Efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la cinética de producción de amilasas por Bacillus licheniformis

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(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE. IC. A. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. N. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. Efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la cinética de producción de amilasas por Bacillus licheniformis TESIS. SI ST. PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL. DE. BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. IO. N. Autor: Br. Laura Janett Zeña Silva. DI. RE. CC. Asesor: Dr. Luis Alberto Llenque Díaz TRUJILLO --PERU. 2015. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. IC. A. Y. CO. M. RECTOR. UN IC. Dr. Orlando Gonzáles Nieves. AC IÓ. N. TRUJILLO. RM. ÁT. Dr. Rubén Vera Véliz. Dr.Weyder Portocarrero Cárdenas. VICERECTOR DE INVESTIGACIÓN. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. VICERECTOR ACADÉMICO. Dr. Esteban Ilich Zerpa. SECRETARIO GENERAL. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS. Y. CO. M. UN IC. AC IÓ. BIOLÓGICAS. IC. A. Dr. José Mostacero León. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. DECANO. SECRETARIO. Dra. Bertha Soriano Bernilla. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. Dr. William Zelada Estraver. DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. PRESENTACIÓN. UN IC. AC IÓ. N. Señores Miembros del Jurado:. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos. CO. M. de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología de la Facultad de. Y. Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración. A. y criterio el presente trabajo de tesis titulado:. ÁT. IC. “Efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la cinética de producción de. RM. amilasas por Bacillus licheniformis” con el cual pretendo obtener el Título Profesional de. AS. DE. IN FO. Biólogo Microbiólogo.. IO. N. DE. SI ST. EM. Trujillo, Diciembre de 2015. DI. RE. CC. Br. Laura Janett Zeña Silva. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MIEMBROS DEL JURADO. Los suscritos, miembros del jurado, declaran que la presente tesis ha sido ejecutada en. AC IÓ. N. concordancia con las normas de la Escuela Académico Profesional de Microbiología y. Y. CO. M. UN IC. Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.. IC. A. _________________________________. ÁT. Ms. C. Anibal Quintana Diaz. AS. DE. IN FO. RM. PRESIDENTE. Dr. Luis Llenque Díaz SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. _________________________________. _________________________________ Ms. C. Miguel Muñoz Rios VOCAL. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el presente. AC IÓ. N. Informe de Tesis titulado: “Efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la. UN IC. cinética de producción de amilasas por Bacillus licheniformis”, ha cumplido con los. Y. CO. M. requisitos formales y fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.. IC. A. _________________________________. ÁT. Ms. C. Anibal Quintana Diaz. AS. DE. IN FO. RM. PRESIDENTE. Dr. Luis Llenque Díaz SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. _________________________________. _________________________________ Ms. C. Miguel Muñoz Rios VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CERTIFICACION DEL ASESOR. AC IÓ. N. El que suscribe, profesor asesor de la tesis titulada:. UN IC. “Efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la cinética de producción de. Y. CO. M. amilasas por Bacillus licheniformis”. IC. A. Que ha sido desarrollada, de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de Ciencias. ÁT. Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en conformidad con su. RM. correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las observaciones. DE. IN FO. y sugerencias alcanzadas.. AS. Por lo tanto, autorizo a Laura Janett Zeña Silva continuar con el trámite del. SI ST. EM. reglamento correspondiente.. CC. IO. N. DE. Trujillo, Diciembre de 2015. RE. _________________________________. DI. Dr. Luis Alberto Llenque Díaz ASESOR. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIAS. AC IÓ. N. A Dios Por estar conmigo en cada paso que doy, cuidándome y dándome fuerzas para. UN IC. seguir adelante y no desalentarme en el intento, por haberme dado salud para lograr. ÁT. IC. A. Y. CO. M. mis objetivos y permitido llegar a este momento tan importante de mi vida profesional.. RM. A mi madre Laura. IN FO. Por ser el pilar más fundamental en mi vida, por sus consejos, comprensión,. DE. amor, valores, apoyo incondicional en todo momento y por la confianza puesta en mí. AS. para hacer posible la culminación de mi carrera profesional. ¡Gracias por estar. A mis hermanos: Abraham y Karen. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. siempre conmigo!. RE. Por estar a mi lado y compartir momentos, sus risas, ocurrencias y cada reto que. DI. se me presenta.