NÜfMI G U A U H L U P E T O H H E N T t H ~ ULIVEilA

.

# d e L T A . 73327027

LA rl i<E

U

A

IidGEklLitlA DE LOS ALII~IENTOS

/

4

UTUd tNUL. ALUERTO R t Y t S DOHANTES

LULAR LAdOHATOHIO

U E

ENULOGIA 5-150

"dECUPILACIUN DE ItuFORMACIOk SOBRE EL AISLAMIENTO

E

IDENTIFICACION

U E

BACTtIiIAb MALULHCTICAS E N VINOS

Y SIlidAC"

i

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."

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.

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R E C U Y I L A L I O N DE IkFURfiAClUrd 5OH,ic EL A l b L A i v l E t 4 l U - E

I U E N I I t I C A L I C F ! UE J A L I LHIA:, N A L ú L A L I 1CAb Eh VINO:, Y

51 UHAS "

.

4

A L U H N O NÜfMI G U A U H L U P E T O H H E N T t H ~ ULIVEilA

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,+¡AT t i I C U L A 77327027

VSr

I .

1.

. .

.

1 . - INTRODUCCION

I

L a f e r m e n t a c i ó n m a i o i á c t i c a ( m L ) e s un fenómeno e v o i g t i v o d e l o s v i n o s , p o s t e r i o r a l a f e r m e n t a c i ó n a l c o h ó l i c a , y

es c a u s a d o p a r d i f e r e n t e s g é n e r o s d e b a c t e r i a s l á c t i c a s q u e t r a n s f o r m a n e l á c i d o m á l i c o p r e s e n t e en

los

v i n o s en á c i d o

l á c t i c o y b i o x i d o d e c a r b o n o . Esta t r a n s f o r m a c i ó n p r o d u c e cam b i o s f a v o r a b l e s en l e s c a r a c t e r i s t i c a s P i s i c o q J l m i c a s y o r g a - n o l e p t i c a s d e l o s v i n o s . E n t r o e s t o s c a m b i o s tenemos:

mejorá g u s t a t i v a a l s u a v i z a r s e e l v i n o , y a _qrie e l á c i d o l á c t i c o en c o n c e n t r a c i o n e s e q u i v a l e n t e s c o n e l á c i d o

má-

l i c o t i e n e u n s a b o r menos a g r e s i v o , mas " d u l c e "

.

P é r d i d a d e l aroma a f r u t a d o a p a r e c i e n d o c a r a c t e r e s o l f a t i -

vos más c o m p l e t o s , más e v o l u c i o n a d o s .

D i s m i n u c i ó n d e l a e c i d e z ' d e b i d o a l a f o r m a c i ó n d e l d i o x i - do d e c a r b o n o y su d e s p r e n d i m i e n t o d e l v i n o .

Aumento d e l a a c i d e z v o l á t i l p o r d e g r a d a c i ó n d e l á c i d o

'

c

t r i c o y a z ú c a r e s r e s i d u a l e s .

No o b s t a n t e

los

c a m b i o s f a v o r a b l e s que p r o d u c e l a f e r -

mentación

m a l o l á c t i c a e n

los

v i n o s , pueden r e s u l t a r a l g l i n o s

c a m b i o s n e g a t i v o s sin8 hay u n c o n t r o l adecJado d e l o s f a c t o

-

res que i n t e r v i e n e n d u r a n t e l a f a s e de l a f e r m e n t a c i ó n v i n i c a .

En

l a m a y o r i a d e l o s p a i s e s v i t i v i n i c o l a s como Alema

-

n i a , F r a n c i a , S u d a f r i c a , E.U.A., España, A u s t r a l i a , e t c . s e d e s a r r o l l a n i n v e s t i g a c i o n e s s o b r e l a F N L , c o n l a F i n a l i d a d d e a p l i c a r l a c o n t r o l a d a m e n t e en l a e l a b o r a c i ó n d e v i n o s que t i e - nen una a c i d e z f i j a a l t a .

En n u e s t r o p a i s l a m a y o r i a d e los v i n o s s e p r o d u c e n d e

v i n i f e r a o ' h i b r i d o s qiJe p r e s e n t a n u n a a c i d e z f i j a e l e v a d a d e b i d o a l a s c o n d i c i o n e s c l i m a t . i c a s p r e u a l e - c f e n t e s en l a s r e g i o n e s p r o d c t o r a s q u e no p e r m i t e n una ma&-

. .

. .

_{. .}

.

p e z adecuada y u n i f o r m e de l a s u v a s , e s t o t i e n e como c o n a e

-

c u e n c i a un v i n o d e s e q u i l i b r a d o en muchos c a s o s

o

muy á c i d o s

l o que r e p e r c u t e e n l a c a l i d a d o r o a n o l á p t i c a d e l v i n o .

~i i n t e r e s fundernantai que nos mueva a i a r e c o p i l a c i ó n y a n á l i s i s d e l a i n f o r m a c i ó n s o b r e l a f e r m e n t a c i ó n malolác-- t i c a e s . l a r e l a c i h que g u a r d a este fenómeno m i c r o b i o l ó g i c o con e l d e s a r r o l l o d e l e a c a r a c t e r i s t i c a a o r g a n o i é p t i c a s de un v i n o que l a haya s u f r i d o .

A l a n a l i z a r l a i n f o r m a c i ó n s e p r e t e n d e e s t a b l e c e r u n metodo p a r a e l e s t u d i o y c l a s i f i c a c i j n de l a s b a c t e r i a s ma-

l o l á c t i c a s hornofermentetives que en a l g u n a forma hacen l a f e r m e n t a c i ó n en muchos v i n o s n a c i o n a l e s .

I I

.-

OBJETIVOS

L o a o b j e t i v o s d e l p r e s e n t e t r a b a j o s o n :

a ) E s t u d i a r l o s métodos m e d i a n t e l o s c u a l e s s e han a i s l a d o y c a r a c t e r i z a d o b a c t e r i a s m a l o l á c t i c a s en v i n o s y s i d r a s .

b ) P r o p o n e r una m e t o d o l o g i s p a r a l a i d e n t i f i c a c i ó n d e

les

b a c t e r i a s m a l o l a c t i c a s a i s l a d o s d e v i n o s y s i d r a s , p o r

me

d i o d e p r u e h a a b i o q u i m i c a s e s p e c i f i c a s , que n o s p e r m i t a n o b t e n e r una c l a s i f i c a c i ó n taxonómica p o r g é n e r o , v a r i e d a d y e s p e c i e .

P a r a l o g r a r e l o b j e t i v o a n t e r i o r pretendemos e s t a b l e c e r l a s n e c e s i d a d e s en c u a n t o a macro y m i c r o n u t r i e n t a s s e r e p i e -

r a p a r a el c r e c i m i e n t o d e l a s b a c t e r i a s m a l o l a c t i c a s a i s l a d a s .

. . 3.

.

