Subpoblaciones de linfocitos T en el micetoma
Artículo original
RESUMEN
Antecedentes: la presencia de citocinas proinflamatorias (IL-1b, TNFa) y antinflamatorias (IL-4 e IL-10) en las lesiones de pacientes con
micetoma puede asociarse con la activación de las células inmunes. Ya que existe poca información sobre la función de los linfocitos en
dichas lesiones, es importante conocer las subpoblaciones de TCD4+ y TCD8+ para explicar el proceso inflamatorio crónico.
Objetivo: identificar las poblaciones de linfocitos con fenotipo CD4+ (T cooperadores) y CD8+ (T citotóxicos) presentes en micetomas humanos, mediante el uso de anticuerpos monoclonales marcados con fluoresceína (TCD4+) y R-ficoeritrina (TCD8+).
Material y método:se utilizaron cortes histológicos de biopsias de cinco pacientes con micetoma por Nocardia brasiliensis, uno por Acti-nomadura madurae, uno por Madurella mycetomatis y uno por Acremonium, con un promedio de cinco años de evolución. Se realizaron
dos cortes por muestra; uno se tiñó con hematoxilina-eosina y el otro se procesó con anticuerpos monoclonales marcados anti-CD4+ humana fluoresceína y anti-CD8+ humana R-ficoeritrina, los cuales fueron diluidos 1:100 en solución de fosfatos (PBS-gelatina). Resultados: en actinomicetomas hubo 85% de linfocitos TCD4 y 15% de TCD8; en eumicetomas, 81% de linfocitos TCD4 y 19% de TCD8. En general, en micetomas hubo 83% de linfocitos TCD4 y 17% de TCD8.
Conclusión: el proceso inflamatorio agudo del micetoma, con abundancia de neutrófilos, podría deberse al IFN-g secretado por las células
CD4+ (Th1) y TCD8+ presentes en las lesiones. La regulación de la síntesis del IFN-g dependerá de las concentraciones de citocinas
regulatorias provenientes de los linfocitos CD4+ (Th2).
Palabras clave: micetoma, actinomicetoma, eumicetoma, inmunofluorescencia, subpoblaciones de linfocitos T.
ABSTRACT
Background: Pro-inflammatory cytokines (IL-1b and TNFa) and anti-inflammatory cytokines (IL-4 and IL-10) presence in patients injuries with mycetoma can be associated with immune cells activation. Due to scarce information of lymphocyte function in these injuries it is important to know TCD4+ and TCD8+ subpopulations to explain chronic inflammatory processes.
Objective: To identify TCD4+ and TCD8+ lymphocyte phenotype populations in humane mycetomas, by fluorescent monoclonal antibodies (FITC or fluorescein, anti-TCD4+) and RPE or R-phycoerythrin (anti-TCD8+).
Material and methods: Histological cuts in biopsies of five patients diagnosed as with actinomycetoma, two due to Nocardia brasilensis, one due to Actinomadura madurae, one due to Madurella mycetomatis, and one due to Acremonium, respectively, with a mean of five years
of development. Two cuts of each sample were performed, one used to hematoxilin-eosin stain and one for human immunofluoresence study, both diluted in a 1:100 PBS-gelatin solution.
Results:In actinomycetomas 85% were TCD4+ lymphocytes and 15% were TCD8+. In eumicetoma injuries, 81% were TCD4+ and 19% were TCD8+. Generally, in mycetomas 83% were TCD4 and 17% were TCD8.
Conclusion: Acute inflammatory process of mycetoma, with an abundant neutrophil presence, could be due to IFN-g secreted by CD4+ (Th1) and TCD8+ cells in these injuries. Regulation of IFN-g synthesis will depend on regulatory cytokines levels from CD4+ (Th2). Key words: Mycetoma, actinomycetoma, eumycetome, immunofluorescence, T lymphocyte subpopulation.