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A mi abuelito Humberto. AC IÓ. N. A quien admiro porque es un ejemplo de esfuerzo y sacrificio, a no darse por. CO. M. UN IC. vencido ante cualquier dificultad, gracias por tus consejos y apoyo incondicional.. IC. A. Y. A mis Tías: Carmen y Lucinda. ÁT. Por estar a mi lado, que con su apoyo y consejos me orientan a seguir adelante. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. con optimismo y confianza en mí.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AGRADECIMIENTO. AC IÓ. N. A mi asesor, Dr. Luis Alberto Llenque Díaz, por brindarme su tiempo, apoyo y dedicación, así como las sugerencias constructivas durante el desarrollo de la presente. UN IC. investigación, además por brindarme su amistad y conocimientos académicos durante mi. CO. M. formación profesional.. A. Y. A mis amigos, por estar conmigo todo este tiempo y compartir experiencias,. ÁT. IC. conocimientos, momentos alegres y tristes. Gracias por ser mis amigos y recuerden que. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. siempre los llevare en mi corazón.. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INDICE. AC IÓ. N. Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo………………………….……….ii. UN IC. Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas……………………….………….. iii. M. Presentación…………………………………………………….………….………......iv. Y. CO. Miembros del jurado………………………………………………………..……….…v. IC. A. Aprobación………………………………………………...……………….………..…vi. RM. ÁT. Certificación del Asesor…………………………………...…….………….…...……..vii. IN FO. Dedicatoria………………………………………………………...……….…………..viii. DE. Agradecimiento………………..………………………….….………………………...x. EM. AS. Índice…..…………………………………………………….…………………….…...xi. SI ST. Resumen…………………………………………………………………………......... xiii. DE. INTRODUCCIÓN…………………….……………………………………………......1. N. Objetivos…………………………………………………………………………....…..9. CC. IO. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………….10. RE. 1. Material biológico……………………………………………………..………........10. DI. 2. Procedimiento……………………………………………….……….……………..10 2.1. Reactivacion del cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15……….……….10 2.1.1 Determinación de la pureza de las colonias…………………………...10. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.2 Verificación de la capacidad degradativa de almidón por Bacillus licheniformis FGM-A15………………………………….10. AC IÓ. N. 2.2. Construcción de biorreactores……………………………………………....11 2.3. Preparación del inóculo…………..….…………………..……..…….....…11. UN IC. 2.4. Sistemas de ensayo para la evaluación de la producción de…………………11. M. amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15. Y. CO. 2.4.1 Sistema de ensayo Problema: ………………………………………11. ÁT. IC. A. 2.4.2 Sistema de ensayo Control: …………………………………………12. RM. 2.4.3 Monitoreo: …………………………………………………………..12. IN FO. 2.5.Determinación de la actividad catalítica……..........…………...…….……...12. DE. 2.6. Medición del Almidón Residual.…………...………….…..…………….....13. AS. 2.7 Elaboración de la curva estándar de almidón...………………..………......13. EM. 2.8 Determinación de la producción de amilasas. SI ST. (Unidades de actividad amilólítica)……………..………….….…………….14. DE. 2.9 Analisis de resultados……………………………………………………………...14. IO. N. RESULTADOS………………………………………………………………………..15. CC. DISCUSIÓN…………………………………………………………………..….......17. DI. RE. CONCLUSIONES…………………………………………………….………...……..22 RECOMENDACIONES……………………………………………………….……....23 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………….....……...24 ANEXOS………………………………………………………………………...……..30. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. AC IÓ. N. El presente trabajo de investigación tuvo como objetivo de establecer el efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la cinética de producción de amilasas por B. licheniformis en. UN IC. un biorreactor agitado hasta las 72 horas de incubación, utilizando como control el almidón. M. químicamente puro (q.p.). El cultivo bacteriano fue reactivado mediante siembra en placas. CO. con agar almidón 0.5% e incubadas a 37°C por 24h; al mismo tiempo se verificó la. A. Y. capacidad hidrolítica mediante la prueba de lugol, y pureza con coloración Gram. A partir. ÁT. IC. del cultivo reactivado se preparó una suspensión bacteriana (inóculo) equivalente al tubo. RM. N° 3 del nefelómetro de Mc Farland (9.0 x 108 UFC/mL) con SSFE. Luego, se agregó. IN FO. 20mL del inóculo estandarizado a cada biorreactor (Problema y Control) conteniendo 180mL de caldo almidón 0.5% - buffer fosfato 0.2 M, pH 6.0, suplementado con sales:. DE. (NH4)2SO4, CaCl2 y CuSO4. Seguidamente, se puso en funcionamiento e incubó a 40°C. Se. EM. AS. determinó la producción de amilasas a las 0, 12, 24, 36, 48, 60 y 72h, extrayendo 10 mL de. SI ST. muestra del biorreactor, que fue centrifugado a 2500 rpm por 10 min. En cada sobrenadante (extracto enzimático) se determinó la cantidad de amilasas producidas en. DE. relación al tiempo de incubación, midiendo la actividad amilásica (unidades. IO. N. enzimáticas/mL) sobre almidón q.p. a 50 °C, pH 6.0, por 1h a través de la dosificación del. CC. almidón residual en el espectrofotómetro a 580nm, relacionando con la curva patrón de. RE. almidón. El almidón comercial de Zea mays permitió obtener una producción de amilasas. DI. por Bacillus licheniformis FGM-A15 en forma creciente desde las 0h hasta las 72h con una. tendencia logarítmica y una producción máxima de 0.0426 UA/mL a las 72h, pero que estadísticamente dichas producciones son similares en comparación con el sistema control.. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. INTRODUCCIÓN. N. El almidón es sintetizado y almacenado como fuente de energía en plantas. AC IÓ. superiores, constituyendo un polisacárido de reserva que está distribuido tanto en las. UN IC. raíces, tallos y hojas, encontrándose más abundantemente en las semillas de los cereales y en los tubérculos como las patatas, camote, yuca, etc. en forma de gránulos intracelulares. CO. M. compactos. Dicha estructura puede ser explicado en términos de la fuerza de atracción. Y. entre las largas moléculas de carbohidratos, y dentro de los gránulos se dispone. IC. A. radialmente en capas concéntricas, una mezcla de moléculas lineales y ramificadas y. ÁT. cuando hay asociaciones paralelas entre estas, se juntan por puente de hidrogeno lo que. IN FO. RM. resultan en regiones cristalinas o micelas, lo cual causa que el granulo sea birrefringente y evita su disolución en agua fría por la formación de una malla molecular que mantiene. 1. EM. AS. aplica una energía suficiente .. DE. juntos los gránulos. Estas fuerzas asociadas entre las moléculas pueden ser vencidas si se. SI ST. El almidón, después de la celulosa, es el segundo hidrato de carbono más abundante en la biosfera. Aunque el contenido de almidón en los vegetales varía según la fuente de. DE. obtención, la más importante son los cereales (maíz, arroz, trigo) con un contenido. IO. N. aproximado de 30-80%, en leguminosas (frijol, arveja, haba) un 25-50% y en tubérculos. CC. (papa, yuca) representa un 60-90% de la materia seca. De la producción mundial de. RE. almidón aproximadamente el 83% es obtenido del maíz; después, la fuente más importante. DI. es el trigo con un 7%, y papa con un 6%2. La producción industrial ha desarrollado técnicas de aprovechamiento de recursos o residuos de producción de diversas industrias con el objeto de adquirir enzimas utilizando sustratos de bajo costo, así como los desechos agrícolas3.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. El uso de las enzimas convierten a los procesos en eficientes y menos costosos; en muchos casos, tienen un alto grado de especificidad y adaptabilidad (suaves condiciones de trabajo); mientras que en otros, se logra más material procesado con el mismo equipo y. AC IÓ. N. menos consumo de energía. En la industria alimentaria, las enzimas hidrolíticas nos ofrece. UN IC. la ventaja de reducir viscosidad (hidrólisis), mejorar las extracciones (degradación de pectina), hacer bioconversiones (glucosa a fructosa), causar separaciones (separación del. CO. M. suero en queso), sustituir ingredientes y coadyuvantes en procesos, ahorrar con procesos. Y. más eficientes obteniendo menos subproductos indeseados y mayor capacidad de planta. A. con un incremento de rendimiento de producto, ganancia y mejorar propiedades deseables. RM. ÁT. IC. obteniendo un producto único, jarabe de alta concentración de fructosa4.. IN FO. Una de las propiedades características de las enzimas es su capacidad de catalizar ciertas reacciones químicas bien definidas y su presencia se detecta, en general, por la. DE. reacción que cataliza; y la cantidad de la misma se estima a partir de la velocidad de la. AS. reacción; en este sentido, las amilasas son enzimas que degradan el almidón dando como. EM. productos dextrinas y polímeros compuestos progresivamente por unidades de glucosa4,. SI ST. que tienen numerosas aplicaciones biotecnológicas, un ejemplo de ello es la producción de. DE. jarabes, que contienen oligosacáridos como maltosa y glucosa. Las otras propiedades y los. N. mecanismos de acción de las amilasas dependen del origen de las mismas, generalmente. CC. IO. las α- amilasas son estables entre pH 5.5 y 8.0 en presencia de un componente de calcio. DI. RE. con un óptimo entre 4.8 y 6.51. Las amilasas están incluidas en una familia de enzimas hidrolíticas compuesta por:. α-amilasa, β-amilasa, glucoamilasa e isoamilasa, que se encuentran ampliamente distribuidas en tejidos vegetales, donde juegan un rol muy importante en la degradación del almidón en la germinación de las semillas; en tejidos animales, cumpliendo una misión 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. digestiva; y en diversas especies de microorganismos como hongos y bacterias5. Las αamilasas provenientes de hongos y bacterias son las más utilizadas en el sector industrial por sus múltiples ventajas: fácil disponibilidad, volumen