ZTA PA LA PA INFORME DE SERVICIO STUDIO INMUNOLOGICO DE

(1)

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

1

I

ZTA PA LA PA

INFORME DE SERVICIO

%STUDIO

INMUNOLOGICO

DE

CARDIACOS EN EL INFARTO

SOCIA

L

LOS ANTIGENOS

(2)

r *

bI.. p.

i.+

r

1.-p. I

-1

r-

i

-r-

! _I._{I n t r o d u c c i ó n} L-

A . A n t e c e d e n t e s

...

I B. O b j e t i v o s

...

P

I N D I C E

...

1

...

1 1

C . J u s t i f i c a c i ó n

...

1 2

D. A b r e v i a t u r a s

...

1 3

A . Extracción d e A S C H

...

1 5

B . Fraccionamineto d e l A S C H p o r p r e c i p i t a c i ó n c o n s u 1 fato d e a m o n i o

...

1 7 C . O b t e n c i o n d e m i t o c o n d r i a s

...

2 0

D. E l e c t r o f o r e s i s e n g e l d e acrilamida

. . .

22 E . 1nmun.oelectroforesis

...

24

F . Contrainmunoelectroforesis

...

2 6

11. M a t e r i a l y m é t o d o s

-

. G. M i c r o d o b l e i n m u o o d ~ f u s i Ó n

...

~ 2 8

111. -Resultados

A . O b t e n c i ó n d e l a s f r a c c i o n e s d e l A S C H

...

3 0 B . E l e c t r o f o r e s i s e n riel d e poliacrilamida

. . .

3 2 C . C a r a c t e r i z a c i ó n i n m u n o s e r o l ó a i c a

. . .

3 2

D. A n t i c u e r p o s contra f r a c c i o n e s cardiacas en p a c i e n tes c a r d i o p a t a s

...

3 9 I V . C o n c l u s i o n e s

...

4 7 V . R e s u m é n

...

4 9 V I . Biblioqrafía

...

5 1

(3)

(4)

A . A N T E C E D E N T E S .

La n e c r o s i s de l a f i b r a muscular c a r d i a c a l i b e r a a n t í g e n o s que son c a p a c e s de e s t i m u l a r l a r e s p u e s t a autoinmune ( a u t o a n t i - c u e r p o s ) . S e ha p o s t u l a d o que los a n t i c u e r p o s producidos f a v o r e - cen l a e l i m i n a c i ó n de d e t r i t u s t i s u l a r e s , p r i n c i p a l m e n t e l o s an- t i c u e r p o s no f i j a d o r e s de complemento. S i n embargo, cuando l o s a n t i c u e r p o s f i j a n e l complemento, son c a p a c e s de i n d u c i r o i n - c r e m e n t a r e l daño en l a f i b r a m i o c á r d i c a . Los a n t i c u e r p o s a n t i - c o r a z ó n , s e e l e v a n en e l i n f a r t o a l m i o c a r d i o , en e l síndrome de D r e s s l e r , en l a f i e b r e r e u m á t i c a , en algunas c a r d i p a t í a s congéni

-

t a s , en e l síndrcfme p o s t c a r d i o t o m í a y en algunas m i o c a r d i t i s ( 1 3

24,11,7,12,10,18).

* .

La i n i c i a c i ó n d e l daño en l a s f i b r a s c a r d i á c a s , puede e x p l i - c a r s e por dos mecanismos: I ) l a d e s t r u c c i ó n de l a c é l u l a c a r d i á c a por d i v e r s o s f a c t o r e s i i b e r a a u t o a n t í g e n o s que e s t i m u l a n l a s í n t e

-

s i s de l o s a n t i c u e r p o s , y e s t o s a su vez pueden o n o mediar e l da -

ño s u b s e c u e n t e en e l m i o c a r d i o ; o b i e n , 2 ) puede e x i s t i r una ano-

m a l í a en e l a p a r a t o inmunocompetente p r e v i a a l i n f a r t o que f a v o r s

ce l a producción de los a n t i c u e r p o s c o n t r a e l m i o c a r d i o . A su vez

d i c h a m o d i f i c a c i ó n p o d r í a f a c i l i t a r e l d e s a r r o l l o de u n i n f a r t o

(5)

n

L

L a p r e s e n c i a de a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n f u e demostrada por e l p e r f i l inmunoserológico de 37 p a c i e n t e s con i n f a r t o agudo d e l m i o t a r d i o , a s í como su e v o l u c i ó n de 90 d í a s ( 1 8 ) . Con l a prueba

de hemaglutinación p a s i v a s e v a l o r a r o n l o s a n t i c u e r p o s c o n t r a l o s antígenos s o l u b l e s d e l corazón, l o s c u a l e s s e ñ a l a n l a l i b e r a c i ó n de componentes s o l u b l e s de l a f i b r a c a r d í a c a a l e s p a c i o e x t r a c e l g l a r . E s t o s son capaces de i n d u c i r l a producción de a n t i c u e r p o s y en l a s e r i e de enfermos agudos a p a r e c i o en e l 85.7%. E s t e h a l l a z - go s u g i e r e que l o s fenómenos de n e c r o s i s t i s u l a r s e i n i c i a n dos o más semanas p r e v i a s a l cuadro c l í n i c o d e l i n f a r t o y durante l a s t r e s o más semanas de e v o l u c i ó n l o s v a l o r e s promedio de l a r e c í

-

proca de l o s t í t u l o s de a u t o a n t i c u e r p o s fueron de 28 a 42. L o s su

-

j e t o s normales no p r e s e n t a n a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n determinados por h c n a g l u t i n a c i ó n p a s i v a . E l hecho de que 14.3% de l o s p a c i e n -

-

t e s no presentasen a u t o a n t i c u e r p o s puede deberse a que en e s t o s i n d i v i d u o s no s e s i n t e t i z a r o n , o b i e n , que l a n e c r o s i s f u é mínima

y, p o r l o t a n t o , i n s u f i c i e n t e l a c a n t i d a d de autoantígenos l i b e r a dos p a r a e s t i m u l a r a l sistema inmune. También puede deberse a que no s e d e t e c t a r o n l o s a u t o a n t i c u e r p o s con l a t é c n i c a empleada ( 1 8 ) . Es p o s i b l e que e x i s t a una r e l a c i ó n e n t r e e l grado de n e c r o s i s y l a e l e v a c i ó n de l o s a u t o a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n ( 1 8 ) .

L a hemaglutinación p a s i v a no p e r m i t e e s t a b l e c e r si l o s a n t i -

(6)

3

t a r e l p r o c e s o i n f l a m a t o r i o y n e c r ó t i c o e n e l m i o c a r d i o ( 7 ) . E l

37% d e l o s c a s o s d e s a r r o l l a r o n a n t i c u e r p o s f i j a d o r e s d e l c o m p l e -

m e n t o , p r i n c i p a l m e n t e c o n t r a l o s a n t í g e n o s i n s o l u b l e s d e c o r a z ó n y

e n e l 9.6% c o n t r a l o s a n t í g e n o s s o l u b l e s . E l título d e l o s a n t i - c u e r p o s a n t i c o r a z ó n , p o r c o n s u m o d e l c o m p l e n e n t o c o n t r a l o s a n t í g e -

n o s s o l u b l e s c o m o l o s i n s o l u b l e s e s t u v i e r o n p r e s e n t e s d u r a n t e l o s

90 d í a s d e e s t u d i o . En s u j e t o s n o r m a l e s no s e d e t e c t a r o n a n t i c u e r -

p o s a n t i c o r a z ó n f i j a d o r e s d e l c o m p l e m e n t o , n i e n e l 63% d e l o s c a -

s o s c o n i n f a r t o . E s t e h a l l a z g o s u g i e r e que n o se p r o d u j o e x t e n s i ó n

d e l a n e c r o s i s , a d i f e r e n c i a de a q u e l l o s que p r e s e n t a r o n d i c h o s a n -

t i c u e r p o s f i j a d o r e s d e l c o m p l e m e n t o y en l o s que p o s i b l e m e n t e se

p r o d u j o un a u m e n t o d e l d a ñ o (13,24,7,10,15).