Alejandro Palma Ramos,* Laura Estela Castrillón Rivera,* Alejandra Pizaña Cureño,* Ma. Elisa Vega Memije,** Adriana Patricia López Bárcenas,** Roberto Arenas Guzmán,*** María del Carmen Padilla Desgarennes****
E
l micetoma es un síndrome clínico que con-siste en lesiones inflamatorias deformantes no dolorosas y fístulas que afectan los teji-dos cutáneo y subcutáneo, las aponeurosisy el hueso.1 Por lo general, afecta las extremidades
* Profesor investigador del laboratorio de inmunopotenciadores.
Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco.
Departamento de Sistemas Biológicos.
** Servicio de dermatología del Hospital General Manuel Gea González, Secretaría de Salud.
*** Servicio de micología del Hospital General Manuel Gea González, Secretaría de Salud.
**** Laboratorio de micología del Centro Dermatológico Dr. Ladis- lao de la Pascua, Secretaría de Salud del DF.
Correspondencia: Dr. Alejandro Palma Ramos.
E-mail: [email protected]
Recibido: octubre, 2007. Aceptado: octubre, 2007.
años de su aparición. Se adquiere por la implantación del agente causante a través de un traumatismo. Se distingue por aumento de volumen, abscesos que supuran, granulomas y fístulas que drenan material seroso filante o serosanguinolento, así como granos característicos.
Puede ser causado por una amplia variedad de bacterias (actinomicetomas) y hongos (eumicetomas) del suelo.2 Es más frecuente en hombres (proporción
de 4:1), excepto en el micetoma por Actinomadura
ma-durae, que predomina en las mujeres (relación de 2:1).
Se manifiesta con mayor frecuencia entre los 16 y los 45 años de edad. Los estados de la República Mexica-na con más casos reportados, en orden de frecuencia, son Morelos, Guerrero, Veracruz, Michoacán, Oaxaca, Guanajuato, Puebla, Hidalgo, San Luis Potosí, Estado de México, Sinaloa y Jalisco.
En este país son más frecuentes los actinomiceto-mas, con 97.9% de casos respecto de los eumicetomas (2.1%). De los primeros, el agente más frecuente es el género Nocardia (86.5%), del cual la especie brasiliensis es la más común; le siguen Actinomadura madurae con 10% (incluyendo A. pelletieri) y, por último,
Streptomy-ces somaliensis con 1.3%. Los eumicetomas representan
2.1% de casos, donde predominan los producidos por granos negros; la especie más frecuente es Madurella
mycetomatis.3
Estos microorganismos son saprófitos del suelo que se introducen al organismo a través de pequeñas heridas; crecen lentamente y generan el micetoma.
Sea cual fuere el agente causante, siempre se forman granos que drenan a través de fístulas. Las
supuraciones evidencian la reproducción del agente causal, ya que en ellas se pueden localizar granos filamentosos.4
Se han estudiado diferentes aspectos de la res-puesta inmune en pacientes con micetomas. En 1962, González-Ochoa observó en pacientes con actinomi-cetoma causado por Nocardia brasiliensis que, cuando se les inoculaba nocardina o tuberculina en piel y había una reacción positiva, se tenía un buen pronós-tico; mientras, altas concentraciones de anticuerpos se asociaban con mayor gravedad de la enfermedad.5
Resultados similares encontró Mahgoub en 1977, cuando estudió pacientes africanos con eumicetomas y actinomicetomas.6
En Brasil se reportó el caso de una paciente con una herida en la mano derecha, indolora con edema, inflamación y fístulas con secreción seropurulenta y ausencia de granos. El examen histopatológico del material, teñido con hematoxilina-eosina, mostró hifas septadas hialinas, y el cultivo fue positivo para
Acremonium. La paciente fue tratada con itraconazol
en dosis de 200 mg/día durante dos meses.7
En eumicetomas causados por Madurella
