ACADEMIA NACIONAL
T O M O LIV
DE AGRONOMIA Y VETERINARIA
ISSN 0327-8093B U E N O S A IR E S R E P U B LIC A A R G E N T IN A
C om unicación del A cadém ico de N úm ero
Dr. M.V. Bernardo J. C arrillo
Com paración de M étodos de D iagnóstico
de la Tuberculosis Bovina
S E S IO N O R D IN A R IA del
Comunicación del Académico de Número Dr'. M. V. Ber
nardo J. Carrillo*
C o m p a ra c ió n d e m é to d o s d e d ia g n ó s tic o d e la T u b e rc u lo s is
B o v in a **
La tu b e rc u lo sis bovina es una en fe rm e d a d cró nica, zoonótica, ca u sa
da por el M ycobacte rium bovis (M .bovis)
cuyo hu éspe d prim ario es el bo vino y
dive rs as esp ecie s de m am íferos. El M . b o v i s cau sa en el ganado una e n fe rm e d a d sim ilar a la tu b e rc u lo sis h u m a n a , o c a s io n a n d o p é rd id a s eco n óm icas asocia da s con una d ism i nución de la produ cción de leche y de carne, con im po rta ntes decom iso s y re striccio n e s en el co m ercio in te rn a cio n a l de anim ales vivos y productos y su b p ro d u cto s de origen anim al. Estas pé rd id as econó m icas y su im porta ncia en relación con la salu d hum an a son fa c to re s p rio rita rio s pa ra en ca ra r el con trol y errad ica ción de esta e n fe r m edad.
La A rg e n tin a ha re accio nad o fre n te a esta en fe rm eda d cró n ica y por inte rm edio del S e rvicio N acional de S an id ad A nim al (S E N A S A ), del Institu
to N acional de T e cnolo gía A g ro p e
cua ria (INTA), de U niversidad es y de A socia cio ne s de P roductores, ha ela borad o un program a nacional para el control y errad icación de esta e n fe r m edad (R esolución 115/99).
En cua nto a la S alud P ública el im pacto es m ayor en niños que c o n sum en leche cru da y en los peone s y ve te rin a rio s que están en contacto con los a n im a le s , e s ta n d o ta m b ié n e x pu e sto s los tra baja d ores de la industria de la carne.
La índole del problem a hace ne cesario llevar adelante planes de
con tro l, p a ra lo cua l es in d is p e n sa b le evalu ar la e fe ctivid ad de d ife re n te s té c nicas de d ia g nó stico que se c a ra c te ri cen por su se n sib ilid ad , se n cille z, ba jo costo y alta e sp e cificid a d que m in im i cen la po sib ilid ad de fa ls o s p o sitivo s y / o fa lsos ne ga tivos cu y a e xiste n cia se con valida por el a isla m ie n to y tipifica ció n del ba cilo p o r té cn ica s de cultivo.
En una co m u n ica ció n a n te rio r A n ales A ca d e m ia N a cion al de A g ro n o m ía y V e te rin aria T o m o Ll I -1 9 9 8 y a se ha presen ta d o un re su m en de los re s u l ta d os ob te n id os de la c o m p a ra ció n de téc n ica s in vivo e in vitro y a in d ica n d o que la prue b a de P PD - in tra d e rm o re a - cción, a pe sa r de sus in co n ve n ie n te s, seg uía sien do la té c n ic a de e le cció n pa ra el dia gnó stico de la tu b e rc u lo s is bo vin a y el sa n e a m ie n to de ro de os y que la té cn ica de E LIS A re su lta b a una b u e n a té c n ic a c o m p le m e n ta ria d e PPD, que pe rm itió la de te cció n de an im a le s en ferm os pero PPD ne gativo s y c o rta r a sí la fue nte de infe cción, lo que fa cilitó el seneam iento de los rodeos en estudio. Estos resultados serán p re se n ta d o s y actualizad os por el Dr. S erg io G arb accio en esta com un ica ció n com o inform e
final de la 1ra parte del P ro ye cto orig in al.
C om o se m encion ó o p o rtu n a m ente el P royecto co n tin u ó en su 2 da pa rte a tra vé s de la b ú sq u e d a de n u e vos an tíg e no s in m u n id o m in a n te s de
M .bovis, lo que tie n e com o p rin cip al fin a lid a d ob tener un prod u cto que re s ponda a un grado de se n sib ilid a d y especificidad que garantice en un futuro
'R e c ib id o p a ra p u b lic a c ió n e l 2 9 d e J u n io d e 2 0 0 0 .
' P r o y e c to d e in v e s tig a c ió n tin a n c ia d o p o r la A c a d e m ia N a c io n a l d e A g r o n o m ía y V e te r in a r ia (A N A V ) c o n p a r tic ip a c ió n d e l C IC V - IN T A , C a s te la r, A c a d é m ic o re s p o n s a b le D r. B e rn a rd o J. C a rrillo . In v e s tig a d o r e s e je c u to r e s d e l P r o y e c to : D r. J. P e r e ir a , D r. L. V illa , D r. S. G a rb a c c io , D ra . A lic ia A lito y D ra . C e lia A n to g n a li.
té c n ic a s de d ia g n ó stico lo s u fic ie n te m ente co n fia b le s, re d ucie ndo al m á xi mo el e rro r de co n d e n a r a anim ales fa ls o s p o sitivos. E sta pre se n ta ció n e s ta rá a ca rg o de la Dra. A licia A lito com o
in v e s tig a d o ra re sp o n sa b le de esta 2da
p a rte de l P ro ye cto original.
