8 REV MED UNIV NAVARRA/VOL 48, Nº 1, 2004, 8-12 2
Células madre pluripotentes humanas II
N. López Moratalla1, I. González de la Tajada2
1Dpto. de Bioquímica. 2Dpto. de Histología y Anatomía Patológica. Universidad de Navarra
Correspondencia: Natalia López Moratalla Dpto. de Bioquímica Universidad de Navarra ([email protected])
Resumen
Hay abundantes pruebas de la existencia de células madre en los tejidos animales y humanos provenientes de las tres hojas blastodérmicas.
Hasta hace pocos años, estas células troncales se consideraban específicas de tejido, es decir, capaces de generar sólo los tipos de células propias del tejido en el que residían, pero estudios recientes, demuestran una plasticidad inesperada de las células adultas, con capacidad de generar tipos celulares adicionales. En efecto, sustitui-do su entorno natural por otro, ejecutan el programa de diferencia-ción intrínseco de la célula de acuerdo con las nuevas señales de diferenciación que recibe.
En algunos casos, parece que algunas células troncales de adultos tienen mayor potencial de diferenciación que las células madre embrionarias.
El mantenimiento de las propiedades de células madre, la posibili-dad de reprogramarlas y comprometerlas, y el camino que siguen en la regeneración del tejido, es esencial para su uso en medicina regenerativa.
Palabras clave: Células madre adultas. OCT-4. Plasticidad. Dife-renciación.
Summary
There are numerous pieces of evidence showing the existence of stem cells in animal and human tissues. These derive from the three germi-nal layers.
Until a few years ago, these stem cells were considered to be tissue specific, that is, only capable of generating cells specific to a particu-lar tissue. However, recent studies have demonstrated unexpected plasticity of adult cells, thus showing their capability to generate other cell types.
Placed in a particular microenvironment, cells execute an intrinsic cellular differentiation program influenced by signals received from their microenvironment.
In some cases, it seems that some adult stem cells have a greater differentiation potential than embryonic stem cells. The maintenance of stem cell properties, the way these cells can be reprogrammed and compromised, and their role in tissue regeneration, are all essential for their use in regenerative medicine.
Key words: Adult stem cells. OCT-4. Plasticity. Differentiation.
Reprogramación celular hacia el tipo ES
Células madre pluripotentes por clonación de células con dotación genética del paciente
Se ha descrito que la mayor parte de los embriones clónicos de ratón el gen Oct4 (tiene relación con el mantenimiento de la totipotencia de las células de los primeros estadios del desarro-llo embrionario regulando la determinación temprana del em-brión preimplantatorio) se expresa erróneamente, bien respecto al tiempo, o bien respecto al sitio que ocupa la célula, no per-mitiendo un desarrollo embrionario1. Estos datos tienen gran importancia: la expresión de Oct-4 determina si las células ob-tenidas por multiplicación de un nuclóvulo producen un embrión clónico o un simple amasijo de células. La proteína codificada por el gen Oct4 es un factor de diferenciación que dirige la expresión de los genes programando así el establecimiento de la estructura celular del embrión preimplantatorio. Así pues una controlada reprogramación “perfectamente errónea”, que no
reprograme correctamente Oct4, no transforma el ovonúcleo en cigoto y las células derivadas de su multiplicación no consti-tuyen un embrión. Cabe pensar por tanto en tomar las células del tipo ES de esa organización celular que no es un embrión, clonarlas (multiplicarlas) y derivar de ellas células para trans-plante. Se podrían obtener por tanto células madre del tipo embrionario (mediante la transferencia de un núcleo de célula somática de un paciente a un óvulo) sin que ello signifique clonar al paciente, ya que la reprogramación no se realiza ha-cia la obtención de un embrión blastocisto clónico.