de producción, estabilidad de. AC IÓ. N. operación, modificación y optimización del proceso6. La termoestabilidad de esta enzima,. UN IC. industrialmente, ha hecho que las amilasas tengan gran aplicabilidad en diversos procesos4. El principal producto final de la acción de la glucoamilasa sobre el almidón es. CO. M. glucosa, lo que la diferencia claramente de la α y β amilasas. La enzima también produce. Y. pequeñas cantidades de oligosacáridos. La sacarificación del almidón puede alcanzar hasta. IC. A. 96% de dextrosa. La acción de la enzima causa inversión de la configuración, produciendo. RM. ÁT. β-glucosa. Las glucoamilasas son inactivas sobre almidón nativo y su actividad es máxima. IN FO. entre pH 4.0 y 5.5, y temperatura alrededor de 55-65 °C. La tasa de reacción cae rápidamente a medida que disminuye el tamaño de la molécula de sustrato, siendo máxima. DE. sobre almidones previamente sometidos a licuefacción7.. AS. La α -amilasa o α -1,4-glucohidrolasa catalizan la etapa de hidrólisis de los enlaces. SI ST. EM. α-1-4 del almidón y los oligosacáridos, liberando moléculas de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. Los enlaces ramificados α-1-4 también se hidrolizan, pero mucho. DE. más lentamente, formándose un jarabe de glucosa cuyo contenido de glucosa es 95 a 97 %. IO. N. en peso y de un 30 a 5 % de oligosacáridos grandes. La glucosa formada se utiliza como. CC. jarabe o se cristaliza para obtener glucosa pura sólida. Se usa a gran escala en la industria. RE. de procesado del almidón en tanques discontinuos a 55-60 °C y pH de 4.5 y con períodos. DI. de incubación de 48-92 horas. El calcio la estabiliza frente a la desnaturalización por el calor o los álcalis, y la hidrólisis puede llevarse a cabo fácilmente añadiendo el enzima soluble al almidón una vez que la α-amilasa ha realizado del 15 al 30 % de la hidrólisis posible. La α-amilasa bacteriana hidroliza el enlace glucosídico interno dando lugar a 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. productos de bajo peso molecular, solubles y menos viscosos, cuya ruptura está limitada por la presencia de los enlaces glucosídicos a-1-6 en los puntos de ramificación de la molécula del almidón nativo (amilopectina). Los productos de hidrólisis tienen. AC IÓ. N. configuración a en la glucosa del extremo reductor. Se piensa que la enzima actúa por la. UN IC. acción combinada de los grupos carboxilo e histidina del centro activo. Las α-amilasas obtenidas de Bacillus subtilis var amyloquefaciens tienen un ion calcio fuertemente ligado. CO. M. por molécula, que es necesario para la actividad del enzima y que lo estabiliza en gran. Y. medida frente al calentamiento. Se utiliza como enzima soluble en tratamientos de dos. IC. A. horas a 85 °C y pH 5,5-7 como una alternativa a la utilización de ácido clorhídrico que. ÁT. produce excesivos compuestos coloreados y la formación de productos de reversión.. RM. Debido a que los almidones de patata y de cereales cerosos no pueden tratarse por. IN FO. gelatinización, se les somete a un proceso en dos etapas, en el que se añade una segunda. DE. dosis de enzima y se continúa el tratamiento hasta lograr el contenido deseado de glucosa8.. AS. El principal género bacteriano productor de amilasas es Bacillus y dentro de las. EM. especies registradas tenemos a Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, B.. SI ST. subtilis y Bacillus amyloliquefacien, quienes son aplicados en procesos industriales para. DE. alimentos, textiles, fermentación, papelería entre otros9 por sus amplios rangos de. N. operación de temperatura (25-90°C), resistencia a pH extremos (1.0-11.5) y altos niveles. CC. IO. de expresión6. Por su parte, la amilasa de Bacilllus licheniformis tiene un pH óptimo de 5.0. RE. a 8.0, temperatura optima de 76°C y un peso molecular de 2.25 x 104 Kd1, producen. DI. complejos amilolíticos para hidrólizar almidón con el fin de mejorar el desarrollo de este proceso industriales10. La inducción de amilasa tipo α requiere un sustrato que contenga. enlaces α-1,4 glucosídicos, además de maltosa, dextrina y almidón, y la glucosa, producto final de la hidrólisis tiene la posibilidad de reprimir la síntesis de enzima como un. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. mecanismo conocido como represión catabólica11 e inactivada a un pH en el rango de 4.8 5.0 y estable entre 6.0 y 7.0 12.. N. La enzima β-amilasa actúa en la reacción de hidrólisis de los enlaces β-1,4-. AC IÓ. glucosidicos del almidón con inversión en la configuración del carbono 1 pasándolo de la. UN IC. configuración α- a la β; así como de remover las unidades de maltosa continuas presentes en los terminales no-reductores de la cadena polisacárido. Los grupos sulfihidrilos son. CO. M. esenciales para la actividad, por lo que la enzima se inactiva por oxidación, por los metales. Y. pesados y sus sales. Su producto es beta-maltosa. Ha sido descrita como una proteína. IC. A. abundante la cual se puede