my-cetomatis se han encontrado tres tipos de reacción
inflamatoria.8 La reacción tipo I se distingue por
una zona de neutrófilos que rodean al grano, una zona intermedia de macrófagos, células gigantes y una zona periférica que contiene linfocitos y células plasmáticas. La reacción tipo II no tiene la zona de neutrófilos y el grano está rodeado por macrófagos y células gigantes. La reacción tipo III consiste en un granuloma epitelioide discreto, con células gigantes tipo Langhans, sin granos bien formados.9 Mediante
Es importante recordar que las células T coopera-doras específicas del antígeno pueden ser de dos tipos: Th1 y Th2, de acuerdo con las citocinas que produzcan y su función efectora. La diferenciación a células Th1, que producen IL-2, IFN-g y linfotoxina, es estimulada por la IL-12 e IFN-g; mientras, las células Th2 producen IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13, dependientes de IL-4. El IFN-g
es representativo de las citocinas del tipo Th1 y un inhibidor del crecimiento de las células Th2. La IL-10 es una citocina con actividad antinflamatoria.11
Desde el punto de vista histopatológico, en el mi-cetoma se observa un grano rodeado de numerosos neutrófilos polimorfonucleares, seguidos de macrófa-gos, células gigantes y muy pocos linfocitos. Estudios previos demostraron la existencia de citocinas proinfla-matorias (IL-1b, TNFa) y antinflamatorias (IL-4 e IL-10) en lesiones de pacientes y modelos experimentales murinos, lo que puede relacionarse con la activación de las células inmunes existentes; sin embargo, existe muy poca información acerca de la función de los linfocitos en estas lesiones. Por esa razón, es importante cono-cer la subpoblación de linfocitos T (CD4+ y TCD 8+) existente, para dar una posible explicación del proceso inflamatorio crónico de esta enfermedad.
El objetivo de este trabajo es identificar las poblacio-nes de linfocitos con fenotipos CD4+ (T cooperadores) y CD8+ (T citotóxicos) presentes en micetomas hu-manos, mediante el uso de anticuerpos monoclonales marcados con fluoresceína (TCD4+) y R-ficoeritrina (TCD8+).
MATERIAL Y MÉTODO
Biopsias. Se utilizaron cortes histológicos de biopsias de cinco pacientes con diagnóstico de micetoma por
Nocardia brasiliensis, uno por Actinomadura madurae,
uno por Madurella mycetomatis y uno por Acremonium, con un promedio de cinco años de evolución, propor-cionados por el Servicio de dermatología del Hospital General Dr. Manuel Gea González y el Centro Derma-tológico Dr. Ladislao de la Pascua.
Diagnóstico clínico. En el Servicio de dermatología del Hospital General Dr. Manuel Gea González, los pacientes con diagnóstico de micetoma en el pie tuvie-ron el siguiente cuadro clínico: aumento de volumen y deformidad de la región afectada (aspecto
“abollona-do”), fístulas plantares de consistencia pétrea por las que drenaba un material filante-seropurulento, dolor de moderado a grave con incapacidad para caminar.
Diagnóstico histológico. Se realizaron dos cortes his-tológicos: el primero, para la realización de la tinción con hematoxilina-eosina y, el segundo, para el marcaje
in situ. En los pacientes con diagnóstico de micetoma,
se observó papilomatosis en la dermis, con un infil-trado denso que ocupaba la dermis media y profunda constituido por microabscesos de polimorfonucleares rodeados por linfocitos, histiocitos y numerosos vasos neoformados.
Técnica histoquímica. Para desparafinar, los cortes se sometieron, sucesivamente, a baños con xilol (10 min), xilol-alcohol absoluto (5 min), alcohol absoluto (5 min), alcohol 96° (5 min), acohol 70° (5 min) y agua destilada (5 min).