Existen v a r i a c i o n e s e n l a f r e c u e n c i a d e p o s i t i v i d a d d e l o s

a n t i c u e r p á s a n t i c o r a z ó n según l a f u e n t e d e l o s a n t í g e n o s c a r d í a c o s ,

v.gr: m i o c a r d i o d e r a t ó n , d e r a t a y h u m a n o . T a m b i é n se p u e d e n e n

-

c o n t r a r d i f e r e n c i a s d e b i d a s a l m é t o d o e m p l e a d o p a r a d e t e c t a r l o s

a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n , c o m o l a h e m a g l u t i n a c i ó n p a s i v a , l a i n m u n o -

f l u o r e s c e n c i a , el c o n s u m o de a n t i g a m m a g l o b u l i n a y e l c o n s u m o d e l c o m p l e m e n t o ( 1 8 ) .

L a u f e r y F r i e d m a n ( 1 3 ) en s u s e x p e r i m e n t o s c o n c é l u l a s c a r d í g

cas 'observaron q u e a l a g r e g a r a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n no se m o d i f i -

co e l l a t i d o d e l a s c é l u l a s n i t a m p o c o se e n c o n t r a r o n a l t e r a c i o -

nes d e l a s c é l u l a s a l m i c r o s c o p i o e l e c t r ó n i c o , s i n e m b a r g o , a l

a ñ a d i r c o m p l e m e n t o h e m o l í t i c o a l a s c é l u l a s c a r d í a c a s c o n a n t i c u e r

(7)

4

p o s a n t i c o r a z ó n l a s c é l u l a s d e j a r o n d e l a t i r , y con e l m i c r o s c o p i o

o b s e r v a r o n d e s t r u c c i ó n d e l s a r c o l e m a , edema y v a c u o l a s en l a s m i t o -

c o n d r i a s .

A l a n a l i z a r e l n i v e l s é r i c o d e l complemento en l o s i n d i v i

-

d u o s c o n i n f a r t o d e l , m i o c a r d i o , s e e n c o n t r a r o n v a l o r e s s u b n o r m a l e s

en e l 7 7 % de l o s c a s o s . E s t e n i v e l s u b n o r m a l d e l c o m p l e m e n t o p u e -

d e d e b e r s e : 1 ) a l p r o c e s o a u t o i n m u n e humoral con a n t i c u e r p o s f i j a -

d o r e s d e l c o m p l e m e n t o ( 1 5 ) , o b i e n , 2 ) a l a l i b e r a c i ó n d e m i t o c o n - d r i a s que s e e n c u e n t r a n en l a f i b r a m u s c u l a r c a r d í a c a y q u e s o n c a -

*

p a c e s d e a c t i v a r a l c o m p l e m e n t o ( 1 8 ) . Ambos p o s t u l a d o s s u g i e r e n

que l a n e c r o s i s d e l m i o c a r d i o puede s e r m a n t e n i d a o i n c r e m e n t a d a

p o r l o s f e n f i e n o s inmunes r e l a c i o n a d o s con e l s i s t e m a d e l complemen -

t o ( 1 5 ) . S i n e m b a r g o , s e r e q u i e r e n e s t u d i o s c u a n t i t a t i v o s d e l o s

c o m p o n e n t e s d e l c o m p l e m e n t o h e m o l í t i c o p a r a e s t a b l e c e r s i e l meca-

nismo d e d a ñ o e s p o r l a a c t i v a c i ó n d e l a v í a c l á s i c a o p o r l a v í a

a l t e r n a d e l c o m p l e m e n t o ( 1 8 , 1 6 , 1 5 ) .

La p r o t e í n a - C - r e a c t í v a s e ñ a l a l a p r e s e n c i a d e u n p r o c e s o i n -

f l a m a t o r i o con n e c r o s i s como o c u r r e en e l i n f a r t o a g u d o d e l m i o c a r

d i o ( 1 8 ) . E n o t r o s c a s o s f u é p o s i t i v a en e l 7 2 . 9 % y 8 6 . 9 % d e l a

p r i m e r a a l a s e g u n d a semana r e s p e c t i v a m e n t e , y d e s p u é s d e s c e n d i o

en l a t e r c e r a semana a l 5 7 . 1 % de p o s i t i v i d a d ( 1 8 ) . E s t o s h a l l a z g o s

a p o y a n l a e x i s t e n c i a y l a e v o l u c i ó n d e l p r o c e s o i n f l a m a t o r i o y n e -

c r ó t i c o d e l p a d e c i m i e n t o c a r d í a c o . E n b a s e a l o s h a l l a z g o s s e ñ a l a -

d o s s e c o n s i d e r a c o n v e n i e n t e r e a l i z a r u n e s t u d i o i n m u n o l ó g i c o en

(8)

5

l o s pacientes c o n infarto s u b e n d o c á r d i c o , c o n infarto "silencioso"

en

c a s o s d e extensión del infarto, en aquellos c o n a n g o r inestable

o s í n d r o m e intermedio, c o n a n g o r estable, y también en casos d e in -

suficiencia c o r o n a r i a e l e c t r o c a r d i o g r á f i c a , pero s i n cuadro c l í n i -

c o d e angor. Es f a c t i b l e q u e los pacientes c o n s í n d r o m e d e a n g o r

inestable y c o n tenedencia a e v o l u c i o n a r hacia el infarto presen-

ten anticuerpos f i j a d o r e s d e c o m p l e m e n t o , c o m p l e m e n t o hemolítico

s é r i c o d i s m i n u í d o y presencia d e autoanticuerpos anticorazón por

hemaglutinación pasiva. P o r o t r o l a d o e s posible q u e no existan m o -

d i f i c a c i o n e s s e r o l ó g i c a s en a q u e l l o s casos cuya evolución sea h a

-

c i a la estabilización s i n necrosis. S u r g e entonces la posibilidad

d e q u e el primer g r u p o d e pacientes las pruebas serológicas apoyen

la realización del e s t u d i o coronariográfico para d e c i d i r la indica -

c i ó n quirúrgica y/o t r a t a m i e n t o médico intensivo (13,24,11,7,5,12,

10,15). .

El d i a g n ó s t i c o d u r a n t e los primeros cinco d í a s del infarto

s u b e n d o c á r d i c o s e e s t a b l e c e por el c u a d r o c l í n i c o , la elevación en -

z i m á t i c a y el e s t u d i o electrocardiográfico. En estas c i r c u n s t a n c i a s

t a m b i é n los a n t i c u e r p o s anticorazón s e encuentran elevados. S i n em-

bargo, d e s p u é s d e l o s primeros c i n c o d í a s en q u e las enzimas vuelven

a sus niveles n o r m a l e s , los estudios inmunoserológicos pueden rati-

f i c a r o r e c t i f i c a r

el

d i a g n ó s t i c o considerado por la impresión c l í -

n i c o - e l e c t r o c a r d i o g r á f i c a .