H ace ap roxim a dam ente un mes,
el día 6 de ab ril de 2 0 0 0 se tu vo la
o p o rtu n id a d de e scu ch a r una c o n fe re ncia del Dr. M. S a lm a n - P ro fe sor de E p id e m io lo g ía V e te rin a ria de la U ni v e rs id a d de C o lo ra d o Fort C ollins - C o lo ra d o - E E.U U . E sta co n fe re n cia qu e fu e p a tro c in a d a po r la A ca de m ia N a cio n a l de A g ro n o m ía y V e te rin a ria y p o r el C e n tro N a cion al de In ve stig a c io n e s A g r o p e c u a r ia s d e l IN T A . C a s te la r es tu vo d e s tin a d a a inform ar so b re los a va n ce s de inv e stiga ció n en tu b e rc u lo s is en los E E .U U . y su a p li ca ció n en p ro g ra m a s de contro l. Fue in te re s a n te e s c u c h a r al Dr. S alm an q u ie n en a p re ta d a sín te s is ilustró s o bre las o p c io n e s d isp o n ib le s p a ra los p ro g ra m a s de co n tro l de la tu b e rc u lo s is b o v in a y del e sta d o actu al del P ro g ra m a de C o n tro l de la T u b e rc u lo s is B o vi na en E E .U U . c o m o a sí ta m b ié n de los o b s tá c u lo s e xis te n te s p a ra e rra d ic a r la e n fe rm e d a d . In fo rm ó ta m b ié n sob re los d iv e rs o s p ro ye cto s de inv e stiga ció n en m a rch a y de los a va n ce s en té cn ica s de la b o ra to rio p a rtic u la rm e n te en as p e cto s m o le cu la res.
E sto p e rm itió re a firm a r la im p o rta n c ia de e s ta e n fe rm e d a d en sus
a sp e cto s de S a lu d P ública, con su
re n o v a d a p re s e n c ia d e b id a al S ID A y to d a s su s co n s e c u e n c ia s socia le s.
La p re s e n ta c ió n del Dr. S alm an s e r á p u b lic a d a e n A n a le s d e la A c a d e m ia N a cio n a l de A g ro n o m ía y V e te rin a ria , T o m o LIV, pe ro está ya a
d isp osició n de los S res. A ca d é m ico s que no hayan p o did o a sistir a la cita d a confere ncia .
El Dr. S alm a n e sta b a en el país c o m o e x p e rto y c o n s u lto r d e un proyecto que de sa rro lla n los In stitu tos de P a to b io lo g ía y B io te c n o lo g ía de l C N IA - INTA, C a ste la r con la A g e n c ia de E nergía A tó m ica de V ie n a (A IE A ) re la cio na d o con el m e jo ra m ie n to del d ia gnó stico de tu b e rc u lo s is b o v in a u tili z a n d o té c n ic a s b io te c n o ló g ic a s de a va n za d a e s p e c ia lm e n te P C R. E ste proyecto fu e a p ro b a d o p a ra su re a liz a
ción en el pe ríod o 2 0 0 0/2 0 0 1.
Es im po rta nte ha ce re s a lta r que com o co n s e c u e n c ia del p ro ye cto o rig i nal en tre IN TA y la A N A V d e n o m in a d o D ia gn óstic o de T u b e rc u lo s is B ovina : C o m p ara ció n de té c n ic a s in v iv o e in vitro, de los re su lta d o s o b te n id o s y del e q uip o fo rm a d o co n d ich o p ro y e c to surgió esta p ro p u e sta de a v a n z a d a que fin a lm e n te re cib e ap oyo de u na e n tid a d in te rn a cio n a l c o m o es la A g e n c ia de E n e rg ía A tó m ic a , A IE A y co n m u y bu en as pe rs p e ctiva s. R estan a c tiv id a des de ca m p o que ha brá qu e c u m p lir pa ra lo cual se está s o lic ita n d o ap oyo de la A N A V .
Es po r ello que p a re ció p e rtin e n te p re se n ta r al c u e rp o a c a d é m ic o los
re sulta d o s o b te n id o s en la 1- y 2-, pa rte
de este p ro ye cto , c o m o ta m b ié n las p o sib ilid a d e s fu tu ra s de su c o n tin u a ción con m ira s a a p o ya r al p ro g ra m a de con tro l y e rra d ic a ció n de la tu b e rc u lo s is bo vin a en que está n e m p e ñ a d a s las au to rid ade s de S E N A S A .
Comparación de Técnicas de Diagnostico de Tuberculo
sis Bovina.
P or últim o, y a con el s u e ro b o v i no y las m u estra s de ó rg a n o s d is p o n i bles en el la b oratorio , se lle vó a cab o, por un lado e lte s ts e ro ló g ic o E L IS A y s e de sa rrolló el proto co lo de b a c te rio lo g ía p a ra c o n c lu ir f in a lm e n t e c o n la tipifica ció n del m icro o rg a n ism o .
De esta m a ne ra se bu scó a b a r c a r el am plio esp acio que im p lica c o
m e nza r el análisis d e sde el a n im a l
inse rto en el s is te m a p ro d u ctivo ha sta brin da r el re su ltad o d e ta lla d o a ce rca del ág ente e tio ló g ico q ue se log ró a is lar.