Para el diagnóstico de micetoma se realizaron las tinciones por hematoxilina-eosina con el siguiente pro-cedimiento:12 desparafinar, colorear con hematoxilina
de Harris durante un minuto y lavar; posteriormente, diferenciar con alcohol-ácido, lavar y virar con agua amoniacal; luego, lavar nuevamente, colorear con eosina durante 30 segundos, deshidratar y montar.
Se observaron núcleos azules y citoplasma en color rosa o naranja.
Procedimiento inmunohistoquímico. Consistió en desparafinar; agregar PBS (7.4) durante cinco minu-tos; bloquear con PBS-gelatina (0.05%) durante cinco minutos; colocar la solución con anticuerpos mono-clonales marcados anti-CD4+ humana fluoresceína y anti-CD8+ humana R-ficoeritrina (Dako Cytomation MultiMix Dual-Colour Reagent FR 868 ), los cuales fueron diluidos 1:100 en solución de fosfatos (PBS-gelatina); incubar durante una hora a temperatura ambiente en cámara húmeda; incubar 24 horas a 4°C en cámara húmeda; lavar con PBS; colocar una gota de glicerol-PBS (9:1); colocar un cubreobjetos y sellar con barniz de uñas transparente; observar en microscopio de fluorescencia (dejando calentar la lámpara durante cinco minutos).
RESULTADOS
identificar y corroborar de qué tipo de micetoma se trataba. En el segundo corte se llevó a cabo el análisis
in situ con anticuerpos monoclonales marcados con
anti-CD4+ humana fluoresceína (FITC) y anti-CD8+ humana R-ficoeritrina (PE), observadas en fluorescen-cia con una lámpara de argón de 50 W con longitudes de onda que abarcaran 530 nm (FITC) y 585 nm (PE). En las figuras 1 a 4 se muestra el análisis de los actinomice-tomas, y en las figuras 5 a 8, el de los eumicetomas.
Los linfocitos TCD8+ se observan en rojo (PE), y los T CD4+, en verde (FITC) (figuras 9 y 10). Se identificaron
Figura 1. Micetoma por Nocardia brasiliensis teñido con H-E
observado a 40X.
Figura 2. Micetoma por Nocardia brasiliensis en fluorescencia observado a 40X.
Figura 4. Corte de la reacción inflamatoria de micetoma por Acti-nomadura madurae observado a 10X.
Figura 3. Micetoma por Actinomadura madurae teñido con H-E
observado a 40X.
y contaron las células TCD8 y TCD4. Los resultados,
Cuadro 1. Cuantificación de linfocitos TCD4 y TCD8 en cien células
contadas en seis actinomicetomas y dos eumicetomas
Micetoma por TCD4 + (%) TCD8 + (%)
Actinomicetoma 85 15
Nocardia brasiliensis 98 2
Nocardia brasiliensis 94 6
Nocardia brasiliensis 96 4
Nocardia brasiliensis 95 5
Nocardia brasiliensis 76 24
Actinomadura madurae 78 22
Eumicetoma 81 19
Madurella mycetomatis 70 30
Acremonium 92 8
Promedio 83 17
Figura 6. Micetoma por Madurella mycetomatis en fluorescencia observado a 40X.
Figura 7. Micetoma por Acremonium teñido con H-E observado a 10X.
Figura 8. Micetoma por Acremonium en fluorescencia observado a 40X.
Figura 9. Linfocito TCD8+ marcado con anti-CD8+ R-ficoeritrina (PE).
DISCUSIÓN
Los agentes patógenos son reconocidos por fagocitos en los tejidos conectivos subepiteliales, con tres con-secuencias importantes:
1) Los patógenos son atrapados, englobados y des-truidos por macrófagos y neutrófilos.
2) La interacción de los patógenos con los fagocitos induce la secreción de citocinas. El estímulo para la síntesis de interleucinas por los macrófagos proba-blemente sea la unión del patógeno con los mismos receptores utilizados para su englobamiento.