Células madre ES por reprogramación partenogenética de un óvulo
reali-dad no es un verreali-dadero embrión ya que carece de la contribu-ción paterna. No obstante se pueden desarrollar hasta estruc-turas del tipo blastocisto2 en los que se ha visto la presencia de células tipo ES. En estudios realizados en ratones3 y en primates no humanos4 se han conseguido células madre a partir de di-chos embriones partenogenéticos, lo que plantea la posibilidad de que esta estrategia puede ser aplicable a los seres humanos. De hecho se ha logrado activación partenogénica de oocitos humanos5 con un pronúcleo haploide o con duplicación del pronúcleo. Estos resultados abren posibilidades interesantes de obtener células troncales sin producir un embrión, aunque de-berá examinarse si las células troncales que se derivan de este proceso tienen un potencial de desarrollo y funcionalidad simi-lar a las derivadas de embriones generados mediante fecunda-ción o transferencia de núcleo; es posible que surjan anormali-dades en el desarrollo y diferenciación de las células, por los efectos de la ausencia de la impronta de un genoma paterno.
Reprogramación celular por factores del medio intracelular
Recientemente se han reprogramado células de adulto por transdiferenciación, sin acudir a la clonación terapéutica, ni usar células madre embrionarias. Han convertido una célula de la piel en linfocitos T necesarios para tratar al paciente6. A los fibroblastos le hicieron una serie de poros microscópicos en las membranas y los sumergieron durante una a dos horas en un extracto de linfocitos T y después cerraron los poros con calcio. Proteínas de las células T capaces de activar específicamente los genes de los linfocitos emigran a las células de la piel y activan en ellas estos genes específicos, mientras que los pro-pios de la piel quedan inactivados. Así los fibroblastos expresan los receptores característicos de los linfocitos al cabo de unas semanas. Este experimento muestra que no es necesario rever-tirlas al estado embrionario sino que se transforman o transdife-rencian. Esto hace pensar que tal vez su vida media no sea tan larga como si se reprograman al estado embrionario, pero tam-poco tendrán el peligro de transformarse en células tumorales.
Reprogramación celular por incorporación de genes
Parece posible combinar el uso de las células madre con la terapia génica para corregir defectos genéticos7. Se han uti-lizado ratones con una deficiencia en un gen importante para la formación de varios tipos de células del sistema inmunitario. Empleando células somáticas de los ratones se han producido clones y obtenido células troncales. Utilizaron a continuación terapia génica para introducir una copia funcional del gen de-fectuoso en las células troncales, además de un gen que indu-cía a las células troncales a transformarse en precursoras de células inmunes. Estas últimas fueron capaces de restaurar parcialmente el sistema inmune dañado de los ratones.
Células madre multipotenciales y pluripotentes
del organismo adulto
En 19998 se demostró que las células madre no tienen que proceder necesariamente de embriones para que sean ca-paces de diferenciarse y dar células especializadas. En efecto, en los tejidos de organismos adultos también existen células madre, llamadas células madre de adulto (células AS)9. Las células AS son responsables de mantener los tejidos en
condi-ciones fisiológicas y además de repararlos en caso de alteración o daño. Existe una amplia evidencia de la presencia de células madre en los tejidos de animales y humanos; hasta la fecha se conoce su presencia en médula ósea, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, cerebro, médula espinal, pulpa dentaria, vasos sanguíneos, músculo esquelético, epitelio de la piel y tejido conjuntivo, córnea, retina, hígado y los conductos del páncreas; por tanto en tejidos que derivan de las tres capas germinales. La definición de estas células AS incluye, como en el caso de las ES o EG, la capacidad de autorenovación, es decir, deben ser células no senescentes, deben ser capaces de diferenciarse morfológica y funcionalmente a tipos celulares de las tres capas germinales, y deben tener la capacidad de contri-buir a todos los tejidos somáticos e incluso germinales cuando son introducidas en blastocistos10.
