoco una localización subcelular entre temperaturas o estadios como en ratón (De Santa Barbara et al., 2000). A pesar de que los patrones de expresión espacial no coincidan entre estas especies, es evidente que la regulación de Sox9 no depende únicamente de la dosis, es decir, de los niveles de expresión, sino que también esta regulación se presenta espacialmente, cambiando no sólo el tejido que lo

expresa sino también la distribución de las células que lo están expresando o su localización subcelular.

La hibridación in situ con la sonda “antisense” de Sox9 en mesonefros se muestra en las figuras 39 (TPH) y 40 (TPM). De acuerdo a lo encontrado en el PCR cuantitativo a TPH, Sox9 presenta altos niveles de expresión durante el periodo sensible a la temperatura (Fig. 39A) mostrando un notable decremento en los niveles de expresión durante el E27 perteneciente al periodo de diferenciación sexual (Fig. 39B). A TPM, se pudo observar un patrón de expresión similar, en donde los niveles de expresión de Sox9 son altos durante el periodo sensible a la temperatura (Fig. 40A) mostrando un decremento durante el periodo de diferenciación sexual (Fig. 40B).

Al igual que en la gónada, la hibridación con la sonda “sense” de Sox9, mostró en ambas temperaturas una señal negativa tanto a TPH (Fig. 39C-D, E24 y E27 respectivamente) como a TPM (Fig. 40C-D, E23 y E27 respectivamente).

Los resultados de la expresión de Sox9 en mesonefros no coinciden con los reportados previamente por Moreno-Mendoza y colaboradores (1999), ya que ellos encuentran que durante el PST en ambas temperaturas, sólo algunas células dispersas del mesonefros resultan positivas para la proteína Sox9, sin embargo, esta señal positiva incrementa progresivamente hasta el E26, donde las células positivas a Sox9 son abundantes. Esta discrepancia en los resultados, podría deberse quizá, a la alta variabilidad entre individuos que mostró la expresión cuantitativa de Sox9 en mesonefros durante el periodo sensible a la temperatura en las dos temperaturas (Fig. 34B). Es probable también que esta diferencia se deba al desfase que existe entre la transcripción de un gen y la traducción de la proteína, ya que Moreno-Mendoza y colaboradores (1999), por medio de inmunofluorescencia detectan la proteína de Sox9, mientras que en el presente trabajo se detectó mRNA, esto en el periodo sensible a la temperatura; mientras que en el periodo de diferenciación sexual, es probable que nosotros ya no estemos detectando mRNA debido a los altos niveles de proteína que reportan Moreno-Mendoza y colaboradores (1999), es decir, es probable que la transcripción se detenga si los niveles de proteína alcanzados son suficientes para llevar a cabo la función biológica.

Adicionalmente, encontramos un patrón de expresión diferencial de Sox9 en los ductos genitales de embriones de L. olivacea durante el periodo de diferenciación sexual (E27), en donde a TPH, los niveles de expresión son bajos, localizándose únicamente en el brazo y en el epitelio del lumen del ducto Mülleriano (Fig. 41A), mientras que a TPM, la expresión de Sox9 es alta tanto en el ducto de Wollffian como en el ducto Mülleriano (Fig. 41B). El patrón de expresión diferencial entre macho y hembra es muy evidente, por lo que es muy probable que Sox9 este desempeñando algún papel importante en los ductos genitales de macho pero no en los de hembra. Probablemente Sox9 esté participando en el mantenimiento del ducto de Wolffian y quizá en su diferenciación, mientras que en el ducto paramesonéfrico pudiera estar regulando la regresión de éste. La expresión de Sox9 en el ducto paramesonéfrico de machos ha sido reportada también en ratón desde los 13.5 dpc cuando comienza la diferenciación de los cordones medulares en túbulos seminíferos, hasta que el ducto paramesonéfrico se ha regresado completamente (Kent et al., 1996). Se sabe que la regresión del ducto Mülleriano en embriones macho de ratón está regulada por la hormona anti-Mülleriana (Amh), una glicoproteína secretada por las células de Sertoli. La Amh actúa por medio de un mecanismo parácrino, ya que son las células mesenquimales que rodean el ducto paramesonéfrico quienes expresan el receptor tipo II de la Amh (AmhRII), al cual se une para ejercer su función (Allard et al., 2000). Es probable entonces, que la proteína Sox9 este regulando también la expresión de AmhRII y de esta manera este contribuyendo a la regresión del ducto paramesonefrico en embriones machos de L. olivacea.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo confirman los obtenidos anteriormente para esta misma especie (Moreno-Mendoza et al., 1999; Torres-Maldonado et al., 2001 y 2002), contribuyendo además con información adicional que soporta la idea de que Sox9 podría jugar un papel importante en el proceso de determinación sexual, ya que a TPH, al final del periodo sensible a la temperatura, la expresión de este gen es regulada negativamente además de cambiar aparentemente su sitio de expresión de células medulares a células estromáticas, inhibiendo probablemente la diferenciación de las células de Sertoli y dando lugar quizá, a la fragmentación de los cordones medulares, iniciando así la diferenciación ovárica. Por otro lado, a TPM durante el periodo sensible a la temperatura la expresión de Sox9 se presenta en células estromáticas pero durante el