encontrar en grandes cantidades tanto en tejidos de. ÁT. almacenamiento de almidón y órganos de plantas. Muchos cereales contienen también la. IN FO. RM. enzima β-amilasa y α-amilasa aunque esta última en concentraciones menores, tan solo ocupa aproximadamente 30% de contenido total de proteínas sintetizadas durante la. DE. germinación. Estas dos amilasas pueden ser distinguidas una de otra, mediante el punto de. AS. inactivación que presentan a un pH determinado. Es estable en un rango de pH entre 4.8 -. SI ST. EM. 5.0 e inactivada alrededor de 6.0-7.013. Mediante un estudio de bioprospección microbiana en Colombia, se ha tratado de. DE. identificar las potencialidades de la flora microbiana presente en los diversos nichos. IO. N. ecológicos del mundo, que posibiliten la formación de industrias productoras de enzimas y. CC. las industrias derivadas de su aplicación; para lo cual se estudió el efecto que presentan. RE. diferentes fuentes de carbono en la expresión de dicha enzima, de los cultivos estudiados. DI. se seleccionó a Bacillus sp como la que presentó mayor halo de hidrolisis en la prueba de lugol estableciéndose que presentaba mayor actividad amilolítica. Las modificaciones de la fuente de carbono del medio estándar seleccionado utilizando almidón, glucosa y dextrina en una cantidad de 1 g/L permitieron establecer que el comportamiento de las cepas 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. seleccionadas cuando se utiliza un medio de cultivo con almidón o dextrina como fuente de carbono es similar; es decir, al realizar la electroforesis de las respectivas muestras de las fermentaciones realizadas, se observó que las proteínas presentes en el medio de cultivo. AC IÓ. N. modificado con almidón son exactamente las mismas que se expresan en el medio de. UN IC. cultivo modificado con dextrina14.. En un estudio de investigación se dio a conocer la cinética de crecimiento del. CO. M. Bacillus subtilis ATCC 6633 como microorganismo productor de α-amilasa utilizando. Y. como medio de cultivo cáscaras de Solanum tuberosum (papa). El experimento se realizó. IC. A. por triplicado a las mismas condiciones de temperatura y pH. A cada muestra se le. ÁT. determinó el pH, biomasa por el método turbidimétrico, azucares totales por el método del. IN FO. RM. fenol-sulfúrico y la actividad enzimática de la α-amilasa por el método del lugol. Al realizar la cinética de crecimiento, se determinó el rendimiento máximo de la α-amilasa el. DE. cual se lleva a cabo en un tiempo de 48 horas después de haber iniciado el proceso de. AS. fermentación, hidrolizando así 1.0531 mg/mL de almidón proveniente de cascaras de. SI ST. EM. papa15.. El crecimiento bacteriano se considera como el aumento ordenado de todos los. DE. constituyentes químicos que conduce a un aumento en el número de individuos en una. IO. N. población, dicho crecimiento se puede subdividir en sistemas cerrados, como el cultivo. CC. intermitente, y en sistemas abiertos, como el cultivo alimentado por lotes y el cultivo. RE. continuo; entonces, cuando en un medio de cultivo las bacterias viables tienen los. DI. nutrientes necesarios (por ejemplo almidón) y adecuadas condiciones ambientales (oxígeno, pH, temperatura, etc.) activan su genética, para la síntesis de material enzimático (amilasas) requerido, y el metabolismo mediante la rutas metabólicas que permiten. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. posteriormente su crecimiento y desarrollo, pero que la enzimas secretadas permanecen en los sistemas de incubación16.. N. Las bacterias utilizadas en los procesos productivos requieren de un alto grado de. AC IÓ. adaptabilidad para responder a cambios físicos y químicos, que repercute en su conjunto a. UN IC. las diferentes actividades metabólicas; por lo que en la naturaleza son capaces de existir poblaciones con una variedad de estados fisiológicos, y pueden cambiar rápidamente de un. CO. M. estado a otro de acuerdo a la presencia o no de nutrientes. Por tanto, el conocimiento de la. Y. cinética de crecimiento y de producción de enzimas en un determinado sistema permiten la. IC. A. predicción del transcurso del proceso, medir las velocidades, rendimientos y. ÁT. productividades, al mismo tiempo que entrega información útil para establecer las. IN FO. RM. estrategias de producción y optimización del proceso en general17. El comportamiento cinético de una población está determinado por un conjunto de. DE. factores genéticos y ambientales. Entre estos últimos destacan las condiciones de operación. EM. AS. (composición del medio, temperatura, pH y otras) y la modalidad de cultivo entre las que. SI ST. distinguimos el cultivo por lotes y el cultivo por lotes alimentados o semicontinuo. El cultivo por lotes se define como aquel que se realiza sin intercambio de materia con los. DE. alrededores, salvo lo referente a los gases (aireación, producción de dióxido de carbono y. IO. N. otros) que se suministran y retiran del