Los p r i m e r o s d a t o s sobre l a n a t u r a l e z a b i o l ó g i c a d e l a d e g r a d a c i ó n d e l á c i d o málico p o r ” m i c r o o r g a n i s m o s ” , p r o b a b l e -

mente f u e r o n o b t e n i d o s p o r L u i s P a s t e u r , (1858). B e u s s i n g e u l t

en 18b8,(7) r e p o r t ó que l a d i s m i n u c i d n en l a a c i d e z t o t a l d e

l a s i d r a d u r a n t e l a e l a b o r a c i ó n , guarda una r e l a c i ó n d e c a s i

l a mitad con r e s p e c t o a l a d e l mosto i n i c i a l ; este comporta

-

m i e n t o l o r e l a c i o n a con una “ f e r m e n t a c i ó n s e c u d a r i a ” . Sinem

-

b a r g o fué A l f r e d tioch, a f i n a l e s d e l s i g l o pasado, el p r i m e r o

en a i s l a r e i d e n t i f i c a r l a s b a c t e r i a s l a c t i c a s d e l a s h e c e s d e u n v i n o . L a p o s i b l e i n t e r f e r e n c i a d e l a s l e v a d u r a s en l a

f a s e de p r o p a g a c i ó n de l a s b a c t e r i a s p a r a l a i n d u c c i ó n d e l a

f e r m c n t a c i ó n m a l o l á c t i c a en u n v i n o , l a soluci.on6 empleando

5

c i d o s a l i C i l i c o . ( 7 )

L o s p r i m e r o s d a t o s numérico p r e s e n t a d o s sobre l a f e r

-

mentecibn m a l o l á c t i c a f u e r o n p r e s e n t a d o s p o r M u l l e r - i hurgau y U s t e r w a l d e r ; s u c e s i v a m e n t e Laborde, Ferre, y Aibereau-baym

r e a l i z á r o n a n á l i s i s mucho mas c o m p l e t o s que p e r m i t e n h a c e r e l b a l a n c e d e l a f e r m e n t a c i ó n m a l o l á c t i c a .

D e f n e r en 1938, e s t u d i a n d o

e l

metabolismo b a c t e r i a n o

/’ d e l a f e r m e n t a c i ó n c l t r i c a . con b a c t é r i a s a i s l a d a s d e l h o l l e -

j o d e l a uva, d e s c u b r i ó que una m o l é c u l a d e 6 c i d o c f t r i c o da o r i g e n a 1 . 3 m o l é c u l a s d e á c i d o f ó r m i c o , 0.11 a 0.22 molécu-

l a s de á c i d o s u c c i n i c o , 2 m o l é c u l a s de d i o x i d o d e carbono, y

t r a z a s d e a l c o h o l e t í l i c o . ñ e p i t i e n d o

el

e x p e r i m e n t o con á c i -

do o x a l a c é t i c o en l u g a r d e á c i d o c l t r i c o , o b s e r v 6 que l o s p r o 1

d u c t o s d e d e y r a u a c i ó n e r a n l o s mismos, e x e p t o an l a c a n t i d a d de á c i d o a c é t i c o formada, y a que se o b t e n i a n 0.3 a 0 . 8 m o l é c g

~ o . : p o c ..mol6cule , d a á5 ,p56lico, .eq..qec.aq, .. s e forma una m o l é c u l a menos de á c i d o a c é t i c o con r e s p e c t o a

.

mentación h e t e r o l á c t i c a , l a m o l é c u l a d e h c i d o c í t r i c o e 5 prim=

co t r a n s f o r m a d a en á c i d o o x a l a c é t i c o y despues en B c i d o a c e - tico. S i n embargo en su t r a b a j o D e f f n e r no h a b l a d e l a a c e t o i n e n i d e l b u t i l e n g l i c o l ; P e r o ya Íveuberg y c o l . en 1924,ha-. b i e n demostrado l a f o r m a c i ó n d e a c e t i l - m e t i l - c a r b i n o l a par- t i r d e l á c i d o o x a l a c é t i c o l mientras n r e m p i t z y kerkman en

-

1 9 4 1 demostraron que e l á c i d o p i r ü v i c o puede f o r m a r s e p o r d - c a r b o x i l a c i d n d e l á c i d o o x a l a c é t i c o . Simultaneam6nte K r e b s y

c o l a b o r a d o r e s en 1940, o b t u v i e r o n l a s i n t e s i s b i o q u l m i c a d e l B c i d o o x e l a c C t i c o a p a r t i r d e l d i o x i d o d e carbono y e l d c i d o p i r ü v i c o .

De t o d o l o e n t e r i o r se puede c o n s i d e r a r l a p r e m i s e b i g

química

fundamental p a r a l a c o r r e c t a y j u s t a i n t e r p r e t a c i ó n

d e l a a c t i v i d a d b a c t e r i a n a en l a f e r m e n t a c i ó n m a l o l á c t i c a .

LBS mayores d i f i c u l t a d e s p a r a l a s e p a r a c i ó n e i d e n t i f i

caci.5n de l a s b a c t e r i a s m a l o l á c t i c e s en l o s v i n o s o v i n o s de f r u t o s , han a i d o : l a n a t u r a l e z a ' t n e l i n d r o s ~ d e l a s b a c t e r i a s y l a p r e s e n c i a d e l a s l e v a d u r a s en l o s v i n o s .

P a r a s o l u c i o n a r l a primera d i f i c u l t a d se han p r o p u e s t o

el

empleo de medios s e l e c t i v o s de una mayor complejidad.

P o r

ejemplo Peyniud y co1.(1965) propone u n medio d e c u l t i v o p a r a a i s l a r l a s b a c t e r i a s de l o s v i n o s , p e r o no l o recomienda p e r a u s a r l o con microorganismos muy "melindrosos". Rogosa y c o l .

(1953) propuso u n medio p a r a e s t e t i p o de microorganismos, e l medio e s t á e n r i q u e c i d o con j u g o d e tomate, l o que p e r m i t e e l c r e c i m i e n t o de a l g u n a s b a c t e r i a s c o n s i d e r a d a s como "melindre-

888".

Ingraham J.L.(1963) hace una m o d i f i c a c i ó n a 1 medio d e Rogosa ( c u a d r o # I ) , el medio se a j u s t a a pii d e 5.5 con á c i d o

c l o r h l d r i c o ; p a r a medio s ó l i d o recomienda una concantraci6n de

Zh

d e agar-agar, e l medio se p r e p a r a con j u g o da tomate f i l t r a d o y s i n c o n s e r v a d o r en una d i l u c i d n d e 4 a 2. P e r a SO-

l u c i o n a r e l problema de l e s l e v a d u r a s , empleó u n f u n g i c i d e ,

(cic1ohexamida)en c o n c e n t r a c i ó n de 20 ug/ml. E l empleo de trig t o s a o t r i p t o n a d i 6 buenos r e s u l t a d o s , p e r o e s i n p o r t a n t e c o z s i d e r a r l a caducidad de l a t r i p t o n a .

De menezes i o b i a s J.d. (1Y76) empleó un medio formado con t r i p t o n a

-

g l u c o s a

-

e x t r a c t o de l e v a a u r a , complementado con j u g o d e tomate y 5 m l de dos s o l u c i o n e s ( A y

e);

l a compo s i c i d n de l a s s o l u c i o n e s se muestra en e l cuadro # 2.

"i ~. : . , ' w$t;+~,*w,", li

,

U .

-

I_

_I__-

-Llji<U>ICIUN I)LL PlCiJIU AUXORES

DE C U L T I V U J. INb3hhHfi

_{--_-}

Von iIAULttl LAFUI<-LAFUdCADE J.*LIvLLES

-

U L L l d j > A 0.3lU u . 2 5 p 4 . 0 9 2 0 mg 1 0 . 0 g

t r ; T i t ~ C T i i DE. L t N A O U H A U.O5',A 0 . 5 % 4.09 5 9 2,5

1 P I P T U H A 2.0, 2.0% 5.0 g

1 "tirid 80 0.05% 0.005/;

1

m l

t' LP 1 0 1. A O. 5s

0.5%

LACTUSH

o.

_2%

t A l H b C T U

DE

h

*DO

0.1%

ALAH 2 . 0 3 1.3'1;

L~~LULILIIU A SOLLCIUh B K C 1

k H2P04

co C 1 2

m

504 Mn SO4

EXTHACTO DE CARNE

P LPT ONA T HII'SINA ACETATO DE SOD10 C I l d A T O

DE

AMUtrIO

t d u C T 0 5 A

425mg

2SOmg

120mg

125mg 200mg

2.5mg 30mg

10 9

15

5 9

2 9

0.5%

5.0

m l

5.0 m l

C A 5 t I N A 5 9

SOLUCILN A soLucIíIri

B

r e a c t i v o c a n t i d a d ñ r e a c t i v o c a n t i d a d

K2HP04 50 9 Mg504 20 9

KH2P04

50

N e C l l g

H O ( d e s t i l a d a ) 500 rnl

Faso4.