(9)

6

m a g l u t f n a c i ó n pasiva en l o s primeros c i n c o d í a s del c u a d r o c l í n i c o

del infarto a g u d o del m i o c a r d i o indican g e n e r a l m e n t e , q u e el d a ñ o

al m i o c a r d i o o c u r r i o e n t r e d o s semanas y t r e s meses previos al c u a

-

d r o c l í n i c o d e infarto. A d e m á s los a n t i c u e r p o s f i j a d o r e s del c o m p l e -

m e n t o , a s í c o m o la d i s m i n u c i ó n del c o m p l e m e n t o hemolítico, s e ñ a l a n

l a existencia del p r o c e s o inflamatorio-necrótico. Este c o n o c i m i e n t o

e s i g u a l m e n t e útil

en

el d i a g n ó s t i c o del infarto "silencioso".

La m u e r t e súbita e s en la actualidad uno d e l o s problemas m á s

s e r i o s por r e s o l v e r d e n t r o d e la C a r d i o l o g í a y un importante porcen -

t a j e d e e s t o s pacientes c o n c u a d r o d e insuficiencia c o r o n a r i a , típi -

co y atípico, acuden a su m é d i c o d í a s o s e m a n a s a n t e s d e su falleci -

m i e n t o súbito. La d e t e r m i n a c i ó n d e a u t o a n t i c u e r p o s por hemaglutina-

c i ó n pasiva, f i j a d o r e s del c o m p l e m e n t o y c o m p l e m e n t o h e m o l í t i c o a s í

c o m o l a p r o t e í n a - C - r e a c t i v a , permitiría S o s p e c h a r la existencia d e

d a ñ o m i o c á r d i c o y p o r l o t a n t o s e requeriría d e una estrecha vigi

-

l a n c i a para u n a posible prevensión d e la m u e r t e q u e o b e d e c e princi-

palmente al t r a n s t o r n o e l é c t r i c o c o n c o m i t a n t e (13,7,10,18).

En l o s pacientes con anticuerpos anticorazón d e m o s t r a d o s por

hemaglutinación pasiva, pero s i n a n t i c u e r p o s f i j a d o r e s del compley

m e n t o , se c o n s i d e r a l a posibilidad d e q u e e s t o s anticuerpos s e a n

" p r o t e c t o r e s ' , d a d o que bloquean la activación del c o m p l e m e n t o y

a d e m á s evitarían la unión d e l o s linfocitos s e n s i b i l i z a d o s q u e s o n

c a p a c e s d e l i b e r a r linfotoxinas e n el m i o c a r d i o ( 2 4 , 1 7 , 1 2 ) . S e s e ñ a -

(10)

7

en l a patogénia de l a s enfermedades c a r d i o v a s c u l a r e s , e s t á n aún en c o n t r o v e r s i a , ya que l o s a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n pueden s e r c i t o t ó -

x i c o s ( 1 3 , 1 1 , 1 7 ) Ó no c i t o t ó x i c o s ( 2 4 , 7 ) .

E l i n f a r t o experimental en p e r r o s c u r s a con l a producción de a u t o a n t i c u e r p o s c o n t r a corazón f i j a d o r e s d e l complemento. Su e v o l u - c i ó n s e m o d i f i c o con l a a d m i n i s t r a c i ó n de e s t e r o i d e s , que i n h i b e n e l proceso i n f l a m a t o r i o y l a r e s p u e s t a inmune ( 1 8 ) . Extrapolando es -

t o s h a l l a z g o s con e 1 i n f a r t o d e l miocardio humano, puede proponerse l a a d m i n i s t r a c i ó n de e s t e r o i d e s con l a p o s i b i l i d a d de que s e dismi- nuya e l proceso inmune y l a n e c r o s i s en e l t e j i d o c a r d í a c o , p r i n c i - palmente en a q u e l l o s casos con a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n a c t i v a d o r e s d e l complemento h e m o l í t i c o y con v a l o r e s subnormales d e l complemen- t o h e m o l í t i c o s é r i c o . Además en base a e s t o s datos s e p o d r í a n admi- n i s t r a r e s t e r o i d e s an algunos casos de "angor e s t a b l e " o " i n e s t a

-

b l e " , que presenten l a respuesta inmune señalada. Igualmente e s t a s pruebas p o d r í a n e s t a b l e c e r s e como un í n d i c e para e s t a b l e c e r e l i n i - c i o o l a suspensión d e l t r a t a m i e n t o e s t e r o i d e o , y observar l a e v o l u -

c i o n de l a s l e s i o n e s . Otros compuestos a n t i i n f l a m a t o r i o s como e l á -

c i d o a c e t i l s a l i c í l i c o pueden t e n e r e f e c t o b e n e f i c 0 en e l i n f a r t o d e l miocardio.

(11)

a

infarto del m i o c a r d i o ( 1 8 ) .

La presencia d e anticuerpos antinucleares en s u j e t o s m e n o r e s

d e 5 5 años o con títulos elevados después d e los 55 a ñ o s ( 7 ) , plan-

tean l a s siguientes posibilidades: 1 ) q u e la destrucción del miocar -

d i o por el infarto f u e importante y 2) la posible asociación c o n i n -

f a r t o pulmonar o d e otros organos (v.gr; el hígado).

En el l u p u s e r i t e m a t o s o e x i s t e un componente genético r e l a c i o

nado c o n la r e s p u e s t a a u t o i n m u n e h u m o r a l , s i e n d o el m á s r e l e v a n t e ,

la elaboración d e anticuerpos antinucleares. En ellos l a s alteracio -

ne e l e c t r o c a r d i o g r á f i c a s podrían d e b e r s e a los c o m p l e j o s a u t o i n m u

-

nes q u e s e depositan principalmente en el e n d o t e l i o d e l a s arterio-

l a s del m i o c a r d i o (9).

En el 8% d e los c a s o s s e e n c o n t r ó relación e n t r e los a n t i c u e r

pos a n t i n u c l e a r e s y la d i s m i n u c i ó n del complemen o hemolítico, s u g L

r i e n d o mabor d a ñ o en el m i o c a r d i o , por l o q u e en estos c a s o s d.eben

a c e n t u a r s e l o s c u i d a d o s y ser c a u t e l o s o s en el pronóstico. L o s tras -

tornos del ritmo y d e

la

c o n d u c c i ó n en los infartos del m i o c a r d i o pueden s e r a t r i b u i d o s a l e s i o n e s autoinmunes ( 1 2 ) . Experimentalmen-

t e

al

a i s l a r s e l a s f i b r a s d e P u r k i n j e , e s posible desencadenar t r a s tornos e l e c t r o f i s i o l ó g i c o s t r a n s i t o r i o s q u e pueden e x p l i c a r l a s al-

t e r a c i o n e s d e la c o n d u c c i ó n (21).

El f a c t o r r e u m a t o i d e , a n t i c u e r p o c o n t r a inmunoglobulinas, d e -

terminado por la prueba d e latex y la d e W a l l e r - R o s e ( 9 ) r e s u l t ó p o

(12)

9

sitividad del f a c t o r reumatoide indica q u e la presencia d e l o s a u -

t o a n t i c u e r p o s contra los a n t í g e n o s c a r d í a c o s parece no d e b e r s e a

una anomalía general e n el a p a r a t o inmunocompetente, s i n o a

u n

f e - nómeno dirigido c o n t r a el t e j i d o cardíaco. Además s e apoya e s t a a -

severación en la baja f r e c u e n c i a y en los títulos m e n o r e s d e 1 : 4

d e los anticuerpos a n t i n u c l e a r e s .(18).

Para conocer la respuesta i n m u n e general d e los individuos con

infarto del m i o c a r d i o s e determinaron las e u g l o b u l i n a s , gammaglobu -

l i n a s y AEL-O. Las e u g l o b u l i n a s q u e s e c o r r e l a c i o n a n con la IgM

( I S ) s e encontraron e l e v a d a s en el 33.8% y el resto presentaron n i -

veles normales. Las g a m m a g l o b u l i n a s s e elevaron en el 65.6%, indi--

c a n d o una respuesta inmune secundaria iniciada probablemente, d o s

o m á s s e m a n a s a n t e s del c u a d r o c l í n i c o del infarto del miocardio.