periodo de diferenciación sexual, la expresión de Sox9 aparte de aumentar sus niveles, cambia su sitio de expresión hacia las células pre-Sertoli, por lo que este gen es necesario para la diferenciación de las características fenotípicas de la gónada de macho. De manera interesante, en el lagarto, A. mississipiensis (Western et al., 1999), se ha reportado que la expresión de Sox9 presenta una regulación positiva en gónadas incubadas a TPM durante el periodo de diferenciación sexual, una vez que las gónadas ya se han diferenciado en testículo, resultados que coinciden con los reportados para L. olivacea (Moreno-Mendoza et al., 1999; Torres-Maldonado et al., 2001 y 2002 y el presente trabajo) y para T. scripta (Shoemaker et al, 2007a y b). Sin embargo, a TPH, Western y colaboradores (1999) encuentran una expresión basal de Sox9 tanto en el periodo sensible a la temperatura como en el periodo de diferenciación sexual, por lo que asumen que Sox9 sólo desempeña un papel importante en el desarrollo testicular. De esta manera concluyen que Sox9 no es un factor importante en la determinación sexual para A. mississipiensis. El efecto de la temperatura sobre la determinación sexual en A. mississipiensis es diferente al que tiene sobre L. olivacea, ya que en el lagarto, bajas y altas temperaturas producen en su mayoría hembras, mientras que temperaturas medias producen machos. Es probable que esta diferencia en el efecto de la temperatura sobre la determinación sexual influya en la manera en que Sox9 este regulando la determinación y la diferenciación sexual en estas dos especies, sin embargo encontrar la razón de esta diferencia es algo que requiere de mayor investigación.

Figura 37. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de Sox9 en cortes transversales de gónadas de L. olivacea incubadas a

TPH (33ºC) (A, B,C, D). Durante el Estadio (E) 24 (A, C), Sox9 se expresa a bajos niveles en células medulares (flechas), sin embargo para el E27 (B,D), la expresión disminuye aun más a niveles casi imperceptibles y esta se localiza en tejido estromático (cabeza de flecha). La hibridación in situ con la sonda “sense” (E, F), mostró una señal negativa tanto en el E24 como en el E27 (F). Barra de escala: 50 µm (A, B, E, F), 25µm (C, D).

Figura 38. Hibridación in situ de Sox9 en cortes transversales de gónadas de L. olivacea incubadas a TPM (26ºC) con la

sonda “antisense” (A, B, C, D). Durante el estadio (E) 23 (A, C), Sox9 muestra bajos niveles de expresión localizada en tejido estromático (cabeza de flecha), sin embargo para el E27 (B, D), la expresión incrementa notoriamente localizándose en células presuntamente pre-Sertoli (flechas). La hibridación in situ con la sonda “sense” (E, F), mostró una señal negativa tanto en el E23 como en el E27 (F). Barra de escala: 50 µm (A, B, E, F), 25 µm (C, D).

Figura 39. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de Sox9 en cortes transversales de mesonefros de L. olivacea

incubados a TPH (33ºC) (A, B). Durante el estadio (E) 24 (A), Sox9 muestra altos niveles de expresión, sin embargo para el E27 (B), la expresión disminuye notoriamente a niveles casi imperceptibles. La hibridación in situ con la sonda “sense” (C, D), mostró una señal negativa tanto en el E24 (C) como en el E27 (D). Barra de escala = 50 µm.

Figura 40. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de Sox9 en cortes transversales de mesonefros de L. olivacea

incubados a TPM (26ºC) (A, B). Durante el estadio (E) 23 (A), Sox9 presenta altos niveles de expresión, sin embargo para el E27 (B), la expresión disminuye notoriamente. La hibridación in situ con la sonda “sense” (C, D), mostró una señal negativa tanto en el E24 (C) como en el E27 (D). Barra de escala = 50 µm.

Figura 41. Hibridación in situ con la sonda “antisense” de Sox9 en ductos genitales de L. olivacea durante el E27, incubados

a TPH (A), donde se muestra una baja expresión (flechas), localizándose ésta en el lumen y en el brazo del ducto Mülleriano (DM). A TPM (B), se presentan altos niveles de expresión tanto en el ducto de Wolffian (DW) como en el ducto Mülleriano (DM). La hibridación in situ con la sonda “sense” (C, D), mostró una señal negativa tanto a TPH (C) como a TPM (D). Barra de escala = 50 µm.

Capitulo IV. Bloqueo post-transcripcional Sox9 en un sistema de