Etapa de campo:
Se realizaron un tota l de (10.154) prue bas insire ctas que inclu ye ron P P D - tu b e rcu lín a y el te s t de E L IS A so b re un universo de 36 19 bo vin os in co rp o ra d o s al proyecto.
S ituació n de los e sta ble cim ie n to s afectad os al pro ye cto de in ve stigació n
RODEO TIPO DE
EXPLOTACION
TOTAL DE ANIMALES CONTROLADOS
PREVALENCIA INICIAL
PREVALENCIA AC TUAL
Suipacha 1 Tambo 202 3,5% 0%
Suipacha 2 Tambo 250 4% 1%
Suipacha 3 Cría 412 2% 0,5%
Suipacha 4 Tambo 221 1% 0%
Suipacha 5 Tambo 122 9,6% Disolución del
sistem a productivo
Suipacha 6 Tambo 501 6,2% 0,2%
Ituzaingó Cría 307 9% 0%
Gral. Belgrano Tambo 562 14% 0%
Gral. Pino Tambo 410 41% 0%
Chascomús Tambo 632 19,5% 0%
Presentación Dr. S. Garbaccio.
Introducción:
El p ro ye cto en el qu e se trabajó , cu yo títu lo fu e "D ia g nóstico de T u b e r cu lo sis bovina. C om para ción de té c n i ca in v iv o e in vitro", tu vo com o objetivo fina l e va lu a r la incorpo ración de té c n i ca s disp onib le s pa ra el m ejoram iento del d ia gn ó stico de la tub erc u lo sis bo vi na.
De esta m ane ra , el pro yecto estu vo com p ue sto por un tra ba jo de
c a m p o , que c o n s is tió en tu b e rc u
lización y to m a de m u estra s de sue ro bo vin o y un tra bajo en m a tadero, en el c u a l se re a liz ó la re c o le c c ió n de m u estra s de órg an os y la ob servación pa ra d e te rm in a r p rese n cia o no de le sio n es m a cro scó picas co m p a tib le s con esta enferm ed ad.
CUADRO 1
PRUEBAS INDIRECTAS REALIZADAS (PPD-ELISA): 10154
E s e s te c u a d r o p o d e m o s ob serv a r: en p rim e r lugar, el tip o de e xp lo ta ció n y la ca n tid a d de anim ales de c a d a una; en s e g u n d o lugar, las d istin ta s p re v a le n c ia s al m o m en to de c o m e n z a r el e stu d io y la m ism a s al fin a liz a rlo , m o s tra n d o n e ta m e n te la p o sib ilid a d que se tu v o de s a n e a r la m a yo ría de ellos.
Etapa playa de matanza:
A p a rtir de los re su ltad os o b te nid os a ca m p o , se re cogieron m uestras
en pla ya so bre un to tal de 2 40 a n im a les. Al re s p e c to c a b e s e ñ a la r, qu e aque llos b ovino s que re su ltaron n e g a ti vos a am ba s p rueb as d ia g n ó s tic a s (35) y que eran d e sca rta d o s p o r m otivo s aje no s fu e ro n m u e stre a d o s de igual m ane ra que el resto.
Las m u e stra s fu e ro n s o m e tid a s al pro to co lo de tra b a jo e s ta b le c id o en el lab ora to rio de b a c te rio lo g ía y fu e así com o se o b tu vie ro n 93 a is la m ie n to s m ic r o b ia n o s d e lo s 2 4 0 b o v in o s m u estre ad os.
C U A D R O 2
D istrib u ció n de las le sio n e s o no (S LA ) pre se n te s en dive rs os s iste m a s y re su lta d o s o b te n id o s co n am bas p ru eb as dia gnó stic a s (P P D y E LIS A ), p e rte n e c ie n te s a a n im a le s con a isla m ie n to m icro bia n o p o sitivo (93).
S IS T E M A A F E C T A D O
R e sulta do de los aislam iento ob tenidos a (P P D /E lisa) T O T A L E S
N/N N/P P/N P/P P/S
R e sp ira to rio 2 1 37 - 1 41
D ige stivo 2 2 4 - - 8
R e sp + D ig e stivo - - 6 2 2 10
S LA* 5 6 18 1 4 34
T O T A L E S 9 9 65 3 7 93
* Sin le sio n e s a p a re n te s
U n a s p e c to in te re s a n te p a ra o b s e rv a r de los a isla m ie n to s, fu e la p re s e n c ia o no de le sion es y su relación co n los re su lta d o s o b te n id o s a la p ru e ba in tra d é rm ic a y al te s t de Elisa.
T a m b ié n es im po rta nte c o n s i d e ra r a los a n im a le s ne g a tivo s a a m b a s p ru e b a s (P P D -E lisa , 35); de los
cua le s cua tro de ellos m o stra ro n le s io nes en el m o m e n to de la fa e n a y a d e m ás que en 9 caso s se re a lizó a is la m ien to ba cte rio ló g ico .