4H20 l g

Mn504. H20 3 9

2

ti20 ( d a s t . 1 500 m l

CUAJIHO 2 LUMPOSICION

DE

LAb SULUCIGNES A Y

B

DEL

8.

acetati:, d e souio. 5 i n emberyo p a r a e l d e s a r r o l l a d e l e x p e r i -

mento cuyo o b j e t i v o e s v e r l a r e l a c i b n que hay e n t r e los 6 c i

dos o r y a n i c o s d e l mosto j u n t o con e l g l i c e r o l . e n l a forma

-

c i ó n d e á c i d o a c b t i c o . emplea como medio el d e C a r r ( 8 , que

c o n t i e n e c a s e í n a y g l u c o s a en a l t a p r o , i o r c i d n , o b s e r v d a d e

-

más que e l g l i c e r o l en c a n t i d a d e s mayores d e 10 g/l t i e n e un

e f e c t o e s t i m u l a n t e en l a d e y r a d e c i ó n d e los azúcares r e s i d u o

l e s y l a f o r m a c i ó n de á c i d o a c é t i c o .

I

I -

I

I

Von R e d l e r

F.

(1972) ( 1 4 ) empled u n meoio n u t r i t i v o p a r a e l c r e c i m i e n t o d e L e u c o n o s t o c *ne$ 870, L a c t o b a c i l l u s

Ic a s e i _ii48, L a c t o o a c i l l u s b r e v i s B 3 1 y P e d i o c o c u s p e n t o s a c e -

-

us B44, p a r a su d e s a r r o l l o empleo dos medios d e c u l t i v o , uno

con j u g o de uva d i l u i d o 1 a 1, e n r i q u e c i d o con 2 g/1 de e x

-

t r a c t o d e l e v a d u r a y e s t e r i l i z a d o d u r a n t e 20 minutos; l a corn p o s i c i d n d e l segundo se da en el cuadro no 1

,

el medio se

-

p r e p a r a con j u g o d e t o m a t e d i l u f d o 1 a 4 , SE e s t e r i l i z a a

12OoC d u r a n t e 1 5 minutos.

V.- CLASIF I C A C I U N DE BACTEHIAS

los métodos que se emplean p a r a a i s l a r e i d e n t i f i c a r

l a s b a c t e r i a s l a c t i c a s son los t r a d i c i o n a l e s ;

Los c u l t i v o s se checan p r i m e r o con r e s p e c t o a l a p r u q ba d e l a c a t a l a s e . f o r m a c i d n d e g a s en medio d e c u l t i v o s 6 1 i

do sembrados en p i q u e t e , s e h a c e l a t i n c i ó n d e Gram, e s t a s p r u e b a s son p o s i t i v a s p a r a f a m i l i a s L a c t o b o c i l a c e o e . Litras p r u e b a s son l a m o r f o l o q í é c e l u l a r ( b a c i l o s y c o c o s ) , f o r m a r d i o x i d o de carbono a p a r t i r d e g l u c o s a 6 f r u c t o s a e t c .

De Menezes T. J. 19761 (11) r e a l i z d e l e s t u d i o a i c r o

-

'aract e.+ m i c : r o o r g a n i B m b b , t ~ ~ u i ~ . ~ ..

! I

.. ,

9 .

.

t

8.

i

Aislamiento de cultivos: se procedió al aislamiento de bacte-

rias en vinos jóvenes por medio de la técnica de estrias en placa con m

con medio TTJ-20. Las colonias aisladas fueron purificadas por l a

técnica de dilución e n serie y nuevamente sembradas e n placas con

el mismo medio. Las colonias puras aisladas, confirmadas por el examen microscopico, fueron sembradas en tubo inclinado c o n medio TTJ-20.

Mantenimiento de los cultivos : los microorganismos aislados

fueron resembrados en tubos con medio TTJ-20 sólido e incubados a

30°C por una semana se conservaron en refrigeraci6n a 5%.

Las siguientes p r e b a s normalmente empleadas e n l a taxono- mía de las bacterias lácticas fueron efectuadas para clasificar las

bacterias iácticas aisladas (3, 5 y IS).

Motilidad L a motilidad fue examinada al microscopio en p o r

ta objetos conteniendo cultivos líquidos con 36 horas de incubación en

medio TTJ-20. E l resultado fue motilidad negativa.

Morfología celular: f u e examinada por medio de microscopio con aumento de cerca de 900 veces a traves de l a tinción

de

Gram.

Una posible presencia de esporas fue verificada por examen micros- copico de tinciones previamente preparadas por la técnica & colora-

ci6n con solución de verde de malaquita.

El autor observ6 cocos Gram

+

aislados o e n paredes y a ve-

ces formando pequeñas cadenas. Esporas ausentes.

Morfología de

las

colonias: el tipo forma y pigmentación de

las

colonias fueron observadas en medio &lido inclinado y en placas

de TTJ-20.

Presentaron ausencia de crecimiento e n el medio inclinado

TTJ-20 con agar.

nias puntiformes

y

ausencia de pigmentos.

En el medio &ido TTJ-20 se observaron colo-

Formación de catalasa L a posible formación de catalasa fue verificada por l a adición de soiuci6n de agua oxigenada a 3.0% en

cultivos desarrollados en medio TTJ-20 después de 40 horas de in-

cubación. Teniendo e n cuenta que ciertas bacterias lácticas pueden

presentar una falsa catalasa que se caracteriza por la ausencia de

grupo prostktico la molécula de enzima.