Es c o n v e n i e n t e s e ñ a l a r q u e la elevación d e las euglobulinas y ga-

-

m m a g l o b u l i n a s incrementan la viscosidad d e la s a n g r e y en vis,ta d e

q u e l o s s i s t e m a s d e c o m p l e m e n t o hemolítico, d e l a

la f i b r i n o l i s i s y de l a s bradiquininas tienen vías

c o m u n e s e s posible q u e en el proceso a u t o i n m u n e s e

f e n ó m e n o s d e trombosis intravascular en.el miocard

oagul ación

de regulac

f a v o r e c e n

0 (9).

d e

ó n

o s

La respuesta i n m u n e c o n t r a l o s a g e n t e s externos en s u j e t o s c o n

infarto del m i o c a r d i o , s e e s t a b l e c i ó en la prueba d e AEL-O. S o l o

en el 9 . 1 % s e o b s e r v ó la elevación por arriba d e 320 U . Tood q u e

e s el nivel normal para la población en general.

(13)

1 0

nados c o n el c o r a z ó n (factor r e u m a t o i d e y a n t i c u e r p o s a n t i n u c l e a -

res) a s í c o m o c o n t r a a n t í g e n o s externos AEL-O) sugieren q u e e l

a u m e n t o d e l a s e u g l o b u l i n a s y gammaglobul nas en los pacientes c o n

infarto del miocardio. s e d e b e n f u n d a m e n t a l m e n t e a l o s a n t i c u e r p o s

c o n t r a

el

corazón.

Sería c o n v e n i e n t e e s t a b l e c e r la c l a s e d e inmunoglobulinas (ISM

o IgG) a u t o a n t i c u e r p o c o n t r a a n t í g e n o s c a r d í a c o s , y a q u e su d e t e r -

m i n a c i ó n permitiría c o n o c e r c o n m a y o r presición la existencia d e

un primer infarto por l o s a n t i c u e r p o s anticorazón d e la c l a s e I S M ,

o bién d e su r e p e t i c i ó n d e l o s a n t i c u e r p o s anticorazón de la c l a -

se IgG ( 9 ) .

La formación d e los a n t i c u e r p o s anticorazón puede o c u r r i r en

o t r a s e n t i d a d e s c l í n i c a s , por

lo

cual s e propone r e a l i z a r ’ e l a n á l i

sis d e s u e r o s d e s u j e t o s con procesos patológicos pulmonares y he- ‘páticos para e s t a b l e c e r c o n e l l o s la especificidad d e la relación

(14)

1 1

B.

.-

Con el f

m á s r e l e v a n t e s

.-.

proponen l o s s

. _

r .

.-.

L

c-

.

-.

OBJETIVOS.

n d e e s t a b l e c e r c u á

en los f e n ó m e n o s d e

g u i e n t e s o b j e t i v o s ;

o c u a l e s son l o s a u t o a n t í g e n o s

autoinmunidad c a r d i o v a s c u l a r s e

1 ) Separa; por f r a c c i o n a m i e n t o c o n s u l f a t o d e a m o n i o los an

-

t í g e n o s s o l u b l e s d e c o r a z ó n humano.

2 ) P r o b a r por las técnicas d e m i c r o i n m u n o d i f u s i ó n , contrain -

munoelectroforesis e inmunoelectroforesis los a n t í g e n o s f r a c c i o n a -

d o s contra los a n t i c u e r p o s a n t i c o r a z ó n o b t e n i d o s experimentalmente.

3 ) Una vez c a r a c t e r i z a d o s los a n t í g e n o s c a r d í a c o s s e e n f r e n -

tan contra s u e r o s humanos d e s u j e t o s d o n a d o r e s d e s a n g r e , pacientes

c o n infarto del m i o c a r d i o , f i e b r e reumática y o t r a s cardiopatías.

(15)

._-

,. I

-

I.

1 2

C. J U S T I F I C A C I O N D E L P R O Y E C T O .

Dada

la

f r e c u e n c i a d e las d i v e r s a s c a r d i o p a t í a s c o m o c a u s a d e muerte en n u e s t r o p a í s , s e r e q u i e r e e n f o c a r el problema d e s d e d i v e r

-

c o s á n g u l o s , c o n s i d e r a n d o q u e pudiera e x i s t i r una participación del

s i s t e m a i n m u n e en -la protección o d a ñ o c a r d í a c o , los e s t u d i o s r e a l i z a

d o s en la inmunocardiología r e s u l t a n d e gran importancia para enten-

(16)

A I C H

A S C H

C I E F

FM C

FMP

I

E F

RlA

M I R

S,DS

S H

SN _.

SS6

SSTE

TEMED

. .

1 3

O . A B R E V I A T U R A S .

A n t í g e n o i n s o l u b l e d e c o r a z ó n h u m a n o .

A n t í g e n o s o l u b l e d e c o r a z ó n h u m a n o .

C o n t r a i n m u n o e l e c t r o f o r e s i s .

F r a c c i ó n m i t o c o n d r i a l c r u d a .

F r a c c i ó n m i t o c o n d r i a l p u r a .

i n m u n o e l e c t r o f o r e s i s .

M i l i - a m p e r i o s .

M , i c r o i n m u n o d i f u s i Ó n .

D o d e c i l - s u l f a t o d e sodi,o.

S u e r o h u m a n o .

Q r b r e n a d a n t e .

Solución s a l i n a d e b a r a t o s ( s o l . u c i 6 n r e g u l a d o r a ) .

%olw.c1:bn d e s a c a r o s a - t r i s (solution, r e g u l a d o r a ) .

(17)

II. Material

y

metodos

C-.

(18)

15

A . EXTRACCION D E A N T I G E N O S T O T A L E S D E CORAZON HUMANO.

En el f r a c c i o n a m i e n t o del c o r a z ó n humano s e obtuvieron d o s

partes distintas: Antígenos insolubles d e c o r a z ó n humano (AICH) y

Antígenos solubles de c o r a z ó n humano (ASCH).

S o l u c i o n e s empleadas:

a) Soluci6n S a l i n a Borato (SSB) pH 8.4:

Solución reguladora d e boratos:

Acido bórico

T e t r a b o r a t o d e s o d i o

Cloruro d e s o d i o

se a f o r ó a un litro

con

agua destilada.

L a solución d e trabajo f u é la SSB pH 8 . 4 :

6.18 g

9.35 g

4.38 g

5 partes d e s o l u -

c i d n reguladora d e boratos y 95 partes d e solución salina 0.85% (3)-

PROCEDIMIENTO.

1. Una v e z q u e s e o b t u v o el c o r a z ó n humano s e p r o c e d i ó a e l i -

m i n a r l o s grandes v a s o s , válvulas cardiacas y tejido graso.

2. El m i o c a r d i o s e f r a g m e n t ó en porciones d e 0.5 c c a p r o x i m a -

damente.

3 . S e l a v ó varias L 6’s c o n solución SSB pH 8.4 hasta q u e el

l í q u i d o s o b r e n a d a n t e f u é claro.

4. S e d e c a n t ó el e x c e s o d e S S B pH 8.4 y s e pesó el miocardio.

(19)

1 6

5. Se hornogeneizó en l i c u a d o r a d u r a n t e 5 minutos a l 50% en

SSB pH _8.4.

6 . E l hornogeneizado s e c e n t r i f u g ó a 10 O 0 0 rpm d u r a n t e 3 0 m i n

a 4°C.