[image:5.595.32.564.370.538.2]CUADRO 3
R e su ltad os del aislam ie nto m icrobian o pa rtir de an im ales en viad o s a fa e n a tra s un re su ltad o positivo Elisa
R E S U L T A D O S E L I S A
E LIS A P ositivos 26
A isla m ie n to s de M. bo vis
5
Con respecto a 26 anim ales enviados a fa e n a por ser p o sitivo s al te s t E lisa
5 de ellos produjero n aislam iento po sitivo con p o ste rio r tip ifica ció n de M. bovis.
C o n c lu s io n e s
• Sin ser la fin a lid ad de este estudio el sa n e a m ie n to de los rodeos c o m p ro m e tid o s en él proyecto, ca b ría señalar la p o sib ilid ad que se tuvo de pode r co n tro lar esta en ferm eda d, qu eda ndo en su m ayoría a disp osición del S ervicio N a cio nal de S anidad A nim al (S E N AS A ) pa ra la obten ción del ce rtifica do de es ta b le cim ie n to libre de tu b e rc u lo sis bo vina.
• Por otro lado, los aisla m ie ntos log ra dos proven ie n te s de anim ales que no pre se n ta ro n lesio n es m a croscó pica s ap arente s (SLA) en faena; señ ala una grave fa le n cia en la individualización de los b o vin o s problem a, sigu ie nd o estos la v ía habitual de co m e rc ia liza ción sin sufrir decom iso total ni parcial. • O tra im portante observa ción, surge de los aisla m ie ntos obten idos de bo vi nos negativos a PPD y a Elisa; que ind ica una fa le n cia en la detección de
los anim a le s prob le m a del rodeo, re tra sando de esta m a n era el tra b a jo de con trol y errad icación.
• Si bien la pru eb a se ro ló g ic a E lisa no presen tó las bo nda des d e se a d a s se pudo e lim in ar anim ales prob le m a. •T e n ie n d o en cu e n ta los re su ltad os, se so licitó a la A c a d e m ia N a c io n a l de A gro nom ía y V ete rin aria, co n tin ú e a p o yando en estu dios estu dios de inte nta r m ejo rar las té cn ica s d ia g n ó stica s d is ponible s a tra vé s de la b ú sq u e d a de nuevos an tíg eno s in m u n o d om in an tes, que al incorporarlo s a dich as té cn ica s, perm itan te n e r un in cre m en to en la s e n sibilid a d y esp ecificid a d en el d ia g n ó s tico de la Tu be rculo sis bovina.
• Por últim o y sin lug ar a du da s se co n sid era que la prueb a tu b e rc u lín ic a
PPD con tinua sien do la té c n ic a de
elección para el d ia gnó stico y s a n e a m iento de esta e n fe rm eda d en los ro deos bovinos.
Id e n tific a ció n de antigenos Inm un od om inan tes de
M. bovis*
Presentación: Dra. Alicia Alito
Introducció n
*E s ta in ve stig a ció n tie n e c o m o p rin ci p a l fin a lid a d la de o b te n e r un prod ucto (a n tig e n o ) lo m ás p u rifica d o posible, q u e re sp o n d a a un g ra d o de s e n s ib ili d a d y e sp e c ific id a d que ga ra n tice en un fu tu ro té c n ic a s de d ia g n ó stico lo s u fic ie n te m e n te c o n fia b le s, re d u cie n do al m á xim o el e rro r de co n d e n a r a a n im a le s fa ls o s p o sitivo s a tu b e rc u lo sis bo vina.
La tu b e rc u lo s is b o v in a (TB B )
cu y o a g e n te e tio ló g ic o es el M .b ovis es
un a e n fe rm e d a d e n d é m ica en el país qu e no s ó lo tie n e im p a cto en la p ro d u c ció n a n im a l p o r p ro d u c ir im po rta nte s p é rd id a s sin o ta m b ié n en 1a S alud P ú b lica po r s e r una zo o n o sis.
La c a ra c te riz a c ió n de a n tíge nos m ic o b a c t e r ia n o s , in c lu y e n d o lo s
a n tíg e n o s de M .b o v is . ha sid o uno de
los p rin c ip a le s o b je tiv o s te n id o s en cu e n ta en los tra b a jo s de S eibe rt (S eibert 1934; S e ib e rt an d G len, 1941) al p ro d u c ir el d e riv a d o p ro te ico p u rifica d o (P P D ) co n la e s p e ra n z a de o b te n e r reactivos bie n d e fin id o s y e sp e cífico s p a ra se r u tiliz a d o s en p ru e b a s d ia g n ó stica s. La p ru e b a in tra d é rm ic a de tu b e rc u lin a es el m é to d o d ia g n ó s tic o g e n e ra lm e n te u tiliz a d o p a ra d e te c ta r in fe c c ió n a
M .bovis. E sta p ru e b a se b a sa en la
m e d ic ió n d e la r e s p u e s ta de
h ip e rs e n s ib ilid a d ta rd ía a la inye cció n in tra d é rm ic a de P P D de tu b e rc u lin a p re s e n ta n d o u n a b a ja e s p e c ific id a d d e b id o en p a rte a la c o m p le ja n a tu ra le z a del a n tíg e n o (P P D ) usado, el cual in clu ye v a ria s p ro te ín a s que dan re a c ció n c ru z a d a p o r s e r p ro te ín a s c o m u
nes a otras e sp ecie s de m ico b a cte ria s. (B ass J. B. Jr 1993.