l a benzidina para detectar una posible presencta de grupo ferroporfirim. Se utili26 como 'agente

~~~~~~~~~~~~~~~~~

otro kmpuesto que contenga una molécula de ferroporfirina.

10.

I

-

.

tativas: Se caracteriza al grupo analizando la producci6n de GO2 a

partir de glucosa en el medio de jugo de tomate gelatina.

el anhfdrido carbbnico si fue producido a partir de glucosa e n el me-

dio nutritivo, lo que indica que las bacterias aisladas pertenecen al

grupo de heterolácticas

Observa que

Formacibn de ácido láctico a partir de azúcares: L a determi-

n a c i h de ácido láctico producido por los rnicroorganismos teniendo

como fuente de carbono azúcares (glucosa, sacarosa y xilosa) se de-

termin6 por cromatograffa e n papel según el isómero bptico producido

Para determinar la rotacibn del isómero 6ptico producido se

sigui6 el método de Pederson conforme a la transcripci6n de Skerman (17).

En el Cuadro No 2 se puede observar que el crecimiento de

los

microorganismos es mayor cuando el medio contiene glucosa com-

plementado con pequeñas cantidades de ácido cítrico, oxaloacético o bidvico, posiblemente actuan como receptores de hidr6geno en susti-

tución del ácido acético (Meyrath, J. Lebensm Wirs u. Technol. 2

(I): 22-27, 1969) también se puede observar que el ácido cítrico au- menta el consumo de los azúcares por los microorganismos.

Medición de la concentracibn de células: L a concentracibn de células fue medida por turbidimetrfa (Almeida 1976 11) usando tres tu-

bos para cada muestra L a Qbservancia fue leída en un espectrofotb-

metro Bausch & Lomb Spectronic 20 a 660 nm

Con el f i n de determinar la velocidad de crecimiento calcularon

(Menezes Almeida y colaboradores 11) el

número

de microorganismos (n)

obtenido durante un tiempo (t) en

fase

exponencial de crecimiento, uti- lizando la siguiente ecuación:

n

*

-

log N

-

log N o

log 2

log N

=

Absorvancia en un tiempo (t) log No = Absomancia en un tiempo (O)

i

El tiempo de generación

(9)

fue determinado por la fórmula:

I

\

experimento el c

se logr6 por la adicibn de jugo tona--giucosa-extracto de levad

pero incubando e n una atmósfeba saturada de GO2.

do,. del jugo de t o m a t e e s 6 asociado con la presencia de fwctosa,

o de las bacterias malolácticas imiento 'de

L:

~ cit&*rum ML-34

jugo de tomate en medio trip- ici6n de extracto de hígado,

. , ~ ~ ! S'" ~ "~6r*ejemplo ~ ~ , ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~

E l efecto estimular-

GLULUbA

bLUCLbA

AG. C I T R I ~ U

.>

ACH HU5 A

5ACAt305A

A G . m a i c l r

X I L U S A

X I L U S A

Ac. C I T R i C O

111 1.05

1.52 9

1

10 0.52

1.22

9

1

10 0.05

o.

21

9

1

1.05

U.

9 2

1.70

1.22

O. 37 0.48

1.40

0 . 9 6

0.04 0.04

0.21 0.18

L U A ~ I H U NO. 3 E F L C T O

DE

Ln FUENIE

nc

CAHUUNU LN EL CRE C I i í I t N T O

U t

oACTERIA5 L A C T I C A S EN

MEDIO

TTJ-20. (11)

II

. .

i

I

.

sirve como sbstibito el extracto de hfgado en un medio complejo conte- niendo glucosa (Stamer y Soyla 1971, Menezes et al.-11-).

(B) Taxonomía

--

de las bacterias malolácticac del vino: Por definición,

las bacterias maloldcticas son las bacterias lacticas que pueden fermentar e

el ácido málico, pertenecen a la familia Lactobacillaceae.

Usando l a ciasificación moderna ( S h a r p y Fryer 15) encontr6 que muchos miembros de la familia Lactobacillaceae son bacterias maiolác- ticas. Radler (1963) y colaboradores (7) eniista las bacterias aisladas

de vinos, las cuales descomponene el ácido málico: Lactobacillus buchneri,

Lactobacillus casef, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermenti,

Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus pastorianus y Lactobacillus painhirum;

Leuconostoc citrovorum, Leuconosbc dextranicum y Leuconostoc mesenteroides:

Pediococcus cerevisiae. A esta lista podemos añadir Lactobacillus brevis y Lactobacillus leichmannii (du Plessis 1964

-

7-). Algunas especies de Streptococcus

,

los cuales son maloiáctico, reportaron que se encuentran

en los vinos contaminados: C . mucilaginosus vini, S . malolacticus (Carr

y Vaugh, 1955 -7-).

L a alta concentración de alcohol y ácidos e n el vino,

más la

pre-

sencia c i e SO2 y la escasez de nutrientes hacen del vino un medio hbstil

para los microorganismos. Solamente ciertos g6neros se desarrollan

en

el

vino. L a familia Lactobacillaceae forma parte del orden de los

Eubacteriales. Los miembros de esta familia son Gram positivos, no

mótiles, anaerobios o microaerofilos, producen &ido láctico. L a au-

sencia de catalasa y un mínimo crecimiento en l a superficie e n un medio

de cultivo separa la bacteria ácido láctica de otras bacterias que algunas

veces se encuentran en el vino.

L a familia Lactobacillaceae se divide e n base a

la

morfologfa de

la célula en tribus de cocos y bacilos (Charpe y Fryer -15-2.

cocos

solamente los anaerobios facultativos son importantes como bac-

terias malolácticas y de éstas solo hay dos géneros: Pediococcus (homo-

fermentativos) y Leuconostoc (heterofermentativos). De los bacilos, nue-

vamente, solamente los anaerobios facultativos son importantes y éstos

incluyen

solo

al género Lactobacillus.

de l a temperabra 6ptima de crecimienb, actividad Óptica del ácido

Iáctico producido y tipo de a z k a r e s fermentados.

mentatiws son diffciles de clasificar, algunas veces, debido a que son espe-

ciales para s u nutrición, lo cual hace que se dificulte l a elección del medio para determinar el tipo de fermentacibn Kirkee (7). L a respuesta

de un Leuconostoc aislado por Ingraham (1960), (7) llamado como ML-34 fue pobre en todos los medios sintkticos.

glucosa solamente como fuente de carbono, se obtuvo buen crecimiento

organismo fue clasificado como L. citovorum.

De los

Además esta subdivisión depende

Los cocos heterofer-

En un medio complejo con

cuando la Gnica

nte

de carbono frie>+la sacarosa

*or;*

~~~,

Pediococcus: Dentro de este género hay varias especies pero

Requerimiento de ácido folínico: Muchos cultivos de P. cereviseae

tiene un requerimiento absoluto de ácido folfnico.

crecen e n un medio de triptona y son transferidos a un medio de caseína

hidrolizada y algGn medio s i n &ido folfnico. El requerimiento

de

ácido

folfnico se denota por la ausencia de crecimiento en el medio deficiente

de ácido folínico después de las tres transferencias ( S h a r p -15-).

Cultiws de Pediococcus

Pruebas seroiógicas: Gunther, White (1964) (15) detectaron Pre- cipita&.ones específicas características para diferentes grupos de

Pediococcus

.

Ausencia de catalasa: Muchos cultivos de P. cereviseae cuando

crecen

en un medio conteniendo un _bajo nivel de azúcar producen una

”pseudocatalasa” la cual descompone el per6xido de hiddgeno, pero difiere l a catalasa por no tener grupo pro&ico.

(15) demostraron que los sistemas citocromo pueden ser detectados e n

l a bacteria por una prueba de benzidina, por l a ferroporFirina y ésta

es una clara diferenciaci6n para bacterias ácido

Iácticas

(incluyendo producci6n de Pseudocatalasa) la cual no posee un sistema cibcromo. (Sharpe -1 5-).

DeIbel y Evans (1969)

Cuando los organismos se desarrollan e n un medio adecuado, con nutriente agar, el Iiplato” es lavado con una soiuci6n de benzidina clorhídrica, luego se añade un volumen igual de per6xido de hidr6geno

ai 5%. Si están presentes compuestos con ferroporfirina en el culti-

VD,

éste

se torna a un color azul.

Lactobacillus: Las especies de este g6nerc1 pueden ser dtferen- ciadas por medio de pruebas bioqufmicas, características fisiológicas

y serológicas y por s u requerimiento de vitaminas (Sharpe y Fryer

et.

al., -15-).

Fermentaci6n de carbohidratos: Inocular un medio basal, el m& recomendado es el MRS con glucosa y extracto de carne con un pH

de 6.4 al final. Pueden añadirse

más

carbohidratos al medio antes de l a esteriiizaci6n, pero manosa, xiiusa y maltosa se desnaturalizan con

el calor, por lo que pueden añadirse después de la esteriiizaci6n. /’

4 .

L a fermentación de moliiosa y .ti-afinosa y algunas

veces

xilosa, pueden diFerenciar L. plantarum y L. casei Cuadro No. (Sharpe Y

Fryer et. ai., -15-).

-

El L. fermentii no fermenta las pentosas

L.

buchneri fermenta

solamente l a melicitosa.

<;‘!*:+

,>>.+, .

es

ra confirmar l a diferencia entre Lactobacillus homo y heterofermentativos. L a concentracibn de glucosa e n el medio es importante porque una con-

. .

_-.

X

.

.

* -

E i A N ú L

E

E N C U L T i v u 4 C U i T l V O CULT iVO-&

VOLUi'iEN 9 A 9

n

9 A

--

_---

O. D

in

0.95

9

O.

56 10

O.

52

4.0

23

o.

28 29

O. 27

36

o.

