TRATAMIENTOS ANTIOXIDANTES Y OXIDANTES EN EA

En paralelo a la determinación del daño oxidativo al ADN en CMSP de personas con EA se realizaron los tratamientos antioxidantes y oxidantes para evaluar los efectos antioxidantes del AS, tanto en el daño oxidativo al ADN como en la viabilidad celular de CMSP.

3.1. SELECCIÓN DE AGENTES ANTIOXIDANTES

En esta Tesis Doctoral se evaluó por primera vez el efecto antioxidante del AS en células de pacientes con EA. Se utilizó un AS proveniente del manantial Platea, situado en Calatayud, y cuyas características físico-químicas se describen en detalle en la Tabla 4.

49 Para comparar los efectos del AS sobre las CMSP sometidas a estrés oxidativo inducido, se utilizaron diferentes agentes antioxidantes cuyos efectos ya habían sido previamente descritos (Duthie et al., 1996; Noroozi et al., 1998; De la Fuente y Victor, 2001; Zachwieja et al., 2005; Arranz et al., 2007; Sudheer et al., 2007). Se utilizaron ácido ascórbico (AA, Fluka), el análogo soluble del α -tocoferol (Trolox, Sigma-Aldrich) y N-acetil-cisteína (NAC, Sigma-Aldrich), tanto para el análisis del daño al ADN como para el estudio de viabilidad celular por MTT.

3.2. SELECCIÓN DE AGENTES OXIDANTES

Para inducir daño oxidativo a las CMSP se eligieron dos agentes oxidantes: peróxido de hidrógeno (H2O2, Foret) y homocisteína (HCY, Sigma-Aldrich). El H2O2 se

seleccionó debido a su larga vida media y su estabilidad en el medio fisiológico y se utilizó para el análisis del daño en el ADN así como para los estudios de viabilidad celular mediante MTT. La HCY es un aminoácido no proteico que puede inducir daño oxidativo de manera indirecta, mediante la generación de especies reactivas que pueden producir daño oxidativo a diferentes biomoléculas. Este aminoácido fue elegido como agente inductor de daño complementario solamente para los estudios de viabilidad celular mediante MTT.

3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL DE LOS TRATAMIENTOS CELULARES

Para la determinación de los posibles efectos antioxidantes del AS en pacientes con EA se diseñaron tres tipos de tratamientos a los que serían sometidas las CMSP de los individuos integrantes del estudio.

Tabla 4. Características químicas y físicas del agua mineral natural de Platea (Calatayud). Hernández Torres et al. (2007).

Reproducción autorizada por SUCARSE, S.L.

pH 6,7 NO2 - <0,02 mg/L CO2 21,0 mg/L NO3 - <5 mg/L H2S 8,83mg/L SO4 2- 3910 mg/L Ca2+ 650,5 mg/L NH4 + 0,1 mg/L Mg2+ 466,5 mg/L S2- 8,31 mg/L Na+ 2460 mg/L Hierro 0,72 mg/L K+ 15,5 mg/L SiO2 39,9 mg/L HCO3 + 276 mg/L Sr2+ 11,28 mg/L F- 3,1 mg/L Li+ 0,48 mg/L Cl- 3290 mg/L Mn2+ 0,09 mg/L

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Por un lado, se realizaron tratamientos cuyo objetivo fue comprobar que tanto el AS como los agentes antioxidantes de referencia no generaban un daño oxidativo

per se (tratamientos A). Los resultados de estos tratamientos se compararon con los

observados en las condiciones basales (CMSP sin añadirles ningún agente). La realización de este tratamiento evitó una posible infravaloración de los efectos protectores de los antioxidantes analizados en los resultados obtenidos con los tratamientos de tipo C (ver más adelante).

El siguiente tipo de tratamientos (tratamientos B) consistió en la generación de daño oxidativo adicional a las CMSP inducido por agentes oxidantes exógenos (H2O2 y

HCY). Los resultados de este tratamiento también se compararon con las condiciones basales, de manera que se pudiera observar si el aumento de estrés oxidativo inducido era significativo respecto a las condiciones iniciales.

Para finalizar, el tercer tipo de tratamientos (tratamientos C) consistió en la adición previa de agentes antioxidantes a la generación de daño oxidativo por agentes oxidantes. De esta manera, se analizó si los agentes antioxidantes seleccionados eran capaces de prevenir el daño generado por los agentes oxidantes, comparando los resultados con los de los tratamientos de tipo B.

Todos los tratamientos celulares se realizaron sobre una densidad celular de 104 células en un volumen final de 100 µL. En la Figura 13 se describe el proceso de manera esquemática. Los tratamientos con antioxidantes se incubaron durante 1 hora a 37 ºC. Los tratamientos con H2O2 y HCY se incubaron durante 30 minutos a 4 ºC. Al

finalizar cada tratamiento, se realizó una centrifugación a 100 × g durante 5 minutos y se resuspendieron las células en medio de cultivo RPMI-1640 sin rojo fenol para eliminar los agentes añadidos en cada tratamiento, y proceder al análisis de las muestras. En el caso de los tratamientos C, después del tratamiento con el antioxidante también se centrifugó a 100 × g durante 5 minutos y tras desechar el sobrenadante se resuspendieron las células en el medio adecuado para el tratamiento con el agente oxidante, y una vez finalizado se procedió al lavado final como en los demás.

Todas las soluciones, tanto antioxidantes como oxidantes, fueron conservadas a 4 ºC y llevadas a temperatura ambiente antes de ser utilizadas, a excepción del agua AS, que para mantener sus propiedades físico-químicas y su capacidad antioxidante era almacenada a -80 ºC. Las concentraciones finales de los agentes antioxidantes y oxidantes se describen en la Tabla 5.

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Tabla 5. Concentraciones de los agentes antioxidantes y oxidantes utilizados. Para el AS se tiene en cuenta la

concentración de sulfuro de hidrógeno (H2S).

Agua sulfurada (H2S) 26 µM Ácido ascórbico 10 µM Trolox 60 µM N-Acetil-Cisteína 2 mM Peróxido de hidrógeno 100 µM Homocisteína 10 mM Antioxidantes Oxidantes

Figura 13. Ilustración esquemática de los tres tipos de tratamientos a los que fueron sometidas las células de los individuos con EA y la correspondiente población control.

TRATAMIENTOS A TRATAMIENTOS B TRATAMIENTOS C

Adición de

antioxidantes Adición de oxidantes antioxidantesAdición de

1 hora 37 °C 1 hora 37 °C 30 minutos 4 °C 100 × g 100 × g 100 × g

Células Células Células

Medio RPMI-1640 5 minutos 5 minutos Medio RPMI-1640 Adición de oxidantes 30 minutos 4 °C 100 × g 5 minutos Medio RPMI-1640