El an á lisis y el e stu d io de los c o m p o n e n te s m ic o b a c te ria n o s p e rm i tie ro n lo g ra r un m e jo r e n te n d im ie n to del cu rso de la in fe cció n, del d e s a rro llo de la e n fe rm e d a d y de la re s p u e s ta in m u n o ló g ica en los a n im a le s in fe c ta dos. (Y oung, 1990) En el á m b ito de tu b e rc u lo s is h u m a n a s e h a c o m e n z a d o a p ro d u cir p ro te ín a s re c o m b in a n te s e in cluso p é p tid o s s in té tic o s d e riv a d o s de las s e c u e n c ia s de v a rio s a n tíg e n o s
m icro b a cte ria n o s de M. tu b e r c u lo s is
y se ha e n co n tra d o que son e fe c tiv o s en p ro d u cir re acción de h ip e rs e n s ib ilid a d ta rd ía en c o b a yo s, ra to n e s y en v o lu n ta rio s hu m an os. (M in de n et al. , 1986; V o rd e rm ie r et al., 1992, A s h b rid g e et al., 1992).
El inte rés d e sd e el p u n to de v is ta v e te rin a rio en lo s a n tíg e n o s de M .bovis está d irig id o p rin c ip a lm e n te al d e s a r r o llo d e m e jo r e s p r u e b a s d ia g n ó stica s en cu y o d is e ñ o se in c lu yan a n tíg e n o s bien c a ra c te riz a d o s y alta m e n te e sp ecífico s. P or lo ta n to , los m é to d o s d ia g n ó s tic o s a lte r n a tiv o s ta le s c o m o lo s s e r o ló g ic o s s i s e im p le m e n ta se n co n p ro te ín a s b ie n d e fin id a s c o rre s p o n d ie n te s a a n tíg e n o s
m ic o b a c t e r ia n o s e s p e c í f ic o s de
M .b o v is a yu d a ría n a lo g ra r un d ia g n óstico certero . E sto lle vó a p la n te a r com o ob je tivo en este tra b a jo id e n tifi c a r los a n tíg e n o s in m u n o d o m in a n te s p re se n te s en el s o b re n a n d a n te de un
cultivo de una ce p a de M .b o v is .
* C o la b o r a r o n e n e s te P r o y e c to lo s D re s . S . G a rb a c c io , V e r ó n ic a S im o n e tti, F a b ia n a B ig i, A . C a ta ld i, M a r ía C . A n to g n o li, L. V illa y J . P e r e ir a .
Materiales
a) A n im ale s
R aza: H ola n da A rg e n tina
C ate goría s: A d u lto s 29 va ca s- te rn e ro s 5
E stab le cim ie ntos: pe rten ecie n te s a la p ro vin cia de B uen os A ire s (S u ip ach a , G ral B elgrano , G ral. P intos, Lezam a y C hivilcoy).
Se c o n fo rm a ro n estos seis grupos:
GR UPO la PPD positivo
(adultos) C ultivo positivo*
GRUPO Ib PPD po sitivo
(terneros) C u ltivo po sitivo*
GR UPO lia PPD negativo
(p erte necie nte a cam po infectado)
GRUPO llb PPD negativo
C ultivo positivo
GRUPO III PPD ne gativo (cam po libre)
GR UPO El E xp erim e n ta lm e rn te infe ctados
S ue ro s ced id o s por g e ntile za del Dr. P ollock’
A is la m ie n to de m ico b a cte ria s
tip ifica d a s com o M .bovis a tra vés de
prueb as bioqu ím icas, 'la b o ra to rio s de In m u n o lo g ía d e l d e p a rta m e n to de C ie ncia s V ete rinaria s del Instituto N a cio n a l de A gricu ltu ra de Irla nda del N o r te.
b) R eactivos: a n tic u e rp o s m o n o
-clo n a le s anti M P B 70 y E S A T -6.
Métodos
a) Obtención y cuantif icación de pro teínas
Se cultivó una cep a patrón de M. bovis
(A N 5) en M id d le b ro o k 7H 9 libre de prote ína s m ás ácido pirúvico y glucosa
am bo s al 0,4% . Se incubó a 37 C
du ra n te p e río d o s va ria b le s de 6,1 2,
24/34 ; 60 ,7 5 /8 0 y 140 días. Se separó el so b re n a d a n te del extracto ce lu la r por ce n trifu g a d o y se tra tó con sulfa to de am on io al 50% . Las proteínas p re cip i ta d a s se dia lizaron con tra bu ffe r fo sfa to (pH 7.2) y se cua ntif icaron po r el m étodo del ácid o bicinchon im ico (BCA)
b) Perfil de proteínas secretadas por
M .b o v is
E le c tr o fo r e s is d e s n a t u r a liz a n t e s
(gel de p o lya crila m id a dodecíl su lfa to de sod io ele ctrop h oresis) S D S -P A G E
1 2.5% con los s o b re n a d a n te s in d ic a
dos en el ítem b y su lfa to de so d io sod iu m do de cyl su lfa te p o ly a c rila m id e gel e le ctro-pho re sis pa ra la se p a ra ció n
de las pro te ín as en el rango de 1 a 1 0 0
kDa. Se se le ccio n ó el s o b re n a d a n te de un cultivo de 3 4 días. Los m a rc a d o re s de PM utilizad o fu e ro n p a ra el p rim e ro
de los geles: p re sta in e d S D S -P A G E
am plio rango (7-209 kD a) y pa ra el s e
gundo Kaleidoscope P olypeptide
(3,8-36,4 kDa), am bos de Bío Rad. Se re a li zó tinció n con nitrato de plata.
c) Reconocim iento de proteín as a través de anticuerpos
Se efectuó a tra v é s de la té c n ic a de tra n sfe re n cia de proteína s a una m e m brana de nitrocelu lo sa (W este rn blot).