22

8.0 110 0.15 190 0.03 200 0.03

10.

u

-

0.08

-

0.02

-

0.02

CUADRO No. 4 EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ETANOL SOBRE L L CRtCIMIENTO DE BACTEHIAS MALOLACTICAS EN MEDIO T T J - 2 0 A pH 5.5 E INCUBADO A 3OoC.

(g;tiempo de g e n e r a c i b n en h o r a s )

( A , a b e o r b o n c i a a 660 n m despues- d e 63 horas j i

1

t

i

3

.

10.1 _3.

.

ción alta del 2% solamente los cultivos heterofermentativos producen

NH3. Con una concentración baja

solo

los cultivos de L. plantarum

pueden producir NH3.

L a habilidad de desdoblar el aesculinn puede ser demostrando

por l a formaci6n de un precipitado negro e n l a presencia de citrato

férrico de amonio (Naylos y Sharpe, 1958; Sharp? et. al., (15)) o

por l a extinci6n de l a fluorescencia del aesculin( Rogosa y Sharpe 1958; Sharpe et. al. (15)).

especies en

los

homofermentativos.

Esta prueba se usa para distinguir las

Muchos Lactobacillus pueden ser clasificados por medio de s u solubilidad e n ácido, estabilidad al calor, antiogenos o grupos com- patibles con sus camcterfsticas. Cuadro No. 12.

Los requerimientos nutricionales de Lactobacillus son diferen-

tes de otras especies y pueden ser usados para confirmar s u identi-

dad. Los lactobacillus homofermentativos IX> requieren de tiamina para su crecimiento. Rogosa, Franklin y Perry, 1961; Sharpe et.

al., 15).

Leuconostoc : Leuconostoc mesenteroides y Leuconostoc

dextranicum frecuentemente se desarrolla con Lactobacillus brevis

entre

ellos no hay diferencia morfoi6gica.

puede diferenciar, por su habilidad de fermentar l a trehalosa, pero

no hidroliza l a arginina porque forma ácido D(-)láctico. En cambio L. brevis no fermenta la trehalosa, hidroliza l a arginina y forma ácido OL-láctico. Cuadro No. 12.

S i n embargo, Leuconos&c

VI.- FACTORES FlSICOS Y QUIMICOS EN LA FML:

Kwch (1900) (E), Kunkee y colaboradores (15) indican que las bacterias malolácticas requieren de factores especiales para aislar-

las.

Estos requerimientos son generalmente los mismos que en las

bacterias lácticas.

rnalolbcticas son

más

tolerantes al alcohol y a la acidez más que

otras bacterias lbcticas, no siempre las condiciones de crecimiento

de dicha bacteria indican una rápida conversión de ácido málico a &ido lbctico.

S i n e m b a r n , dado que una clase de bacterias

Los experimentos sobre la FML pueden describirnos algunos

casos sobre el crecimiento y metabolismo de las bacterias malolácti-

cas, pero es requerida una interpretaci6n cuidadosa de tales resulta- ;r;** #a** ~... i 'MW

,>*,.

ser' aptfcadas.

(A>: Factores mitricionales:

1 1 .

.

.

.

ácidos, purinas, pirimidinas, vitaminag adem& de minerales, fuentes

de carbono y nitr6geno. Estas bacterias son utilizadas en bioensayos para factores de crecimiento, incluso se han enlistado

los

aminoácidos

indispensables para estos organismos, p r ejemplo, el L. citrovorum requiere de l a asparagina, cianocobalamina, inositol, ácido aminobutf-

rico, pirwato de sodio. Como fuentes de carbono: xilosa, arabinosa,

galactosa y sacarosa.

Todos los medios de cultivo no sint6ticos para bacterias malolác- ticas contienen extracto de levadura, lo cual slgnifica que l a presencia de levaduras puede suplir los nutrientes para

las

bacterias.

Otros componentes inorgánicos son también importantes. (ackler

1964, Kunkee y colaboradores -15-) demostraron que el potasio, sodio magnesio y manganeso son requeridos para el crecimiento de las bac-

terias maloiácticas, pero no establece en que ooncentracibn. El cre-

cimiento de las bacterias est6 influenciado por el magnesio. Radler

y

col.

(14) demostraron también que 2 nm del

i6n

de potasio se re- quieren para un máximo crecimiento e n un medio sintktico. Forna--

ch6n

(1964) y

col.

(15) añadieron una mezcla de sales inorgánicas cOmo

complemento del medio de cultivo para Leuconostoc.

(B) Factores físicos

pH bajo. L a F M L realmente ocurre en vinos a un pH de 3.4 y fre-

cuentemente a un pH más bajo. El rango de pH para crecimiento

varia con cada organismo.

tanto

como e n el crecimiento de l a bacteria.

pH: E l vino es altamente ácido y las bacterias aisladas toleran

L a acidez del medio influye en l a FML

Rankine (1963) (7) o b s e d que l a incidencia de la FML en vinos

con

pH menor de 3.5 e r a menos frecuente que en vinos de pH de 3.8- 3.9 siendo rara en vinos de pH 3.4.

o b s e d que

los

vinos con pH !abajo de 3.2 dificilmente eran sujetos a

la FML.

Fornachbn (1957) (11) también

/'

E l pH óptimo para l a cepa ML-34 está entre 4.5-5.4 con creci-

miento nulo a un pH de 3.6.

l a FML con inbcuio de ML-34 en vinos con pH de 4.0 cuyo contenido de alcohol excede al 6% e n volumen. Esto explica también porque el

in6culo

de ML-34 es usado con éxito para inducir

la

FML e n vinos de baja acidez.

Posiblemente porque es difícil inducir

(C) Factores qufmicos:

v

s u Dresencia en el Etanol: L a cualidad vino. demndiendo de l a concentración. tiene un

del etanol como antis6ptico es bien conocida

-

sbacterias -.maioláeticsta ..' lii*WW)íul*@# W,'b ,'

-

E l tímite legal e n California para vinos tintos es de 10 a 14%

en volumen de alcohol y la FML es detenida pero no necesariamente

pmvenida.

nas veces es detectable a 6% e n volumen. L a tolerancia al alcohol

.

.

varia con la especie y es diffcil generalizar.

Menezes-Almeida et. al. (11) reportan un medio con 8% en volu- men de alcohol que presenta un tiempo de generacian de 110 horas, mi- diendo el crecimiento por medio de la absorbancia. (Cuadro _No. 3) a 660 nm.

Temperabra: La temperatura óptima de crecimiento varia con

la especie, esto se puede corroborar en el Cuadro No. 4.

Menezes-Almeida y col. (11) enuncian los 30DC como la tempera-

tura 6ptima para la FML. Sin embargo, los cultivos pudieron crecer

en un rango de temperaturas comprendidas entre 15 y 37OC.

cidad mbtima de crecimiento en terminos de tiempo de generaci6n (9)

fue de 9 a 10 horas a 30°C.

el tiempo de generación aumens6 cerca de tres veces más. 7% arriba de la temperatura 6ptima hubo una pequeña inhibici6n de dos de los tres

cultivos experimentados, lo que indica que cada cultivo se comporta de

manera diferente en reiaci6n a la temperatura.

La

velo-

10DC abajo de la temperatura óptima,

Wyck y coi. (160) describen que la temperatura óptima para cre-

cimiento de la cepa ML-U4 fue también de 30°C.

cuitivos para desenvolverse en estos intervalos de temperatura indica que

_las

condiciones ambientales, en que son producidos los vinos

co-

merciales,

con

favorables para una fermentaci6n maloláctica efectiva. La capacidad de los

Oxígeno y Potencial Redox: Las bacterias malolácticas no

son

anaembias estrictas y pueden desarrollarse en presencia de oxfgeno. Sharpe-Smith y col. (15). Normalmente forman colonias en la super-

flcie

de un medio sólido. E l oxígeno parece tener un efecto benefiw

en su crecimiento.

más rapidamente cuando el potencial redox está cerca de

+

0.4

volts.