sistema en forma continua. En esta modalidad de. CC. cultivo se adicionan inicialmente los nutrientes y luego se inocula con una determinada. RE. cantidad de células viables, que produce una serie de eventos característicos denominada. DI. curva de crecimiento, la cual se representa por una gráfica del peso seco celular o biomasa o metabolito de interés (enzimas) contra el tiempo de incubación en horas1. Al comparar la producción de α-amilasa termoestable a partir de almidón, empleando. una cepa autóctona de Thermus sp., en cultivo discontinuo, el mismo que se llevó a cabo 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. en medio PAP-2 modificado por la adición de almidón de maíz a 3.024g/L, los resultados obtenidos en el fermentador, reportaron mayor eficiencia debido a concentración de la fuente de carbono, oxigenación y temperatura; lo que permitió mejor aprovechamiento del. AC IÓ. N. sustrato. La máxima producción de α-amilasa que se obtuvo con células inmovilizadas en. UN IC. un fermentador con 1L de caldo de cultivo (cultivo fluidizado), a las 24 horas de fermentación fue de 360.97UA/min/L y 149.09 de actividad específica, mientras que, fue. CO. M. de 60.31UA/min/L y 18.40 de actividad específica, obtenida en fermentador con 10L de. Y. volumen de trabajo a las 14h18.. IC. A. El uso de las amilasas en la industria de biocombustibles constituye una alternativa. RM. ÁT. para la obtención de jarabes de glucosa necesarios para la fermentación alcohólica. IN FO. posterior; en forma paralela se sabe que las bacterias excretan amilasas al medio de cultivo con el afán de hidrolizar los sustratos amiláceos presentes, constituyendo comercialmente. DE. los extractos enzimáticos que pueden ser utilizados en la industria a gran escala. Por otro. AS. lado, la implementación de plantas de producción de alcohol carburante de primera. EM. generación a partir de sacarosa en nuestra región geográfica, nos alienta a proponer la. SI ST. transformación de los otros productos amiláceos como materia prima alternativa para los. DE. procesos de hidrólisis mediante la acción de amilasas bacterianas capaces de hidrolizarlos. N. hasta oligosacaridos, maltosa o glucosa. En este sentido, se pretendió evaluar la capacidad. CC. IO. hidrolítica de B. licheniformis FGM-A15, aislado de efluentes de curtiembres, en un. RE. biorreactor agitado y proponerlo como alternativa para la degradación de residuos. DI. amiláceos a través de la producción de amilasa en cultivo sumergido. Así mismo permitirá identificar algunos parámetros cinéticos particulares de crecimiento para ser empleados en la producción comercial de amilasas, que está directamente relacionado con la economía del proceso industrial.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. OBJETIVO(S). AC IÓ. N. General:. UN IC. 1. Establecer el efecto del almidón comercial de Zea mays sobre la cinética de producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 en un biorreactor agitado. A. Y. CO. M. hasta las 72h de incubación.. ÁT. IC. Específicos:. RM. 1. Determinar la produccion de amilasas (unidades enzimáticas/mL) por B. licheniformis. IN FO. FGM- A15 a las 0, 12, 24, 36, 48, 60 y 72h en cada uno de los biorreactores agitados.. DE. 2. Describir la cinética de producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15. AS. hasta las 72h de incubación en un biorreactor agitado con el almidón comercial de Zea. EM. mays y el almidón químicamente puro.. SI ST. 3. Comparar la producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 hasta las. DE. 72h de incubación en un biorreactor agitado utilizando el almidón comercial de Zea. DI. RE. CC. IO. N. mays y el almidón químicamente puro en las condiciones de ensayo.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS. AC IÓ. N. 1. MATERIAL BIOLÓGICO Cultivo de Bacillus licheniformis FGM-A15, proporcionado por el Laboratorio de. UN IC. Fisiología y Genética Microbiana, con capacidad amilolítica aislado de residuos de. CO. M. efluente de curtiembre19 (ANEXO 1).. Y. Almidón de féculas de Zea mays comercial “Maizena Duryea” (ANEXO 2).. RM. ÁT. IC. A. Almidón químicamente puro “Riedel-de Haën”. IN FO. 2. PROCEDIMIENTO. 2.1. REACTIVACIÓN DEL CULTIVO DE Bacillus licheniformis FGM-A15. DE. El cultivo puro fue reactivado mediante siembra por estría en placas. AS. conteniendo agar almidón 0.5% (ANEXO 3), luego se procedió a incubar a. SI ST. EM. 37ºC por 24h.. A partir del cultivo reactivado se realizó una coloración Gram, y posterior observación microscópica. (ANEXO 4). 