B re ve m e n te esta m e to d o lo gía c o n s is te en re alizar un S D S -P A G E o tric in a S D S -P A G E y las prote ín a s se p a ra da s en el gel son tra n sfe rid a s a una m e m b ra n a de n itro ce lu lo sa m e dian te e le c tro fo re s is (To w bin, 1979). S e utili za un b u ffe r T ris -g lic in a con te n ie n do
2 0% de m etano l. P ara v e rific a r si la
tra n s fe re n c ia ha sid o correcta , se tiñ e la m e m b ra n a con Rojo P onceau. Luego se bloqu ean con u n a so lu ció n Tris-sodio,
T w e e n 2 0 y g e la tin a (T T B S G ) in cu b á n
do la s to d a las no che p a ra e lim in a r re ac c io n e s in e specífica s. P oste rio rm en te , s e a g re g a n a la m e m b ra n a los sueros
d ilu id o s (1:1 0 0) de los an im a le s p e rte
n e cie n te s al ítem a) en T T B S G . Se los
d e ja in c u b a r d u ra n te 2 horas a te m p e
ra tu ra a m b ie n te en c o n sta n te ag itación. S e lavan las m e m b ra n a s con TT B S (3 X 10')
S e a g re g a IgG anti bo vin o c o n
ju g a d o con fo s fa ta s a a lca lin a 1 :10 0 0 en
T T B S G . S e in cu b a a te m p e ra tu ra a m
b ie n te d u ra n te 2 ho ras c o n sta n te a g i
ta c ió n . S e repiten los la va do s co n TT B S y un últim o lavado con b u ffe rd e fo s fa ta s a a lca lin a. El re ve la d o se re a liza con una
s o lu c ió n d e 5 - b r o m o - 4 c lo r o -
3 ¡n d o ly p h o s p h a te (B C IP ) y to lu id in a n itro b lu e te tra z o liu m (N B T )e n b u ffe rd e
fo s fa ta s a alca lin a . E sta re acción se
d e tie n e co n a g u a d e stila da .
d) C aracterización de las proteínas tran sferid as con anticuerpos mono-clo nales de proteín as secretadas por
M .b o v is
D os fra c c io n e s de la m e m bra na a la que se tra n firió el gel de tricin a - S D S -P A G E fu e ro n incu bad as s e p a ra
d a m e n te c o n lo s a n tic u e r p o s
m o n o c lo n a le s anti M P B 70 y anti E SA
T-6. Lu ego se las e n fre n tó a am bas con
IgG a n ti ratón co n ju g a d o co n fo sfa ta sa a lc a lin a y se re vela ro n con B C IP y NBT.
Resultados
A nálisis del perfil de proteín as del sobrenadante de una cepa de M b o v is
(AN5) a distin tos tiem pos de cultivo. a) S D S -P A G E
No se o b se rv a n in g u n a b a n d a prote ica dife re n cia l entre los m ism o s en el rango de 14 a 97 kDa. C a b ria s e ñ a la r
que a los 6 día s de c u ltivo só lo a p a re
cen las prote ín as de 21 .5 kD a y las ba nd as c o rre s p o n d ie n te s a las p ro te í nas del h e a t-sh o ck (6 0/66 kD a). A d e más, la p ro te ín a de 21.5 kD a a u m e n ta su co n ce n tra ció n con el tie m p o co s a que no su ce de con las d e m á s p ro te ín a s c u ya co n c e n tra c ió n no v a ria en los distin to s tie m p o s y ha cen su a p a rició n a
pa rtir de un c u ltivo de 12 días, (fig .1).
b) tricin a -S D S -P A G E
No se ob servan ba nda s p ro te ic a s por d eba jo de 8,4 kD a a tra v é s de to d o s los tie m p o s de cu ltivo s a n a liza d o s. E xiste se m e ja n za en la s e cre ció n de las p ro teínas m a yo rita ria s (8 ,4 ,1 4,1 6 y 25 kD a)
en los d is tin to s d ía s. La fra c c ió n
pro te ica de a p ro x im a d a m e n te 12 kD a
no se e n cu e n tra p re se n te en el cu ltivo
de 6 días.
U n a fra cció n p ro te ica de a p ro x i
m a da m ente 10 kD a se e n c u e n tra sólo
p re se n te en el s o b re n a d a n te de un cultivo de 34 días y otra de 26 kD a se e n cu e n tra p re se n te solo en los de 34 ,7 5 y 143 días (fig. 2)
R econocim iento de estas fraccion es proteicas por los sueros de los an i males que conform an los distintos grupos en:
a) Las m e m bra na s que se tra n s firie ro n los ge les S D S -P A G E
En la s m e m b r a n a s d e
nitro ce lu lo sa que se in cu b a ro n con los
sue ro s p e rte n e c ie n te s a los G rupos la
28 /29 kDa, un trip le te a los 34 kD a y las ba n da s c a ra cte rís tica s del re co no ci m ie nto de las proteína s del heat sho ck
en tre 60 /7 0 kDa. En la m e m brana
co rre sp o n d ie n te al grupo Ib el duplete e n tre 2 8 /2 9 kD a se ve só lo en el s o b re n a d a n te de 143 días.