Bocker (7964) (7) inició la FML con un potencial redox entre

+

0.1 y

/'

+

0.2

volts.

Las anaerobias estrictas usualmente requieren un poten- cial redox menor de

-

0.1 volts (Riberau-Gayon, 1961).

Charpiente (1954) (7) observó que la FML se inicia

Anhidrido sulfuroso: E l SO2 es mundialmente usado para l a pro-

Fell 1961 (7) describe que ducci6n de vino detodas calidades.

iolácticas pero noietal (Wyk y col. (17)).

l a bacteria maloláctica es sensible a ciertos niveles de sulfuroso.

Es inhibidor para

las

bacterias ma-

El

SO2

libre existe como ácido sulfuroso, sulfito

o i6n bisulfito.

De la forma libre solamente el ácido sulfuroso es directamente activo

i

sobre el metabolismo de la bacteria, probablemente por la oxidaci6n

i

~~~~~~~~,

u1

las pro (Kunkee y col.

rectamente inhibidor por su combinaci

dehfdo, necesario para la célula en la reoxidación o reducci6n de en-

zimas.

del pH del vino.

X

n

a.

.

.

PHUEdH Ac.MALIC0 PH A c . VOLATII Ac. T O T A L

I N I C I A L F I N A L I i J I C I A L

F

IIVAL I N I C I H L

F

IPIAL

A

B

c

b l a n c o

--

3.25 3.40 0.20

o.

136 11.30 9.9

--

3.25 3.40

o.

20 0.88 11.30 9.6

--

3.25 3.40

o.

20 1.15 11; 30 10.2

( p o s i t i v o ) 3.25 3.25 0.20 0.37 11.30 11.0

[ r e s u l t a d o s en m l d e NaOH 0.1 N g a s t a d o s p a r a ne% t r a l i r a r 100 m l de rnoatoJU

CUADRO No. 5 A L T t H A C I U N t S QUE SUFRL

U N

ML3TO INUCULADO 5IMULTA

. .

_{. .}

i

..

.

Fornach6n (7) observ6 que las bacterias lácticas metabolizan parte del sulfuroso combinado y que el sulfuroso libre incrementa s u

efecto inhibidor. En el Cuadro No. 4 se muestran

las

cantidades de

sulfuroso que reportan. Noguera ( ) y Jakquea como normal per-

mitir desarrollarse la FML.

Taninos: La acidez y el alcohol

solo

son responsables en parte

Masqueiier (1959) (7) m e s -

de las cualidades antisépticas del vino.

tra que el tratamiento actual para el vino remueve mucho la activi- dad antibi6tica contra Salmonella, Staphylococcus y bacteria coliforme. Los taninos (compuestos fer6licoc) parecen ser los responsables. S i n embargo, la bacteria ácido láctica parece ser resistente a los taninos

de la uva. Fornacl-bn (1953) (7) apunta que l a actividad antibacterial de los taninos ocurre más rápidamente e n vinos blancos que e n vinos

tintos.

ci6n de taninos, en concentraciones mayores de 0.5 g/i, pero l a can-

tidad que se aride usualmente es menor (Cuadro No. 4).

Se puede retardar la esporulación de

las

bacterias con la adi-

Tres mostos inoculados conjuntamente con bacterias y levaduras también mostraron un aumento de pH (Cuadro No. 5), disminución de l a acidez total, io cual no ocurre con ei patrón que fue inoculado sola- mente con levaduras. Es importante notar que los tres cultivos de bac-

terias malolácticas provocaron un pequeño aumento de acidez volátil,

comparado con el patrdn.

ción normal.

Estos valores se presentan e n una vinifica--

VU.- METABOLISMO:

(A) Reactivos:

Fermentación de azGcares: Son reconocidos dos tipos diférentes de

fermentación de azúcares por bacterias Iácticas. Un grupo produce en

mayor cantidad ácido láctico a partir

de

l a gluccsa, éstos son llamados

homofermentativos. E l otro grupo, bacterias heteroférmentativas, con-

vierten aproximadamente l a mitad del azGcar en ácido láctico, una ter-

cera parte a etanol y una sexta parte en bióxido de carbono

(los

hetero-

fermentativos se caracterizan pqr l a producción de gas a partir de l a glucosa).

i

L a ruta del catabolism0

cie

la glucosa por

las

bacterias h o m o f e r

mentativas es l a de la glicolisis que nos es familiar (Embden-Meyerhof). En la glicolisis, la hexosa difosfab es fragmentada en dos unidades de

tres carbonos, las cuales son qxidadas a ácido pi&ca y reducidas a bcticd:‘”‘%lo hay un cambio neto e n el estado redox de las coen- zimas, pero es una formación tedrica de dos fosfatos de alta energfa

erJrs

--

2c.

. .

_.

_.

.

AUTOR FACTORES F I S I C G ~ Y I N I C O S 4LIE INTERVIENEN EN LA FML TANINOS

so

2

T EMP E RAT U H A O C PH ALCUHOL

E. KUNKEE 20 e

25

O C 3.4

-

0.5 9/1

T .MENEZES 10 OC 3.2-3.7 4-10s

-

--

M.

J A C Q U t S 1 8

-

22 O C 5 - 6

-

35PPm

--

A . N o g e r a 20

-

25 'l. 2.9-4.0

-

30PPm

--

CUADRO No. 5 FACTLIHEb F I S I C U S Y QUIMICOS ENTRE L O 5 dUE S E R E A L I Z A LA FERMENTMCION HALOLACTICA PARA

, .

. .

14.

1.

.

.

l a cual cataliza la división de l a hexosa difosfato en

dos.

Esta glicoli-

sis est6 bloqueada en l a bacteria homofermentativa y l a glucosa es fer-

mentada por i a primera parte de ia vía de i a hexosa monofosfato. glucosa fosforilada es oxidada y descarboxilada a pentosa fosforilada. Después es nuevamente fosforilada y dividida e n dos compuestos de tres

y dos carbonos. El compuesto de tres carbonos es convertido a ácido

láctico. L a unidad de dos carbonos, acetil fosfatil, es reducido a eta-

no1 y fosfato inorgánico. En lo anterior, no hay un cambio neto e n el estado redox de las coenzimas (dos moléculas de las cuales son redu-

cidas e n la formación de la pentosa y

son

reoxidadas e n l a formación de etanol) Kunkee y col. (7).

L a

Los caminos seguidos representan solamente l a mejor ruta del catabolismo de las hexosas. Otros caminos son algunas veces impor-

tantes, por ejemplo, en l a bacteria heterofermentativa la reducción de fructosa a manitol es importante y es usado como una prueba de diag-

n6stico para esta clase de organismos.

hacen aproximadamente dos moleculas de manitol y una

de

ácido lác-

tico, ácido acético. (o etanol) y dibxido de carbono. Esta vfa aparen- temente compite con l a vía

de

la hexosa monofosfato. Wood 1961

,

Kunkee et. al. (7).

Tres moleculas de fructosa

En la fermentación de

las

pentcsas no ocurre una reducción de

l a coenzima e n las etapas iniciales, no es necesario usar acetil fos-

fato como un aceptor de hidrógeno. L a alta energía del fosfato del acetil fosfato puede ser conservada por transferencia a difosfato de adenosina. El resultado es unagran cantidad liberada de fosfato de alta energía y la formación de &ido acético e n lugar de etanol como producto final. Esta fermentación de l a pentosa ocurre e n bacterias

homo y heterofermentativas.

tica puede usar pentosas contenidas e n

los

vinos, con gran eficiencia.

Melamed 1962, Kunkee et. al., (7).

Esto demuestra que l a bacteria malolác-

Además de las hexosas y pentosas pudieron ser detectadas otros