Hasta hace pocos años, estas células troncales se consi-deraban específicas de tejido, es decir, capaces de generar solo los tipos de células presentes en el tejido en el que residían, pero estudios recientes demuestran una plasticidad inesperada de las células adultas, con la capacidad de generar tipos celu-lares adicionales. Sustituido su entorno natural por otro, ejecu-tan el programa de diferenciación intrínseco de la célula de acuerdo con las nuevas señales de diferenciación que recibe. En algunos casos, parece que algunas células troncales de adul-tos tienen mayor potencial de diferenciación que algunas célu-las troncales embrionarias. Esto podría deberse a que a medida que el organismo crece y madura existe una disminución en la necesidad de restringir el potencial de diferenciación. Como hemos señalado, durante el desarrollo temprano, las células que residen en estrecha proximidad (antes de alcanzar el esta-dio de blastocisto) se ven expuestas a grupos superpuestos de señales extracelulares. Esto requiere el uso de mecanismos autónomos de la célula (niveles de expresión del gen Oct 4, en este caso) para restringir el potencial de seguir determinados destinos (Figura 1). Pero a medida que el organismo crece, y especialmente en adultos, las células troncales en diferentes tejidos pueden estar espacialmente aisladas en nichos donde no están expuestas a señales inductivas presentes en otros
10 REV MED UNIV NAVARRA/VOL 48, Nº 1, 2004, 8-12 2 dos. Por ejemplo, se ha descrito un extraño cambio de la
direc-ción de diferenciadirec-ción: el compromiso hematopoyético de célu-las madre neurales dependiente de célu-las condiciones11. Dado que el mantenimiento de la restricción del potencial de desarrollo es un proceso activo12, es posible que esa restricción se elimine a medida que el organismo crece ya que, por razones espacia-les, las células troncales no encontrarán señales que inducen diferenciación hacia otros linajes13.
Algunos trabajos recientes han mostrado que en algunos casos en el cultivo de diferenciación de células madre de adulto ocurre una fusión espontánea entre estas células y el lecho de células sobre el que crecen14; estos datos plantean la duda de que alguna de las trandiferenciaciones se deba a este fenómeno más que a una verdadera plasticidad intrínseca de las células madre; las células híbridas expresan marcadores específicos de células embrionarias y el factor de transcripción Oct4 específi-co de células pluripotentes. En todo caso estos experimentos avalan los ya descritos acerca de que la hibridación por electrofusión de una célula ES con un timocito da lugar a una reprogramación a una célula rejuvenecida y con características de célula madre embrionaria15. Una alternativa a los problemas que presentan la aplicación de las células ES a la terapia hu-mana sería precisamente la posibilidad de inducir la expresión del gen Oct4 en células de adulto rejuveneciéndolas a células madre pluripotentes.
Un trabajo publicado el año 2002 por la Dra. CM. Verfaille, en la prestigiosa revista Nature, ha ratificado lo que algunos autores apenas sugerían. En el trabajo se validan, todas y cada una de las premisas necesarias para considerar a una célula madre adulta como pluripotente16.
El grupo investigador de este trabajo, consiguió aislar un tipo celular raro, denominado MAPCs, dentro de cultivos de células madre del mesénquima de la médula ósea. Fueron ca-paces de mantener cultivos celulares de MAPCs, durante más de 80 pases, que en presencia de LIF (factor inhibidor de leucemia), EGF (factor de crecimiento epitelial), y PDGF (fac-tor de crecimiento derivado de plaquetas), se mantenían en estado indiferenciado y eran positivas para los marcadores clá-sicos de células pluripotentes (Oct-4 +, Rex-1+, SSEA-I+).
Obtuvieron a partir de estas células, mediante la adicción de citoquinas tejido-específicas, células diferenciadas “in vitro”, no sólo de linaje mesenquimático sino también endo y ectodérmico. Obtuvieron células endoteliales (CD31+, Flk-1+, vWF+), neuroprogenitores y células nerviosas más especializa-das (Serotonina +, GABA +), y células endodérmicas, con ca-racterísticas funcionales de células hepáticas (Albúmina+, citokeratina 8+, y glucogénesis aumentada). La diferenciación inducida además de morfológica, era funcional.