7 . A l f i n a l i z a r s e obtuvo l a f r a c c i ó n de a n t í g e n o s s o l u b l e s

( s o b r e n a d a n t e ) y l a f r a c c i ó n de a n t í g e n o s i n s o l u b l e s ( p r e c i p i t a d o ) .

8. Los a n t í g e n o s s o l u b l e s de corazón humano (ASCH) s e guarda- I 4

ron en a l í c u o t a s y s e c o n g e l a r o n a -20°C.

9 . E l p r e c i p i t a d o s e l a v ó en SSB pH 8.4 y s e c e n t r i f u g ó a

10 O 0 0 rpm d u r a n t e 30 minutos. E s t a o p e r a c i ó n s e r e p i t i ó 3 v e c e s .

10. S e r e s u s p e n d i ó e l A I C H en SSB pH 8.4 volumen a volumen. Se guardó en a l í c u o t a s y s e c o n g e l ó a -20°C ( 2 ) .

I

(20)

1 7

c

-

*- CUADRO

I.

OBTENCION D E ANTIGENOS D E C O R A Z O N HUMANO.

S e c c i ó n d e l c o r a z ó n e n f r a g m e n t o s d e 5 c c .

I

L a v a d o c o n SSB p H 8.4 p o r d e c a n t a c i ó n hasta q u e el l í q u i d o s o b r e n a d a n t e f u é c l a r o .

H o m o g e n e i z a c i ó n d e l c o r a z ó n a l 5 0 % e n SSB p H 8.4 C e n t r i f u g a c i ó n a 1 0 O00

I

r p m , 3 0 m i n u t o s a 4°C.

S o b r e n a d a n t e P r e c i P i t a d o A n t í g e n o s s o l u b l e s d e L a v a d o c o n S S B pH 8.4 c o r a z ó n humano ( A S C H ) . 3 veces, 1 0 O00 r p m , D e t e r m i n a c i ó n d e

p r o t e í n a . A n t í g e n o s i n s o l u b l e s

S a n g r a d o d e c o n e j o s . ( A I C H ) .

I n m u n i za c i ó n

.

S a n g r a d o p o s t i n m u n i -

1 I

3 0 m i n . a 4°C.

I

d e c o r a z ó n humano

(21)

18

B . FRACCIONAMIENTO DE LOS ANTIGENOS SOLUBLES D E CORAZON HUMANO POR PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO . ,.

1. S e disolv?Ó s u l f a t o de amonio en nos s o l u b l e s de corazón humano a l 10% ( p e s o / v o

1.a so

m e n )

ución de a n t ge-

!

2. Se a g i t ó por 10 minutos a temperatura ambiente (20'C). j 3. S e c e n t r i f u g ó a 6 O 0 0 rpm durante 1 5 minutos a 20°C.

4. E l p r e c i p i t a d o s e r e s u s p e n d i ó con 5 ml de SSB pH 8 . 4 y

se c o n s i d e r ó como l a f r a c c i ó n I de p r o t e í n a s p r e c i p i t a d a s a l _10%d e

s u l f a t o de amonio.

5 . A l s o b r e n a d a n t e s e l e añadio s u l f a t o de amonio para 1 1 % v a r l o a l 20% en l a s o l u c i ó n de ASCH (peso/volumen).

6 . Se r e p i t e n l o s pasos a n t e r i o r e s aumentando cada vez 10% de s u l f a t o de amonio (peso/volumen) a l s o b r e n a d a n t e h a s t a o b t e n e r una f r a c c i ó n VI1 p r e c i p i t a d a con una s a t u r a c i ó n de 7 0 % de s u l f a t o de amo n i o y u n s o b r e n a d a n t é f i n a l (SN).

7 . Las f r a c c i o n e s ( I a V i i ) y e l

se d i a l i z a r o n c o n t r a SSB pH 8 . 4 h a s t a que g a t i v a con u n a s o l u c i ó n de c l o r u r o de b a r i o c l o r h í d r i c o O. 5N.

8. Se l e s agregfi a z i d a de s o d i o

sobrenadante f i n a l ( S N ) é s t a d i 6 una r e a c c i ó n ne-

(BaC12) a l 10% en dcido

1 mg/mi) a l a s f r a c c i o n e s d e l ASCH p r e c i p i t a d a s con s u l f a t o de aminio y se c o n s e r v a r o n a 4°C.

(22)

1 9

CUADRO 11. FRACCIONAMIENTO DE LOS ANTIGENOS SOLUBLES

DE CORAZON HUMANO POR PRECIPITACION CON SULFATO DE AMONIO.

Antigenos s o l u b l e s de corazón humano,mezcla

Agragar IO% _{de s u l f a t o de amonio peso/volumen}

I

1

A g i t a r

La

minutos a temperatura ambiente

C e n t r i f u g a r a 6 000 rpm p o r 15 min. a 20°C. I

r

Sobrenadante t 10% s u l f a t o Botón resuspender con

I

de antonio peso/vo?urnen. SSB pt! 8.4

A g z t a r 19 _min.

I

a _temp. a m - D i a l i z a r c o n t r a S S B pH 8.4

b i e n t e .

C e n t r i f u g a r a 6 Q Q O rpm,

p o r 15 m i n . a 20'C.

I

F r a c c i ó n I (proteína's p r e - c i p i t a d a s a l 10% de s u l f a t o -

de amonio).

I

. Sobrenadante + 10% s u l f a t o

(peso/votumen)

Sobrenadante f i n a l [SN)

I

Botón

.

F r a c c i ó n V I 1 t e í n a s p r e c i p i t a d a s

de s a t u r a c i ó n de s u 1

( p r o - a t o 1 7 0 %

. ,

(23)

20

C . OBTENCION DE MITOCONDRIAS Y S U E R O S ANTI-MITOCONDRIAS.

L a s mitocondrias y l o s s u e r o s anti-mitocondrias d e c o r a z ó n

fueron proporcionados por l a Biol. G u i l l e r m i n a García R. (6).

Se o b t u v i e r o n m i t o c o n d r i a s d e corazón humano por homogeneiza -

cion del t e j i d o c o n a r e n a purificada y s o l u c i ó n reguladora d e s a c a -

rosa 0.25 M , tris 4.9 mM pH 7.4 (SSTE) y centrifugación diferencial

A e s t a s m i t o c o n d r i a s s e le d e n o m i n ó "fracción mitocondrial c r u d a "

(FMC)

.

En s e g u i d a s e purificó la f r a c c i ó n mitocondrial cruda por

centrifugación en g r a d i e n t e d i s c o n t i n u o d e sacarosa para o b t e n e r

así la "fracción mitocondrial pura" ( F R P ) .

La f r a c c i ó n d e g a m m a g l o b u l i n a s a n t i m i t o c o n d r i a s f u e o b t e n i d a

por i n m u n i z a c i o n e s en c o n e j o s Nueva Zelanda ( D r y c t a q u s cuniculus) -

!

(24)

21

C U A D R O

I I I .

PROCEDIMIENTO

P A R A L A

O B T E N C I O N DE MITOCONDRIAS.

C o r a z ó n , a 4°C.

Elimi,naciÓn del t e j i d o c o n j i n t i v o , g r a n d e s vasos y válvulas.

I

C o r t e en t r o z o s d e aproximadamente.3 cc.

I

Homogeneización c o n a r e n a y m o r t e r o a 4°C.

I

Resuspención en S S T E pH 7.4.

I

Centrifugación a 2 500 r p m , 1 0 min a 4°C.

I

Botón s e elimina

- 1

S o b r e n a d a n t e pH 7.4.