En am bas m em branas se ob s e rv a que en las calles co rre sp o n d ie n te s a las pro te ínas del sob re n ada nte de
6 días se ve solo la ba nda c o rre sp o n
diente a 22 kDa y las de 60/70 kDa.
A d em ás en la calle corre sp on d ie nte a las p rote ínas del sob renad a nte de 143 días se observan dos banda s m as entre 34 y 50 kD a (fig. 3 y 4)
G rupo lia: un duplete entre 2 1 /2 2 kDa y otro a la altu ra de 34 kDa. M uy te n ue s se ven las prote ín as del heat sho ck (60/ 70 kDa).
Grupo llb: una única banda de a p ro xi
m ada m en te 2 2 kDa, un duple te entre
28 /29 kDa, un duple te a los 34 K Da y las ba nda s corre sp o n d ie n te s a las prote í
nas del heat shock, (fig. 5 y 6)
Grupo III: Se observan dos bandas te n u e s a la altura de 25 y 80 kDa. (fig. 7) No se de tectan d ife ren cias en la reacción an tigeno anticue rp o entre los días 12 y 143 días dentro del m ism o grupo. Ta m p o co se detecta la p rese n cia de an tig en os en las fra ccio n e s de
los sob re n ada nte s de los cu ltivo s de 6
días.
b) Las m em bra nas que se tran sfirie ron
los geles tricina-SDS-PAGE
To do s los grupos reconocen la fra cció n pro teica a la altura de 22kD a. U na proteica de ap roxim ada m en te 28 kD a es fu e rte m e n te reconocida por dos an im ales de los grupos la y Ib y dé bil m e nte re cono cida por el resto de los
an im ales de los grupos la, Ib. O tra
p ro te ín a de aproxim ada m en te 30/31 kD a es dé bilm ente reconocida por los grup os la, Ib, llb. Los sueros de los anim ales experim entalm ente infectados
recono cen el m ism o pa tró n p ro te ico
que los grup os la y Ib. U no de los
sue ros de un an im al p e rte n e cie n te al grupo la recon oció ad e m á s las fra c c io nes proteicas de 8,4 ,15 y 37 kDa. Los sue ros de los an im ales de los g ru p o s lia y III tu vie ron un patró n de re c o n o c i m iento distin to del de los a n im a le s na tu ralm e nte y e x p e rim e n ta lm e n te in fe c
tad os (fig. 8).
C a rac terizac ió n de las p ro te ín a s t r a n s f e r i d a s c o n a n t i c u e r p o s m onoclonales de proteínas secre tadas por M .b o v is .
Con el a n ticu e rp o M P B 7 0 se
obtuvo una ba nd a a la altu ra de 2 2 kD a
coin cid en te con las ob te n id a s con los sueros de los an im ales de los g ru p o s la,
Ib y llb. Con el an tic uerp o E S A T-6 se
obtuvo una ba n d a a la altu ra de 8 ,4 kD a coin cid en te con la o b te n id a con el s u e ro del anim al p e rte n e cie n te al grupo la.
Conclusiones
a) La resolución que dan los ge le s de tricin a -S D S -P A G E es m a yo r que la de S D S -P A G E 12.5% dado que p e rm itió id e ntificar fra ccio n e s p rote ica s en el rango de 14-36 kD a en los s o b re n a
dantes de los cultivo s de 6 días. C on la
aplicación de esta m etodología se puede d e c ir q ue la g ra n m a y o ría de las
proteínas de M .b o v is ya se se cre ta n a
pa rtir de los 6 días.
b) Patrón de re spu esta se m e ja n te en el reco no cim ien to de los a n tigen os p o r los an im ales infectados.
c) U tilización de los a n tige n o s M P B 70,
M P B 83 y E S A T-6 en el dise ño de un
ELISA indirecto. La p rote ína de 22 kD a reco no cida por los sue ros de los a n i males infectados puede ser o el ant ígeno M P B 70 o el M P B 83 dado que am ba s s o n r e c o n o c id a s p o r el m is m o m onoclonal utilizado.
d) A islar y c a ra cte riza r la p ro te ín a de
2 8 /3 0 kD a p re se n te en el su e ro de los a n im a le s infe ctados.
R e s u m e n
El o b je tivo de este tra b a jo fu e la d e te rm in a c ió n de a n tíg e n o s inm u no do-
m in a n te s de M .b o v is que pu die ra n se r
re co n o cid o s p o r a n ticu e rp o s bovinos. P ara p o d e r c u m p lim e n ta r este ob je tivo la p rim e ra a cció n fu e a n a liza r el perfil de las prote ín as secre ta d as po r M .bovis: A N 5 m e d ia n te g e le s (P A G E -S D S ) y p o s te rio r tin ció n con nitra to de pla ta. Los c u ltiv o s cre cie ro n en un m edio libre
d e p r o t e í n a s a 3 7 ° C d u r a n te 6,
1 2 ,2 4 ,3 4 ,8 0 y 140 días re s p e c tiv a m e n te.