Así mismo, demostraron que las células eran capaces de contribuir a la mayor parte de los tejidos somáticos cuando eran inyectadas en un blastocisto murino temprano. Obtuvieron células derivadas de las inyectadas en encéfalo, retina, pulmón, miocardio, músculo esquelético, hígado, intestino, riñón, bazo, médula ósea, sangre y piel. Además, estas células estaban pre-sentes no solo en embriones tempranos, sino también en indivi-duos adultos, por lo que las células derivadas eran capaces de ser funcionales durante todo el tiempo de vida del órgano.
En contraste con las células madre embrionarias, no se detectaron tumores derivados de las células inyectadas en nin-guno de los animales nacidos a partir de las quimeras, ya que,
aunque las células madre embrionarias contribuyen a la mayor parte de tejidos somáticos cuando son inyectadas en blastocistos, este transplante suele dar lugar a la aparición de teratomas.
Los autores analizaron también la capacidad de diferen-ciación de las células “in vivo”, mediante la inyección intravenosa de las mismas, en animales post-natales. Las célu-las ES no suelen dar lugar a “injertos” y a diferenciación “in vivo” cuando son inyectadas intravenosamente. Sin embargo tras la inyección de células AS, los autores detectaron células derivadas de las mismas en tejido hematopoyético (sangre y médula ósea, y bazo), epitelio del pulmón, hígado e intestino, tras 4-24 semanas después del transplante. Las células, fueron por tanto, capaces de migrar y diferenciarse específicamente en respuesta a factores secretados por los diferentes órganos
Así, el paradigma de que las células madre de adulto tie-nen restringida su potencialidad ha cedido ya ante la evidencia creciente de que células AS contribuyen a otros tipos celulares cuando están expuestas a las influencias del entorno apropiadas.
Uso de células madre de adulto en terapia celular
Los hallazgos relacionados con la plasticidad en el desa-rrollo de las células troncales adultas plantea con claridad que su existencia puede reemplazar el uso de células ES, y no sólo porque sean de suyo autólogas y no produzcan rechazo:
a. A una célula AS se le puede, de hecho, reprogramar para que su diferenciación se dirija hacia otros tipos celulares y salte, o se transdiferencie, a células de ca-pas embrionarias diversas. Así por ejemplo células AS de médula ósea pueden dar origen a músculo o a célu-las hepáticas17, y células musculares que pueden rege-nerar el sistema hematopoyético18. Y muy reciente-mente se ha conseguido transformar células madre hepáticas de ratón en células pancreáticas productoras de insulina19. Se han publicado numerosas revisio-nes9,14,20-24 de la presencia y diferenciación hacia otros tipos celulares de las AS.
b. Más aún, se ha identificado una célula madre en la médula ósea que es pluripotente y por tanto equivalen-te a una célula ES en cuanto a poequivalen-tencialidad. Tras un extenso crecimiento in vitro, algunas células de la médu-la ósea humana pueden dar lugar a líneas de diferentes tejidos25,26. Las células mesenquimales CD34 negativas, similares a fibroblastos, han podido aislarse de la medula ósea y de la sangre periférica, y datos preliminares mues-tran que pueden obtenerse de forma muy eficiente de la sangre del cordón umbilical27,28. Son también capaces de generar las específicas de otros tejidos tales como endotelio y cardiomiocitos29; pueden usarse en terapia génica30 y en la reconstrucción de miembros31. Un pri-mer ensayo clínico se ha efectuado usando las células madre del mesénquima de la médula ósea para el trata-miento de niños con una osteogénesis imperfecta32. c. Además, las células madre procedentes de la médula
ósea que están en circulación, tienen la misma plasti-cidad que las de la médula ósea33. “In situ” se ha podi-do demostrar en ratón que la inyección de células ma-dre hematopoyeticas (definidas funcionalmente por su capacidad de repoblar la medula ósea después de un
transplante) produjeron células de la sangre, de los con-ductos biliares, pulmón, del tracto intestinal y piel32,34,35. Se ha demostrado que las células troncales de la medula ósea de adulto pueden inyectarse en sangre y de allí emigran al cerebro, se incorporan al tejido cerebral y se diferencian a neuronas con expresión de proteínas propias de estas células; esta enorme plasticidad supone un potencial de aplicaciones clínicas como fuente alternativa de neuronas para pacientes con enfermedad neurodegenerativa del sistema nervioso36. Las células madre de tejidos adultos pueden inyectarse en distintos órganos, como corazón, músculo, hígado, pulmón o intestino, transformándose in situ en células de esos tejidos. Así se ha comprobado35,37 que células madre de médula ósea no sólo se pueden transformar en células hepáticas, sino que en experi-mentos realizadas en ratones17 pueden transformarse en células hepáticas, que en principio podrían ser útiles para tratamiento de enfermedades hepáticas degenerativas. También se ha con-seguido regenerar células cardiacas en el miocardio lesionado de ratones trasplantándoles células madre de médula ósea38; inyectadas directamente al corazón o sencillamente a la circu-lación, que no sólo se convierten en músculo cardiaco sino que se integran lentamente y llegan a ser indistinguibles y funciona-les. Posteriormente se ha mostrado que las células estaminales adultas de la médula ósea son eficaces en transplantes de cora-zón (incluso entre especies diferentes ya que no provocan re-chazo), y una vez inyectadas parecen ir directamente a las áreas dañadas y se convierten en tejido muscular del corazón, vasos sanguíneos y tejidos fibrosos39.