azGcares contenidos e n el vino. Desafortunadam=nte es poco el cono-

cimiento acerca de s u metabolismo por l a bacteria ácido Iáctica. L a

Sedoheptulosa está envuelta en el ciclo de l a pentosa de la desviación de la hexosa monofosfato.

tiva muestra que el ciclo de S i n embargo, estudios l a &rticsa fosfatada no con glucosa radioac- _{es operativa} e n l a

I bacteria ácido láctica. Bernstein 1955, Sharpe et. al. (15).

I

:

i

i

!**A7

Como se apunt6 que las t+cterias maloiácticas son microaerofi-

las,

si l a coenzima reducida formada durante la oxidaci6n de glucosa e n l a bacteria heterofermentativa puede ser reoxidada por oxígeno como

un organismo aeróbico, el fosfakto de alta energía del acetil fosfato pro-

rvado cotno e n l a fermentación de las pentosas. * Existen opiniones sobre fosforiigci6n oxidativa u otras reacciones con

oxígeno e n la bacteria ácido lá6tica y otros anaerobios (Davis, Wood, Gallin) probaron un cultivo de Leuconostoc mesenteroides e n el cual

I

I

t .

ued

15.

. .

_{. .}

fuente

extra

de energía puede ser de ginan beneficio para l a bacteria maloláctica en vinos, los cuales contienen muy bajos niveles de

fuentes de energfa. Sharpe-Fryer et. al. (15).

Muchos de los azGcares residuales, tales como las pentosas,

las cuales son contenidas solamente e n cantidades pequeñas en el

vino, quizás no son viables como fuentes de energfa para todas las

bacterias malolácticas. Frecuentemente la mawinaria para el meta-

bolismo de azúcares (algunas hexosas pueden ser inducidas e n la bac-

teria y la inducción puede requerir concentraciones tan altas como

del 274, muchas veces más altas que el vino.

1959 (15).

Rogosa y S h a r p ,

L a s d a s para la fermentación de azúcares antes mencionados,

La utilización de estas vías por los microorganismos

son las mejores para obtener como productos finales el ácido láctico,

etami y C 0 2 .

depende no solamente del cultivo, sino también del pH, sustrato, poten- cial redox, etapa de crecimiento de los microorganismos, etc. Gunsalus y Campbell (7).

Acido pirúvico: El ácido pirÚvico est6 presente en cantidades relativamente pequeñas pero está implicado en la FML (Rankine, 1965),

la

concentración es baja e n vinos que hayan sido sometidos a la desa-

dificación. E l ácido pir&ico es de los reactivos biológicos

más

ines-

tables y ciertas reacciones producen importantes componentes del sabor.

Antes mencionamos la reducción del ácido p i d v i c o a ácido

iác-

tico. Este ácido p i d v i c o actua como aceptor de hidrógeno en l a

reo-

xidación de las coenzimas como el NADH', puede además ser oxidado

o descarboxilado con el fosfato del acetil fosfato.

molécula de ácido p i d v i c o actua como aceptor de hidr6gen0, el hidr6-

geno es transportado e n una flavoprotefna.

es reducido y el per6xido de hidrbgeno resultante oxida a una segunda molécula de ácido p i d v i c o a ácido acético y dióxido de carbono.

Hager, 1954 (15). En este caso la alta energfa del fosfato, el cual

fue transferido al ADP, es formado de dos moléculas de ácido p i d v i c o

El

Acetil Posfato libre puede ser un aceptor de hidrógeno e n l a reduc- cián del etanol y fosfato inorgánico.

mado e n esta reacción como e n la vía de l a fermentación alcohólica. En un caso, otra

En el otro caso, el oxígeno

El acetaldehfdo libre no es for-

El ácido pir6vico es el precursor de tres copprestos de cuatro

carbonos; el diácetil (2,3-butilenglicol), acetoha (3 hidroxy-2-butanona)

y butilenglicol (2,3--butanodiol). Estos compuestos se encuentran e n el

vino. El mecanismo para s u formación no est& completamente aciara-

i d v i c o

a

ácido

pone que para la f o r m a c i h de acetofna reac-

-Y)**.

y así este ácido es descarboxilado a acetoha. En l a fermentación ho-

.

p i r ú v i c o p r o v e n i e n t e d e l a ferrnLntaci6n d e l a g l u c o s a . LB 9 t r a m 9 l g

c u l a d e á c i d o ? i r u v i c o se r e d u c e a a c i d o l a c t i c 0 b a l a n c e a n o o s e e l

p o t e n c i a l roclox d e l a cot;nzima.

Ue Moss 1 9 5 1 ( 7 ) o p i n a que l a a c e t o l n e puede r e d u c i r s e a bu- t i l e n - y l i c o l , l a s c a n t i o a d e s d e a c e t o f n a y b u t i l e n g l i c o l dependen d e l a c a n t i d a o d e i o n e s h i l l r o g e n o d i s p o n i ü l e . apeckman 15Ó6 ( 7 ) su-

puso que e l d i a c e t i l o e s un p r o d u c t o d e o x i d a c i d n o e l a a c e t o f n a . S i n enibargo e x p e r i m e n t o s >osteriores r e a l i z a d o s con e x t r a c t o de cE- 1 u l a s . i n d i c a n que l a v f a d e f o r m a c i d n d e l d i a c e t i l en l a b a c t e r i a

4

c i d o - l e c t i c a no e s p o r l a v f a de l a a c e t o l n a como SE. sup2nfa. t s t o

a p e i e n t e m e n t e m u e s t r a como l a a c e t o l n a se forma d e l á c i d o p l r u v i c o

p o r v l a d e l a c e t a l d e h i d o - t i a m i n a p i r o f o d f a t o . P a r u l t i m o , s e a o i c i o - ne con e l a c e t i l coenzirna A l a c u a l sa r e a r r e g l a a d i a c e t i l p a r a r= g e n e r a r e l c a r b a n i o n d e l a t i a r n i n o p i r o f o s f a t o .

O t r o s p r o d u c t o s d e l metabolismo d e l á c i d o p i r ó v i c o , en e l g u - nas b a c t e r i a s es e l á c i d o f d r m i c o

e l

c u a l v i e n e o e l d e s d o b l a m i e n t o

d e l á c i d o p i r ú v i c o . E l f o s f a t o de a l t a e n e r g f a es p r o d u c i d o en é s t a r e a c c i ó n en f o r m a d e o t r o s p r o d u c t o s , a c e t i l f o a f a t o . Fornachon 1905

( 7 )

o b t u v o ra3idainente l a ferrnentacidn m a l i l e c t i c a cuando aRadi6 á-

c i d o p i r ú v i c o .

A c i d o C i t r i c 0

El

á c i d o c i t r i c o se e n c u e n t r a en l a s u v a s en c o n c e n t r a c i o n e s mucho menores que l a s . d e l o s á c i d o s i n á l i c o y t c r r t á r i c o , g e r o a l g J n i s v e c e s s e . a ñ a d c p a r a a c i d i f i c a r los v i n o s . P l e s s i s 1964

( 7 1 ,

ocmostrd en c u l t i v o s m a l o l a c t i c o s d e P. c e r e v i s i a e y L a c t o b a c i l l u s o u c h n e r i que no todas l e s b a c t e r i a s r n a l o l & c t i c ' a s m e t a b o l i z a n e l á c i a o c i r r i - co, tainbien s e demostró en L a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i i . L a s b a c t e r i a s que m e t a b o l i z a n e l B c i d o c i t r i c o l o usan como f u e n t e d e e n e r g l a . L n