3) Los macrófagos funcionan como una célula presen-tadora de antígenos. En este sentido, los receptores de los macrófagos tienen una función importante en el secuestro y procesamiento del antígeno, así como en la transmisión de señales que inducen la expresión de moléculas coestimulatorias. De esta manera los macró-fagos, al liberar ciertos tipos de citocinas, determinan el tipo de la respuesta inmune.
Las citocinas IL-1 y TNF-a promueven la expresión de moléculas de superficie (como ICAM y selectinas) sobre las células endoteliales, para contribuir a la acumulación de leucocitos en sitios de inflamación. Igualmente, provocan que fagocitos mononucleares y células endoteliales sinteticen quimiocinas activa-doras de leucocitos. Las quimiocinas C-X-C actúan predominantemente sobre los neutrófilos, mientras las quimiocinas C-C actúan principalmente en célu-las T, monocitos, eosinófilos y basófilos, pero no en neutrófilos.
Una vez atraídas las células, el TNF-a estimula a neutrófilos, eosinófilos y fagocitos mononucleares para lisar microbios. Los neutrófilos son la principal línea de defensa contra los hongos, ya que además de efectuar la fagocitosis, presumiblemente liberan especies oxigenorreactivas y enzimas lisosomales para eliminar el patógeno.13
En el caso del micetoma, es una infección crónica de la piel y los tejidos subyacentes que afecta finalmente los huesos. Se distingue por aumento de volumen relativamente indoloro y fístulas por las que sale pus conteniendo granos. Los agentes causales de origen exógeno pueden ser hongos o actinomicetos aerobios;
ambos producen granos filamentosos.14 De acuerdo
con la clasificación propuesta por Fahal en 2003,10 los
micetomas se ubicarían en una reacción del tipo I, que se distingue porque el grano está casi siempre rodeado por una capa de leucocitos polimorfonucleares. En el interior, muchos neutrófilos están en contacto con la superficie del grano, y en algunas ocasiones lo pene-tran causando su fragmentación. La zona contigua está compuesta por macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y pocos neutrófilos. Ésta es la zona que se utilizó en este trabajo para buscar la mayor cantidad de linfocitos e identificarlos por medio del marcaje y fluorescencia (rojos: células TCD8 [PE]; verdes: células TCD4 [FITC]). Se encontró que en los actinomicetomas hay 85% de linfocitos TCD4 y 15% de TCD8; mientras que en los eumicetomas hay 81% de linfocitos TCD4 y 19% de TCD8. En general, en micetomas encontramos 83% de linfocitos TCD4 y 17% de TCD8.
Estas proporciones son importantes, ya que existen dos tipos de linfocitos T: los linfocitos TCD4+ y los TCD8+ (CTL), de los cuales la estirpe CD4+ se divide en linfocitos Th1 y Th2. Los clones Th1 sintetizan IL-2, IFN-g y linfotoxina (LT). Su expresión no se identifica en los clones Th2, pues éstos sólo sintetizan cantidades medibles de IL-4, IL-5 y probablemente IL-6.
En el cuadro 2 se listan las linfocinas características de cada uno de los clones TCD4 (Th1 y Th2) y TCD8 (CTL).15
Cuadro 2. Propiedades de los clones de células T
Th1 CTL Th2
Marcadores de superficie
LY1 + - +
L3T4 + - +
LYT2 - +
-Linfocinas
INF-g ++ ++
-IL-2 ++ +/-
-Linfotoxina ++ +
-GM/CSF ++ ++ +
TNF ++ + +
TY5 ++ ++ +
P500 ++ +
H400 ++ +
IL-3 ++ + ++
IL-4 - - +
IL-5 - - +
IL-6 - - +
Th: linfocitos T cooperadores; CTL: linfocitos T citotóxicos.