/

I

Centrifugación 9 O00 r p m , i O m i n a 4°C. I

Botón

Centr

Botón

Centr

I

se resuspende en SSTE,pH 7.4

f u g a c i ó n 9 0 0 0 rpm,lO min a 4°C.

se resuspende en SSTE (FMC).

f u g a c i ó n en g r a d i e n t e d i s c o n t i n u o

Sobrenadant! s e elimina

I

S o b r e n a d a n t e se elimina

I

(25)

22

D. ELECTROFORESIS EN GEL D E POLIACRILAMIDA.

1. Preparación d e l o s geles ( 2 2 ) :

Fosfato d e s o d i o 0.2 M c o n dodecil-sulfato d e s o d i o (SDS)

al 0.2%. . 12.5 ml

Acrilamida al 40% 4.69 ml

Bisacrilamida al 2% 2.54 ml

Tetrametiletilarnonio (TEMED) 0.03 ml

se a g r e g a r o n l o s reactivos en f o r m a s u c e s i v a y c o n agitación c o n s t a n

te e inmediatamente s e llenaron los tubos d e vidrio (7.5 x 0.5 cm.)

c o n pipeta P a s t e u r , l u e g o s e c u b r i e r o n con agua destilada para f a v o -

r e c e r la polimerización y s e d e j a r o n a 2OoC hasta el momento d e uti-

l i z a r l o s

.

2. Procesamiento d e l a s muestras:

S o l u c i ó n

A.

Fosfato d e s o d i o 0.1 M pH 7.0 10.0 ml

D o d e c i l - s u l f a t o d e s o d i o (SDS) 1.0 !l

Beta-mercaptoetanol 1.0

ml

S o l u c i ó n B.

F o s f a t o d e s o d i o 0.2 M-SOS 0.2% 5.0 ml

Beta-mercaptoetanol . 0.5 ml

Azul d e bromofenol 5.0 ml

Glicerina 5.0 ml

(26)

s e l e s a g r e g ó 10 u 1

m i n u t o s , d e s p u é s s e

se d e j a r o n a 4°C P O

23

de l a s o l u c i ó n A y s e i n c u b a r o n a 56°C p o r 1 5

e s a ñ a d i ó 70 u1 d e l a s o l u c i ó n B , s e a g i t a r o n y 48 h o r a s .

3. E l e c t r o f o r e s i s .

Se e x t r a j o e l a g u a d e l a s u p e r f i c i e d e l o s g e l e s d e a c r i l a m i -

d a , s e a g r e g a r o n 1 0 0 u1 d e l a m u e s t r a t r a t a d a s o b r e e l e x t r e m o s u p e -

r i o r d e l g e l . Se r e a l i z ó l a e l e c t r o f o r e s i s en una c á m a r a u t i l i z a n d o

.

una s o l u c i ó n r e g u l a d o r a d e f o s f a t o d e s o d i o 0 . 1 M pH 7 . 0 , s e a p l i c a -

!

i

r o n 4 m A p o r c a d a t u b o h a s t a q u e l a m u e s t r a p e n e t r o a l g e l , p o s t e

-

r i o r m e n t e s e a u m e n t o a 8 mA p o r t u b o .

A l f i n a l i z a r l a e l e c t r o f o r e s i s s e e x t r a j o e l g e l , s e m i d i ó e l

f r e n t e d e l c o l o r a n t e , s e c o l o c a r o n en u n a s o l u c i ó n f i j a d o r a d u r a n t e

48 h o r a s

S o l u c i ó n f i j a d o r a :

. A c i d o t r i c l o r o a c é t i c o 5 7 . 0 g

A c i d o s u l f o s a l i c í l i c o 1 7 . 0 g

Me t a n o l 1 5 0 . 0 m l

Agua d e s t i l a d a 3 5 0 . 0 ml

Se p r o c e d i ó a t e ñ i r con a z u l b r i l l a n t e d e Coomasie d u r a n t e

90 m i n u t o s y s e c o n t r a s t a r o n l a s b a n d a s c o n s o l u c i ó n d e c o l o r a n t e .

S o l u c i ó n d e c o l o r a n t e :

Metano1 5 0 . 0 m l

A c i d o a c é t i c o 7 5 . 0 ml

(27)

2 4

E.

INMUNOELECTROFORESIS.

S e r e a l i z ó d e a c u e r d o al m é t o d o d e Grabar y Williams ( 8 ) c o n

l i g e r a s modificaciones.

1 . Solución reguladora d e Tris-barbital p H 8.6:

Trisma base

Acido barbitúrico

Barbiturato d e s o d i o

Azida d e s o d i o

Agua desionizada

2. P l a c a s d e agarosa al 0.85%

Agarosa

Solución reguladora d e t r i s -

. barbital 0.02M, pH 8 . 6

Azída d e s o d i o

11.56

4.93

18.5

2 . 0

2.0

0.85

50.0

o.

1

ml

.

9

Agua destilada 50.0 ml

S e c o l o c a r o n 3 ml d e agarosa f u n d i d a por cada portaobjetos y

se d e j ó g e l i f i c a r a 2O"C, s e guardaron en.cámara húmeda a 4°C d u r a n -

te 24 horas.

La e l e c t r o f o r e s

ción amortiguadora d e

a n t i g e n 0 en los p o z o s

ca s e utilizó azul d e

s se real t r i s- bar b

c o m o ind

bromof eno

z ó en una cámara c o n t e n i e n d o s o

tal pH 8.6. S e depositaron 3 0 u

c a d o r d e l a movilidad e l e c t r o f o

u -

de.

éti-

(28)

25

c u a l se d e j o m i g r a r 1.5 cm h a c i a e l ánodo; por tach p o r t a o b j e t o s s e

a p l i c a r o n 2.5 mA.

* Posteriormente s e c o r t a r o n c a n a l e s de 2 por 65 mm e n t r e l o s PO

-

zos y s e c o l o c a r o n lOOul de suero, s e incubaron l a s l a m i n i l l a s en cá -

mara húmeda a 20°C por 78 horas para que s e r e a l i z a r a l a inmunodifu- s i ó n . En seguida s e l a v a r o n l a s p l a c a s por t r e s d í a s con SSB pH 8.4 haciendo dos cambios d i a r i o s . S e d e j a r o n en agua d e s t i l a d a 1 hora y s e secaron con papel f i l t r o a 40°C, s e t i ñ e r o n con a z u l b r i l l a n t e de Coomasie durante 5 minutos.

S o l u c i ó n c o l o r a n t e :

Metanol a l 50% 454. O

Acido a c é t i c o 92.0

Agua d e s t i l a d a 454.0'

Azul b r i l l a n t e de Coomasie 1.25 S e c o n t r a s t a r o n l a s bandas con s o l u c i ó n d e c o l o r a n t e . S o l u c i ó n decolorante:

Acido a c é t i c o 5b.O

Metanol 50.0

G1 i c e r o l 10.0

Agua d e s t i l a d a 890. O

Finalmente se secaron a 40°C.

m l m l m l 9

m l

(29)

26

F. CONTRAINMUNOELECTROFORESIS.

1 . S o l u c í ó n r e g u l a d o r a de b a r b i t a l s ó d i c o pH 8 . 6 :

. B a r b i t a l s ó d i c o 1 8 . 0 g

Acido c l o r h í d r i c o 1N 1 3 . 0 ml

Azida de s o d i o 1 . 0 g

Agua d e s i o n i z a d a a 2000.0 m l

2. P l a c a s de a g a r o s a a l 0 . 6 % :

Agarosa 0 . 6 g

Sol. r e g u l a d o r a de b a r b i t a l pH 8 . 6 5 0 . 0 ml

Agua d e s t i l a d a 5 0 . 0 m l

Por cada l a m i n i l l a s e c o l o c a r o n 3 ml de a g a r o s a f u n d i d a , se

d e j ó g e l i f i c a r a 20°C y s e guardaron a 4°C por 24 horas en cámara h Ú

-

meda.