l a p r i m e r a e t a p a e l á c i d o c i t r i c o e s d e s d o o l a d o a á c i d o o x a l o a c e t i o

'RB,&.w,c'e

. .

.

'*

.

a l c i t r a t o . i n S t r e p t o c o c u s d i a c e t i l a c t i s , el á c i d o c l t r i c o me-

t a b o l i z a d o s e e n c a r g a u e allJune itbanera d e l a d e s t o x i f i c a c i j n .

S h a r p e y tryer (15).

P l e s s i s 1 Y b 4 ( 7 ) , e s t u d i 6 l o s p r o d u c t o s r e s t a n t e s o e l a f e r m e n t a c i ó n d e l á c i d o c l t r i c o p o r a l g u n a s b a c t e r i a s n a l o l á c t i

-

c a s ; los p r o d u c t o s f i n a l e s en mayar c a n t i d a d fueron: á c i d o l a c t i

co, á c i d o a c é t i c o , u i o x i d o u e carbono; m i e n t r a s que en o t r a s u a c

t e r i a s , á c i d o f ó r a i c o , e t a n o l , á c i d o s u c c i n i c 0 y a c e t o l n a . Char-

p i r n t e 1 9 5 1

(7).

demostro'la ,irest-ricia d e b u t i l e n g l i c o l como pr-

d u c t o f i n a l de l a f c r m t n t a c i ó n .

beneralrnante s e p i e n s a que el á c i d o niglicu ea c o n v e r t i d o

e s t e q u i o r n e t r i c a m e n t e a á c i d o l á c t i c o y b i o x i d o d e carbono p o r l a

b a c t e r i a m a l o l á c t i c a . P l e s s i s 1 Y b 4

( X )

o b t u v o el

97%

d e l c a r b o n o

d e l á c i d o m á l i c o como á c i d o l á c t i c o y b i o x i d o d e c a r b o n o , e m p l e e

do como i n o c u l o L a c t o b a c i l l u s b u c h n e r i . Con o t r a s b a c t e r i a s malo-

l e c t i c a s l a r e c u p e r a c i ó n f u e menor, como de un 85%. también S E

form6 e t a n o l . Con b a c t e r i a s homofermenta i v a s s o l o se f o r n a r o n

a c e t o l n a y d i a c e t l l o .

i

L1 á c i d o L-máiico e s 61 á c i d o n a t u r a l d e l a s uvas, a l

is0

mero

U

s e e n c u e n t r a en ei rnobto cuanao s e añade p a r a aumentar i a

a c i d e z . Las b a c t e r i a s i n a l o l 8 ; c t i c a s no degradan a l isómero U. S i n

e m h e r g o , i t a d l e r e t a l . ( 1 4 ) : r e p o r t a l a i n h i b i c i ó n d e l a i n d u c c i b ,

de l a enzima m á l i c a p o r e l & c i d 0 U-málico. &hora b i e n , l a FPiL se

1

:

I.

~

~

r,. .

~

1

~

...*~,..~.,..<,.-l..~,. %.*i,..*

~

.,.,. I ..,. . , ,

...

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~

~

~

~

~

,

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~

~

*

~

~

~

. .

_{. .}

.

d e á c i o o s D y L m á l i c o p a r a s u ~ l e m ~ n t a r 6 reinplazar el á c i c o n=

t u r a l .

Ll

A c i d o m á l i c o p r e s e n t a en o c a c i o n e s u n d é b i l efecto

so

b r a l a a c t i v i d a d d e l a d e a h i a r o g e n a z a iiiálica usada en ensayos

e n z i m á t i c o s de á c i d o L m á l i c o .

P r o d u c t o s

Durante l a f e r m e n t a c i ó n m a l o l á c l i c e , 51 á c i d o l a c t i t o e s

el p r o u u c t o nias abundante, se for2na a p a r t i r d e los a z ú c a r e s ra

c i d u a l e s p r e s e n t e s e n e l mosto f e r m e n t a d o , o a l á c i d o m á l i c o , y

d e l á c i d o c í t r i c o . L o s t i 9 0 d e á c i d o l a c t i c o formados a p a r t i r d e l a g l u c o s a (

D

y

L

) e s t á n en r e l a c i ó n con e l t i p o d e micro- organismo. L a s b a c t e r i a s m a l o l a c t i c a s t í p i c a s , p r o d u c e n á c i u o

D

l á c t i c o o una m e z c l a d e á c i d o U y L l á c t i c o , ( D i t t r i c h ( 4 ) ) . P e d i o c o c u s c e r a v i c i a e forma á c i c o DyL l e c t i c o ; L e u c o n o s t o c s p p

forma á c i d o D l á c t i c o ; y de los l a c t o b a c i l l u s m a l o l a c t i c u s s o l a

mente L a c t o o a c i l l u s d e l b r u e c k i i forma j u s t a - e n t a el isómero L. hay c i e r t a c o n f u s i ó n a c e r c a de los i s ó m e r o s o e l á c i d a l k t i c o ,

el á c i d o L l á c t i c o en e s t a d o s o l i r i o e s l e v ó g i r a en e s t a d o s ó l i d o & i e n e l a misma c o n f i g u r a c i ó n que e l á c i d o L - g l i c e r i c o ) , p e r o en

s o l u c i ó n e x i s t e una d e x t r o r o t a c i ó n fuerte, r o t a l a l u z 2 o l a r i z g

da a l a a L r c c h a , Bsta i s ó m e r o il es p o r ello l l a m a d o " p a r a l a c t i -

cofl. K u n k e e 17).

P a r t e d e l á c i d o l á c t i c o d e los v i n o s e s 3 r o d u c i d o ! > o r 1s

. i i t a C i 8 ' ~ ~ , ~ . ~ ~ ~ ~ , ? : n a l c o i i o i i c a 3. y e

v i n o s qua hayan s u f r i d o l a ti%, e l á c i ú o l á c t i c o s e p r o d u j o p u r

.

l a FML, e l á c i d o l á c t i c o se p r o d u j o p o r l e s b a c t e r i a s a p a r t i r

de á c i d o m á l i c o . > e examindren v i n o s s u j e t o s a l a FNL que reve- l a r o n l a , , r e s e n c i a d e l isSmero L

+

l á c t i c o como l a forma predo-

minan t e .

.

‘.

5uhp roduc t o s

LOS mostos y v i n o s contienen una c o n c e n t r a c i ó n n á s o me-

nos importante d e a z b c a r e s , g l i c e r o l , á c i d o c í t r i c o y á c i d o ta=

t a r i c o , s u s c e p t i b l e s de o r i g i n a r l e formacidn de á c i d o a c é t i c o

e n t r e o t r a s c o s a s . Uns f u e r t e c o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l de a z ú c a r e s

en l o s mostos f a v o r e c e l a formación de á c i d o a c é t i c o p o r l e s

le

v a d u r a s d u r a n t e l a fermcnteción a l c o h o l i c a . D i t r i c h y c o l . ( 4 )

,I’

Lafourcede.Joyeux; ( 8 ) r e a l i z a r o n un t r a b a j o p a r a p r e c i -

s a r e l metabolismo d e l á c i d o a c é t i c o con r e l a c i d n a l fenómeno

de c r e c i m i e n t o a p a r t i r de d i f e r e n t e s s u s t r e t o s . Experimentaron

con una b a c t e r i a h e t e r o l 5 c t i c a , L a c t o b a c i l l u s b r e v i s en u n me4

d i o s i n t é t i c o con un pti de 3 . 5 . conteniendo c a n t i d a d e s i g u e l e s

de g l u c o s a , f r u c t o s e , y á c i d o m á l i c o ; s e c o r r i o o t r o experime’

t o an i g u a l e s c o n d i c i o n e s p e r o s i n á c i d o m á l i c o y se o b s e r v o l o

s i g u i e n t e :

Durante l e f a s e e x p o n e n c i a l de c r e c i m i e n t o l a formación de

á c i d o a c é t i c o e s d e b i l . aunque el medio contenga o nd á c i d o má-

u~..4.r.Al*~~~.~*~.,?,~..,”. /i 9‘’