Se ha observado que los clones de células murinas T citotóxicas y Th1 producen altas cantidades de IFN-g, como se observa en el cuadro 2. El IFN-g es importante en la regulación de la respuesta inmune, pues estimula la actividad bactericida de los fagocitos, la presentación de antígeno unido al complejo prin-cipal de histocompatibilidad de clases I y II, y dirige la interacción endotelio-leucocito.
En la etapa temprana de la infección, los fagocitos mononucleares liberan citocinas como IL-1, TNF-a
y TGF-b en los sitios del reconocimiento antigénico. Estas interleucinas inducen la secreción de citocinas quimiotácticas IL-8 y MCP por las células estromales y la expresión de moléculas de adhesión ELAM-I e ICAM-I en las células endoteliales, para iniciar la acumulación de neutrófilos, macrófagos y células NK, mismos que producen las interleucinas IFN-g, IL-12, IL-10, IL-15 e IL-18, para activar los linfocitos T y B (células de la respuesta inmune específica) y así eliminar el antígeno del tejido blanco.13
CONCLUSIÓN
El micetoma es un proceso inflamatorio agudo con abundancia de neutrófilos. Para explicar este fenóme-no, se propone que puede deberse al IFN-g secretado por las células CD4+ (Th1) y TCD8+ presentes en las lesiones de micetoma. La regulación en la síntesis del IFN-g dependerá de las concentraciones de citocinas regulatorias provenientes de los linfocitos CD4+ (Th2).
REFERENCIAS
1. Gonzalez OA. In: Cañizares O, editor. Mycetoma. Clinical tropical dermatology. Oxford: Blackwell Scientific, 1975;pp:24-29. 2. Magaña M. Mycetoma. Int J Dermatol 1984;23:221-36. 3. Padilla C, Novales J, Juárez V, Flores A. Minimicetoma. Presen
-tación de un caso. Rev Cent Dermatol Pascua 2004;13:41-44. 4. Lavalle P. Micetomas por Streptomyces en América. Derma
-tología Ibero-Latino Americana 1972;3:379-89.
5. Gonzalez-Ochoa A, Shibayama H, Felix D, Anaya M. Immuno -logical aspects of actinomycotic mycetoma and nocardiosis.
Proccedings of XII International Congress of Dermatology. Washington, DC. 1962:542-51.
6. Mahgoub ES, Gumma SA, El Hassan AM. Immunological status of mycetoma patients. Bull Soc Pathol Exot 1977;70:48-53. 7. Zaitz C, Porto E, Heins Vaccari EM, Sadahiro A, et al. Subcu
-taneous hyalohyphomycosis caused by Acremonium recifei:
case report. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1995;37:267-70. 8. Fahal AH, El-Hassan AM, Bela Veress. Cell phenotypes, immu
-noglobulins and complement in lesions of eumycetoma caused
by Madurella mycetomatis. Sudanese Journal of Dermatology 2006;4(1):2-5.
9. Fahal AH, El Toum EA, Gumaa SA, Maghoub ES, El-Hassan
AM. Host tissue reaction to Madurella mycetomatis: new
clas-sification. J Med Vet Mycol 1995;33:103-6.
10. Fahal AH. Mycetoma: a thorn in the flesh. Trans R Soc Trop Med Hyg 2004;98:3-11.
11. Sasaki S, Nishikawa S, Miura T, Mizuki M, et al. Interleukin-4 and interleukin-10 are involved in host resistance to Staphy -lococcus aureus infection through regulation of gamma
inter-feron. Infect Immun 2000;68:2424-30.
12. Cormack DH. La histología y sus métodos de estudio. En: Histología de HAM. México: Interamericana 1987;pp:1-28. 13. Hernández-Urzúa MA, Alvarado-Navarro A. Interleucinas e
inmunidad innata. Rev Biomed 2001;12:272-80.
14. Mosrnann TR, Coffman RL. Th1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Ann Rev Immunol 1989;7:145-73.
15. Boehm U, Klamp T, Groot M, Howard JC. Cellular responses