E n cada pozo de l a l a m i n i l l a s e c o l o c a r o n 10 u1 d e l a n t í g e n o e n f r e n t a n d o l o con 10 u 1 de s u e r o . La e l e c t r o f o r e s i s s e r e a l i z ó en una cámara con s o l u c i ó n r e g u l a d o r a de b a r b i t a l pH 8 . 6 y a p l i c a n d o

2.5 mA por l a m i n i l l a . S e u t i l i z ó como i n d i c a d o r de m i g r a c i ó n azul de bromofenol-albúmina s é r i c a , b o v i n a , d e j a n d o l o c o r r e r 1 . 5 cm h a c i a el ánodo.

Se incubó en cámara húmeda a 20°C d u r a n t e 7 2 h o r a s . Se l a v ó

(30)

27

d e j a r o n e n a g u a d e s t i l a d a p o r 1 h o r a y s e s e c a r o n c o n p a p e l f i l t r o a

4 O O C . S e t i ñ e r o n p o r 5 m i n u t o s c o n a z u l b r i l l a n t e d e C o o m a s i e y s e

c o n t r a s t a r o n c o n s o l u c i d n d e c o l o r a n t e .

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(31)

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28

6 . M I C R O D O B L E I N M U N O D I F U S I O N .

1. P r e p a r a c i ó n del a g a r a l 1 . 5 % :

Agar 1 . 5 g

S o l u c i ó n s a l i n a - b o r a t o ( S S B ) pH 8 . 4 100.0 .ml

Se funde e l a g a r en baño María a e b u l l i c i ó n .

2 . S e montan l o s moldes de l u c i t a c o b r e p o r t a o b j e t o s en una me- s a n i v e l a d a y s e v a c i a e l a g a r y s e d e j a g e l i f i c a r a temperatura am-

b i e n t é . p o r 30 minutos.

3. Se guardan en cámara humeda a 4 ° C d u r a n t e 24 h o r a s .

4 . Para r e a l i z a r l a prueba de inmunodifusión s e e x t r a e e l a g a r

de los pozos y s e c o l o c a n 50 u 1 de a n t i g e n 0 y a n t i c u e r p o en l o s pozos

c o r r e s p o n d i e n t e s .

5. S e d e j a d i f u n d i r durante 5 d í a s a 20°C en cámara húmeda. 6 . Se l a v a con SSB pH 8 . 4 a 4 0 C haciendo dos cambios a l d í a du-

r a n t e t r e s d í a s .

7 . Se t l ñ e con A z u l de Coomasie por 5 minutos y

8 . S e c o n t r a s t a con s o l u c i ó n d e c o l o r a n t e de á c i d o a c é t i c o y me-

(32)

(33)

30

A. O B T E N C I O N D E LAS FRACCIONES DEL ANTIGEN0 SOLUBLE DE

CORAZON H U M A N O .

S e c o n s i d e r ó c o m o A S C H al s o b r e n a d a n t e o b t e n i d o d e una c e n t r i f l

gación a 10,000 rpm por 30 m i n u t o s d e un homogenizado d e c o r a z ó n h u -

m a n o , m i e n t r a s q u e el A I C H c o r r e s p o n d i ó al botón.

D e la ragmentación del A S C H c o n sulfato d e a m o n i o a c o n c e n t r a -

c i o n e s c r e c e n t e s s e obtuvieron 7 f r a c c i o n e s ( I - V I I ) y un s o b r e n a d a c

t e final(SN

.

La tabla I muestra el volúmen f i n a l , la c o n c e n t r a c i ó n

d e proteína determinada por el m é t o d o de Lowry para cada f r a c c i ó n ,

a s í c o m o la cantidad d e proteína f i n a l , en m i l i g r a m o s , para cada una.

S e puede a p r e c i a r q u e l a s f r a c c i o n e s I,11, 111, y I V q u e c o r r e s p o n - d e n a l a s proteínas precipitadas a una saturación del 10, 20, 3 0 y

40 por ciento r e s p e c t i v a m e n t e , presentarón una elevada Concentración

d e proteína y d e é s t a s destaca la f r a c c i ó n I11 c o n la m a y o r cantidad

d e proteína por volúmen (32.75 mg/ml), m i e n t r a s q u e l a s proteínas p r g

-cipitadas a l 70% d e saturación y el SN final presentaron c o n c e n t r a c i g

n e s bajas d e proteína.

E l volúmen inicial d e la s o l u c i ó n d e A S C H f u é d e 190 ml c o n una

c o n c e n t r a c i ó n d e proteína d e 5.3 mg/ml,

lo

q u e equivale a 1007 mg d e protefna total.

Al

final del tratamiento c o n s u l f a t o d e a m o n i o s e r e

cuperaron 762.19 m g , l o q u e implica u n rendimiento del 75.7% en c u a n

t o a proteína s e refiere.

I I

I

(34)

31

T A B L A I. C o n c e n t r a c i ó n d e proteína d e l a s f r a c c i o n e s d e a n t í g k n o s s o l u b l e s d e c o r a z ó n humano precipita -

d a s con s u l f a t o de a m o n i o .

**

F r a c c i ó n Volumen ( m i ) P r o t e í n a * ( m g / m i ) Proteína t o t a l ( m g )

I

I 1

11.1

I V

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V I

V I I

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5.3

8.1

7.8

6.5

26.0

7.5

35.5

243.0

10.9

23.5

32.75

14.15

5.62

0.64

O. 38

0.0096

57.77

190.35

255.45

91.97

146.12

4.80

13.49

2.24

T o t a l 339.7 762.19

*

Cuantificación d e proteína p o r e l m é t o d o d e Lowry.

C o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l d e l A S C H total= 1007mg/190ml.

(35)

3 2

Una v e z q u e s e c u a n t i f i c ó proteína en c a d a una d e l a s f r a c c i o n e s

s e a j u s t a r o n las c o n c e n t r a c i o n e s a 1 2 mg/ml. Siendo necesario para e l l o ,

en el c a s o d e l a s fracciones 11, 111 y

I V

a g r e g a r SSB pH 8 . 4 y para el resto :e c o n c e n t r ó por c e n t r i f u g a c i ó n a t r a v é s d e m e m b r a n a s d e A m i c ó n

(CF-50A) a 1500 rpm.

B. ELECTROFORESIS

EN

GEL

D E

POLIACRILAMIDA.

La tabla I 1 muestra el número d e bandas o b t e n i d a s por e l e c t r o f o r e -

sic en gel d e a c r i l a m i d a c o n S D S , r e v e l a d a s c o n azul brillante d e Cooma -

s i e , para l o s a n t í g e n o s s o l u b l e s totales (ASCH) y s u s fracciones. (Fiq.2)

S e hicieron pasar electroforeticamente a t r a v P s del gel d e acri -

lamida muestras d e 52 ug d e proteína para cada fracclón. Las fraccio.

nes 1 1 ,

V I

y V I 1 del A S C H presentaron 12 bandas, en las f r a c c i o n e s I11 y V s e observaron 1 1 bandas en cada u n a , l a s fracciones

I

y

I V

presenta

-

r o n 9 y 8 bandas r e s p e c t i v a m e n t e , mientras q u e en el gel d o n d e s e pro- bó el s o b r e n a d a n t e ( S N ) no s e d e t e c t ó ninguna banda.

C. CARACTERIZACION INMUNOSEROLOGICA.

C o n el fin d e establecer un patrón inmunológico d e l o s a n t í g e n o s

c a r d i a c o s , éstos s e e'nfrentaron c o n t r a d i v e r s o s antisueros.