S e o b se rvé que no e xistía un c o m p o r ta m ie n to d ife r e n c ia l en la s e c re c ió n de p ro te ín a s de: 7,21,5,30, 5 ,3 3 ,5 7 ,6 2 y 75,5 kDa. Se estu d ió el re c o n o c im ie n to de e sta s p ro te ín a s por los a n tic u e rp o s de a n im a le s n atura le s in fe c ta d o s m e d ia n te la té c n ic a de W e s te rn blot. S e a n a liza ro n 30 su e ro s b o vin o s. C o m o c o n tro le s se utilizaron s u e ro s b o vin o s de c a m p o s libre s de tu b e rc u lo s is y b o vin o s "con ta cto s". Los
re su ltad os o b te n id o s en el grupo PPD po sitivos cultivo p o sitivo fu e ro n m ú lti
ples e inte nsas b a n d a s que va n de 2 1 ,6
a 34 kD a y de 60 a 80 kDa. A lg u n o s sue ro s p resen ta n a n tic u e rp o s c o n tra la p rote ín a de 7 kDa. Los su e ro s de l grupo "c on ta cto " re cono cen un s im ila r n ú m e ro de b a nda p e ro en fo rm a m u ch o m e nos inte nsa. A d e m á s la in te n sid a d de la
r e a c c ió n e s m a y o r c o n lo s
s o b re n a d a n te s de m a y o r tie m p o de cultivo.
Diagnostico de Tuberculosis Bovina por la prueba PCR
Presentación: Dr. J. Pereira
P ro ye cto de Investiga ción entre el INTA, C IC V y A, la A gen cia In tern a cio n al de E ne rg ía A tó m ica (IAE A - V iena, A u stria ) y la A ca d e m ia N acio n al de A g ro n o m ía y V e te rin a ria (AN A V)
Titulo: M e jo ra m ie nto del dia gn óstico de la tu b e rc u lo sis bo vin a en b o vin os usado PCR (Arg. /5 /0 1 0 )
Periodo: 2000/2001
O bjetivos:
• D esa rro lla r y e sta nd arizar la té cn ica dire cta de am plificació n del A D N b a cte ria n o po r reacción en cad en a a tra vés de la en zim a po lim e ra sa (P C R )
• D e te rm in a r la se n sib ilid ad y esp ecificid ad de cad a prueb a a tra v é s de la c o n firm a ción de la p resen cia del m icobacterio por cultivo . A n alizar e p id e m io ló g ica m e n te los re sultad os
• R ea lizar en fo rm a co n ju n ta ensayos a nivel de cam po de PPD, E lisa y P CR y ev a lu a r la co n co rd a n cia que pu eda ha be r entre los m ism os.
R ecie n tem en te se aprobó este proyecto entre la lA E A y el IN T A -C IC V tA c o n co p articip ació n de la A N AV , re laciona do con el "M ejo ra m ie n to del d ia g n ó stico de la T u b erculo sis B ovina usando té cn icas biotecnoló gica s, en este ca so P CR a p a rtir de flu id o s b io ló gico s (leche e hisopad os nasales).
El proyecto lleva el nú m ero (Arg. /5/0 10 ). El m ism o tien e una duració n de 2 a ñ o s (2000/2001) y tiene com o lugar de trabajo los Institutos de P atib io lo gía y B iotecnología del C IC V yA -IN T A -C aste la r. Este pro ye cto ha surgido co m o co n s e c u e n c ia del proyecto original entre IN T A y la A N A V sob re técn icas de dia g nó stico de T u b e rc u losis, el cual ha se rvido para recibir el proyecto de una e n tidad in te rn a cio n a l com o la A IEA.
Para da r cu m plim ie n to con los objetivos, se ela bo ró un plan de tra b a jo que se co n cre ta rá en dos etapas.
1) S e rá la pu esta a punto en lab ora torios de la té cn ica de PCR (e sp e cia lm e n te ) y
2) S erá eva lu a r esta té cn ica con la PPD (in tra derm oreacció n) y Elisa, utiliza d a s en
el proyecto con la A cadem ia N acional de A grono m ía y V eterin aria , a nivel de rodeo s y de m aterial obten ido por aspiración ga ng lio na r en anim ales vivos y m u erto s en pla ya de fa e n a de bovinos po sitivos y negativos.
El resultado espera do es co n ta r con un m é todo rápido de detecció n de M.
b o v is que se a útil para las cam pa ñas de sa n ea m ie nto por de teccón de m a yo r ca n tid a d de an im ales positivos a TBC.
PERFIL DE PROTEINAS DEL SOBRENADANTE DE LA CEPA AN5 (M. BOVIS)
PERFIL DE PROTEINAS DEL SOBRENADANTE DE LA CEPA AN5 (M. bovis) EN GELES DE TRICINA
G
RUPO
la
kDa
M M 6d 12d 24d 34d 60d 143d
GRUPO I
b
kDa
7.0
MM 6d 12d 24d 34d 60d 143d
%
4
GRUPO lia
MM 6d 12d 24d 34d 60d IQOd 143d
GRUPO III
c.p.
GRUPO IIA
kDa
MM 6d 12d 24d 34d 60d 100d 143d
RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS A TRAVES DE SUEROS DE ANIMALES
PERTENECIENTE A LOS DISTINTOS GRUPOS
- 36400
- 26600
- 16000
- 8400
- 3800
II ia Ib llb la El Ib la llb b CNE Ib lia