d. puede existir una regulación negativa activa de la dife-renciación de tejidos hacia linajes no deseados. Esta inesperada plasticidad de las células humanas des-pués del transplante abre nuevas perspectivas a la terapia con células madre de adulto. Si bien se pensó que el aislamiento y el cultivo de células madre de tejidos adultos tendrían serias limitaciones técnicas en el ser humano (con excepción de las células troncales cutáneas, de la grasa y mesenquimales), y que el uso terapéutico estaría ligado estrechamente a la posibi-lidad práctica de multiplicarlas in vitro en un modo eficiente, los trabajos citados muestran que tales dificultades son supera-bles; y sobre todo que, al menos de momento, ninguno de los experimentos de transplante han producido tumores en el orga-nismo receptor, a diferencia de las células ES.
Rejuvenecimiento de las células de adulto in vivo
Quizá el futuro se dirija más directamente hacia la restau-ración directa de las células en el organismo. Varios trabajos se han encaminado a restaurar zonas del cerebro, haciendo proli-ferar y diferenciarse in situ las células madre neurales. La sim-ple adición de un factor de crecimiento las estimula40,41; de esta forma los investigadores esperan aportar los componentes colinérgicos de las neuronas perdidas en los enfermos de Alzheimer. La infusión del factor denominado factor de crecimiento transfor-mante (alfa-TGF) a ratas con la enfermedad similar a Parkinson induce una proliferación rápida de células madre neurales, segui-da de su migración y diferenciación a neuronas, y las ratas trata-das mostraron un descenso de los síntomas42.
Otro hallazgo de gran interés es el hecho de que un trans-plante “anima” a que crezcan y se diferencien nuevas células a partir de las células madre del organismo receptor. En contra
del paradigma imperante de que el corazón no puede ser repara-do, se han encontrado nuevas células desarrolladas tras el transplante43. Una respuesta regeneradora que no se esperaba.
En resumen, podemos afirmar44 que las células madre de adulto son autoregenerativas, pluripotentes y capaces de repo-blar los tejidos en que residen y tienen capacidad después del transplante de injertarse en tejidos de diferente origen. Las cé-lulas de la médula ósea se diferencian a múltiples líneas; las condiciones de cultivo y moléculas inductoras pueden alterar el comportamiento de las células estromales de la médula ósea y el microambiente es crítico para alcanzar propiedades in vivo. Las células “reparadoras” localizadas en la médula ósea, extraí-das de un donante (o del propio paciente) pueden trasladarse al flujo sanguíneo y ayudar a regenerar cualquier tejido.
12 REV MED UNIV NAVARRA/VOL 48, Nº 1, 2004, 8-12 2 El mantenimiento de las propiedades de células madre, la
posibilidad de reprogramación y de comprometerlas, y el cami-no que siguen en la regeneración del tejido es esencial para su uso en medicina regenerativa.
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