La tabla I11 muestra el promedio d e s i s t e m a s a n t í g e n o - a n t i c u e r p o

q u e s e observaron por MID d e la m e z c l a d e ASCH y sus fracciones c o n di

-

(36)

*

T i n c i ó n c o n

A n t í g e n o s s

**

3 3

1

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I

d o d e c i l s u l f a t o d e s o d i o .

I

T A B L A 1 1 . A n á l i s i s c u a l i t a t i v o d e l a s f r a c c i o n e s c a r d i a c a s

p o r e l e c t r o f o r e s i s e n g e l d e p o l i a c r i l a m i d a c o n

F r a c c i ó n N ú m e r o d e b a n d a s o b t e n i d a s "

ASCH** 1 1

I*** 9

I 1 1 2

I 1 1 1 1

I V V V I V I I SN

8

1 2 1 1 1 2 O

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1 ub

b r i l l a n t e

e s d e C o r a

d e C o o m a s i e .

6 n h u m a n o t o t a l e I .

***

(37)

r-

F i g 2. E s q u e m a d e l a s b a n d a s r e s u l t a n t e s d e l a e l e c t r o f o r e s i s e n

g e l d e p o l i a c r i l a m i d a ( P A G E ) t e ñ i d a s c o n a z u l h r i l l a n t e d e C o o m a s i e . S e m u e s t r a c a d a f r a c c i ó n d e l ASCI! c o n el n ú m e r o d e b a n d a s c o r r e s p o n d i e n t e , e x c e p t o p a r a el SN d o n d e n o s e

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(38)

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(39)

36

s e a p r e c i a q u e los ASCH totales y sus f r a c c i o n e s presentan, en g e n e r a l ,

tanta o m a y o r reactividad contra el suero anti-AICH q u e c o n el s u e r o ho

-

m ó l o g o y q u e el SN no presenta r e a c c i ó n positiva c o n ninguno d e e s t o s

d o s ailtisueros ( F i g 3 ) ! Existe a d e m á s , una alta incidencia d e antigenos

q u e son reconocidos por el a n t i s u e r o humano y q u e e s t a n presentes en t o

das l a s f r a c c i o n e s incluso en el S N y especialmente en la f r a c c i ó n 1 1 1 ,

en d o n d e s e d e t e c t a n e n t r e 5 y 7 bandas en l a s diversas pruebas realiza -

d a s por MID y s i e n d o el promedio d e 6.

C o n f i n e s c o m p a r a t i v o s s e probó también c o n s u e r o antisarcolema

d e c o r a z ó n humano ( 2 ) , el resultado del enfrentamiento d e e s t e a n t i s u e

ro c o n el ASCH dió un promedio d e 4.2 bandas.

P o r o t r o l a d o , la m a y o r reactividad para el suero antisarcolema

la t i e n e la f r a c c i ó n I precipitada c o n 10% d e sulfato d e a m o n i o , mien-

t r a s q u e c o n la f r a c c i ó n q u e c o r r e s p o d i ó al s o b r e n a d a n t e no s e a p r e c i ó

ninguna banda d e identidad. Y al enfrentar los a n t í g e n o s c a r d í a c o s c o n

suero a n t i g a m m a globulina humano s e detectó un promedio d e 3.5 bandas

para el ASCH c o m p l e t o y en l a s ’ f r a c c i o n e s

I ,

1 1 , I 1 1 y

I V

s e obtuvieron 2, 4 , 3 y 3 bandas en p r o m e d i o , r e s p e c t i v a m e n t e . El r e s t o d e las f r a c c i o

n e s no presentó reacción c o n el a n t i s u e r o humano.

En la tabla

I V

s e reporta los resusltados del enfrentamiento d e l o s a n t í g e n o s en estudio c o n la misma s e r i e d e a n t i s u e r o s por C I E F , en

d o n d e s e aprecia q u e a l g u n a s f r a c c i o n e s , c o m p a r a t i v a m e n t e c o n la MID.

y a no tuvieron reacción positiva, por e j e m p l o , l a s f r a c c i o n e s

V

y VI1 al probarse c o n el a n t i s u e r o c o n t r a ASCH; las f r a c c i o n e s V I y V I 1 c o n -

tra el AICH o la f r a c c i ó n VI c o n t r a el suero antisarcolema y el a n t i g a

mmaglobulina humano y por CIEF s e detecta la reacción e n t r e el S N Y el

1

(40)

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(41)

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(42)

39

a n t i s u e r o d e sarcolema humano, l o cual no o c u r r i o por HID.

En c u a n t o a l o s r e s u l t a d o s o b t e n i d o s por medio d e la prueba d e

inmunoelectroforesis (IEF) y c o m o l o muestra la tabla V , las frac:-

c i o n e s del ASCH presentan un q r a d o d e positividad m a y o r q u e el o b s e r -

vado en la C I E F e incluso q u e en la M I D , l l e o a n d o a haber promedios

d e b a n d a s - d e 5.7, c o m o en el c a s o d e la f r a c c i ó n V c o n t r a el a n t i -

s u e r o c o n t r a l o s A S C H , s i n embarqo e s t e elevado ranqo d e positividad

solo se observa en e s t e c a s o , c o n t r a el a n t i s u e r o homolooo, m i e n t r a s

q u e en el resto d e - l o s a n t i s u e r o s lleaa a haber m e n o s

D. A N T I C U E R P O S CONTRA FRACCIONES C A R D I A C A S CARDIOPATAS.

reacción.

EN P A C I E N T E S

C A R A C T E R I S T I C A S C L I N I C A S D E PCBLACION ESTUDIADA.

S e r e a l i z ó un e s t u d i o para c o n o c e r y evaluar la incidencia d e

a n t i c u e r p o s contra l a s f r a c c i o n e s precipitadas del ASCK c o n d i f e r e n -

t e s porcentajes d e s a t u r a c i ó n d e sulfato d e a m o n i o c o n una población

d e 60 individuos c l a s i f i c a d o s en 7 q r u p o s d e a c u e r d o alsdiannóstico

c l í n i c o en: pacientes c o n infarto a g u d o del m i o c a r d i o , ateroesclero-

sis e insuficiencia c o r o n a r i a , m i o c a r d i o p a t í a , cardiopatía conqéni

-

ta, o t r o s padecimientos y personas a p a r e n t e m e n t e s a n a s en el m o m e n -

to d e la prueba. (Tabla VI).

Aunque los g r u p o s e s t u d i a d o s s o n pequeños vale la pena r e s a l t a r

q u e la distribución por s e x o e s s i m i l a r en el infarto del m i o c a r d i o

y m i o c a r d i o p a t í a , pero es v a r i a b l e e n l o s o t r o s qrupos. En r e l a c i ó n

(43)

40

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(44)

4 1

TABLA

V I .

C a r a c t e r i s t i c a s c l í n i c a s d e l a p o b l a c i ó n e s t u d i a d a .

D i a g n ó s t i c o .

*

S e x o ( % ) E d a d + p r o m e d i o

M ( - d.e.) P a c i e n t e s

i n f a r t o a g u d o d e l 8 50.0 50.0 69.6

'!'

11.95

m i o c a r d i o .

I n s u f i c i e n c i a c o r o n a r í a 26 34.6 65.4 65.2 2 10.17 y a t e r o e s c l e r o s i s .

M i o c a r d i o p a t í a . 4 50.0 50.0 37.7 17.01

C a r d i o p a t í a r e u m á t i c a 7 85.7 14.3 42.8 11.79

C a r d i o p a t í a c o n g é n i t a 6 33.3 66.6 15.5 2 2 1

O t r o s p a d e c i m i e n t o s 3 66.6 33.3 44.0

2

7.0

S a n o s 2 100 O 34.5 2 2.12