2.1.2 VERIFICACIÓN DE LA CAPACIDAD DEGRADATIVA DE ALMIDÓN POR Bacillus licheniformis FGM-A15. DI. RE. CC. IO. N. DE. 2.1.1 DETERMINACIÓN DE LA PUREZA DE LAS COLONIAS. Luego de haber reactivado el cultivo Se verificó la capacidad degradativa del almidón por Bacillus licheniformis FGM-A15, sembrando por puntura en placa conteniendo 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. agar almidón 0.5% y se incubó a 37ºC por 48h. Posteriormente se agregó la solución de lugol (ANEXO 5), y se observó el halo neto de. N. hidrolisis del almidón alrededor de las colonias (ANEXO 6).. AC IÓ. 2.2 CONSTRUCCIÓN DE BIORREACTORES. UN IC. Se construyeron 02 biorreactores con frascos de vidrio de 400 mL, se. M. acondicionó 04 “bafles”, un motor de 6V y un agitador tipo Roushton a cada. CO. uno20 (ANEXO 7). Los biorreactores y accesorios fueron esterilizados,. A. Y. haciendo uso de hipoclorito de sodio (lejía comercial) al 2.5 % por 30. ÁT. IC. minutos, y luego irradiados con luz ultravioleta de una lámpara de 300 Watt,. RM. a una distancia de 30 cm por 60 minutos21.. IN FO. 2.3 PREPARACIÓN DEL INÓCULO. DE. A partir del cultivo reactivado se sembró en agar almidón 0.5% y se incubó a. AS. 37°C por 12h. A partir de las colonias formadas (ANEXO 8), se preparó una. EM. suspensión bacteriana utilizando solución salina fisiológica estéril equivalente. DE. SI ST. al tubo Nº3 (9.0x108 UFC/mL) del nefelómetro de Mc Farland22 (ANEXO 9).. 2.4 SISTEMAS DE ENSAYO PARA LA EVALUACION DE LA. DI. RE. CC. IO. N. PRODUCCIÓN DE AMILASAS POR Bacillus licheniformis FGM-A15 2.4.1 Sistema de ensayo Problema: En el biorreactor se colocó 180 mL de una solución de caldo almidón comercial 0.5% - buffer fosfato 0.2 M a pH 6.0, suplementado con (NH4)2SO4, CaCl2 y CuSO4 (ANEXO 10), luego se agregó 20 mL de inóculo estandarizado de 9.0x108UFC/mL 11. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. (ANEXO 11), seguidamente, se puso en funcionamiento, con una agitación de 200 rpm aproximadamente, y se incubó a 40°C. N. (ANEXO 12).. AC IÓ. 2.4.2 Sistema de ensayo Control:. UN IC. En el biorreactor se colocó 180 mL de una solución de caldo almidón soluble químicamente puro 0.5 % - buffer fosfato 0.2 M a. CO. M. pH 6.0, suplementado con (NH4)2SO4, CaCl2 y CuSO4 (ANEXO 10),. Y. luego se agregó 20 mL de inóculo estandarizado (9.0x108UFC/mL). IC. A. (ANEXO 11), seguidamente, se puso en funcionamiento, con una. DE. 2.4.3 Monitoreo. IN FO. (ANEXO 12).. RM. ÁT. agitación de 200 rpm aproximadamente, y se incubó a 40°C. AS. A los tiempos 0, 12, 24, 36, 48, 60 y 72h, se extrajo 10 mL de. EM. muestra del biorreactor (ANEXO 13), y se centrifugó a 2500 rpm. SI ST. por 10 minutos (ANEXO 14). El sobrenadante (extracto enzimático). producidas en relación al tiempo de incubación (ANEXO 15). Este procedimiento se repitió para cada sistema de ensayo.. 2.5 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD CATALITICA. DI. RE. CC. IO. N. DE. se conservó en refrigeración hasta la medición de las amilasas. En un tubo de ensayo, se colocó 1.0 mL de disolución de almidón 0.1% buffer fosfato 0.2 M pH 6.0 y 1.0 mL de extracto de enzimas, se. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. homogeneizó manualmente, e incubó a 50 °C por 1h (ANEXO 16). Posteriormente se calentó a 80°C por 5 min.. N. Se trabajó con un tubo Control, colocando 1 ml de buffer fosfato y 1.0 mL de. AC IÓ. extracto de enzima, calentado a 80 °C, y se incubó en las mismas. UN IC. condiciones, para cuantificar la cantidad de almidón residual presente en el. CO. Y. 2.6 MEDICIÓN DEL ALMIDÓN RESIDUAL. M. extracto de enzimas.. IC. A. En otro tubo de ensayo, se colocó 0.5mL del inactivado con 0.1mL de. ÁT. solución yodada (ANEXO 17), y 0.4 mL de agua destilada. Las lecturas de. RM. las absorbancias (Problema), se realizaron en el espectrofotómetro. IN FO. (Spectronic 20) a una longitud de onda de 580nm (ANEXO 18).. DE. Para determinar los miligramos (mg) de almidón residual, se multiplicó la. AS. absorbancia problema corregida por el factor de conversión, y por la dilución. EM. realizada, antes de realizar la lectura de la absorbancia en el. SI ST. espectrofotómetro.. DI. RE. CC. IO. N. DE. 2.7 ELABORACIÓN DE LA CURVA ESTANDAR DE ALMIDÓN Se trabajó con solución de almidón a una concentración de 0.1mg/mL. Se colocó 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 y 0.6mL, en tubos de ensayo, respectivamente; se aforó a 1.0 mL con agua destilada; luego se agregó a cada tubo, 0.5mL de HCl 0.01M y 0.1mL de solución yodada (I2/KI). Para el blanco de reactivo, se trabajó con 1.0 mL de agua destilada. Por último se procedió a realizar las lecturas en el espectrofotómetro (ANEXO 19).. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Finalmente, se determinó el factor de conversión para determinar almidón por. AC IÓ. N. espectrofotometría.. (UNIDADES DE ACTIVIDAD AMILOLÍTICA). UN IC. 2.8 DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE AMILASAS. CO. M. Una unidad de actividad amilolítica (UA) se definió como la cantidad de. Y. amilasas necesarias para hidrolizar 10mg de almidón en 30 minutos, a 50 °C,. IC. A. a pH de ensayo, expresados como UA/mL (ANEXO 20-24).. ÁT. La cantidad de almidón hidrolizado, se calculó a partir de la diferencia entre. RM. el almidón inicial incubado y el almidón residual, después de la actividad. IN FO. catalítica.. DE. Para calcular las UA/mL, se dividió la cantidad de almidon hidrolizado. AS. calculado entre 10.. ANALISIS DE RESULTADOS. SI ST. EM. 2.9. La producción de amilasas (UA/mL) por Bacillus licheniformis FGM-A15, en. DE. cada uno de los sistemas de ensayo (Control y Problema) fueron analizados. independientes y determinar si existe o no diferencia significativa entre los resultados obtenidos en cada sistema de ensayo.. DI. RE. CC. IO. N. mediante la comparación de medias, ANOVA y prueba T para muestras. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. AC IÓ. N. En la Figura 1, se observa la producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 con relación al tiempo, a partir de las 0 h hasta las 72 h de incubación en cada uno de los. UN IC. sistemas de ensayo (Problema y Control), donde se visualiza que a las primeras 12h existe. M. una mayor producción de amilasas en el sistema con almidón químicamente puro y menor. CO. en el sistema con el almidon comercial de Zea mays, pero que a las 72 h se registra una. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. Y. tendencia a igual dichas producciones.. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 0.0500. 0.0450. AC IÓ. N. 0.0400. UN IC. 0.0300. M. 0.0250. Problema. CO. 0.0200. Control. Y. UA/mL promedio. 0.0350. IC. A. 0.0150. RM. ÁT. 0.0100. 0.0000. 0. 12. 24. IN FO. 0.0050. 36. 48. 60. 72. AS. DE. horas. EM. Figura 1. Concentración de amilasas (UA/mL) producidas por Bacillus licheniformis. SI ST. FGM-A15 en cada uno de los biorreactores agitados (sistemas de ensayo. DI. RE. CC. IO. N. DE. Control y Problema) hasta las 72h de incubación.. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DISCUSIÓN. AC IÓ. N. Bacillus licheniformis FGM-A15 es una bacilo Gram positivo (ANEXO 4) que tiene la característica de producir amilasas cuando esta frente a almidón como fuente. UN IC. carbonada en el medio de cultivo, el mismo que fue corroborado cuando fue evaluado en. M. placa (ANEXO 6) y el biorreactor agitado en condiciones de laboratorio. Por su parte. CO. Sánchez y colaboradores23, pudieron aislar hasta 103 cepas amilolíticas, de las cuales 9. A. Y. presentaron cualitativamente mayor actividad amilolítica y fueron identificadas. ÁT. IC. bioquímicamente, éstas pertenecieron a los géneros Bacillus sp, Clostridium sp y Kurthia. RM. sp, a partir de almidón de maíz.. IN FO. La producción de amilasas por bacterias sigue siendo una actividad importante a. DE. nivel de laboratorio, toda vez que su aplicación es de interés comercial a gran escala, ya. AS. que los datos que se obtengan serán imprescindibles para estandarizar dichos procesos para. EM. la obtención de jarabes glucosados. En este sentido, la evaluación de dicha producción. SI ST. constituyó un factor crítico para verificar que B. licheniformis FGM-A15 produce amilasas y en un nivel competitivo. Al respeto, se pudo observar que hubo una producción. DE. logarítmica de amilasas hasta las 12h de incubación, alcanzando 0.035 UA/mL en el. IO. N. biorreactor agitado a pH 6.0, 40 °C y utilizando una concentración de almidón de Zea mays. RE. CC. al 0.5 %. Por su parte, Ochoa24 logró la producción de alfa-amilasa con el género Bacillus. DI. realizado generalmente dentro del rango de pH de 6.0 a 7.0, con una temperatura de 45°C, y una agitación de 125 rpm.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En las condiciones de ensayo se pudo comprobar que la producción de amilasas utilizando el almidón comercial de Zea mays resultó ser menos eficiente (0.0070 UA/mL) en comparación con lo obtenido con el almidón químicamente puro (0.035 UA/mL), hasta. AC IÓ. N. las 12h lo que nos indicaría que el procesamiento realizado previamente para comercializar. UN IC. el producto (almidón comercial) afectaría la solubilidad del almidón y por consiguiente la disponibilidad del almidón no sería un factor que estimule la secreción de la amilasa por. CO. M. parte de Bacillus licheniformis FGM-A15, lo que sí se puede observar en el sistema con el. IC. A. Y. almidón químicamente puro.. RM. ÁT. Al transcurrir el tiempo de incubación (Fig. 1), se observó que en el sistema con. IN FO. almidon comercial de Zea mays la producción de amilasas se incrementó desde el tiempo 0h con una tendencia lineal hasta las 72h en el biorreactor agitado, lo que indicaría que B.. DE. licheniformis FGM-A15 produce la enzima para degradar el almidón soluble en las. AS. condiciones de ensayo (Temperatura y pH). La máxima producción de amilasas por la. EM. bacteria se mantiene estable durante todo el tiempo de incubación después de haber. SI ST. iniciado el proceso y se mantiene aproximadamente constante hasta las 72 horas. Sería. DE. conveniente monitorear mayores tiempos de incubación para determinar el cese de dicho. N. proceso, que indicaría el consumo del almidón y la reducción del crecimiento bacteriano. B. licheniformis se caracteriza por tener una temperatura mínima de crecimiento de. DI. RE. CC. IO. por consumo de sustrato15.. 15 °C y la máxima de 50-55 °C, aunque se ha reportado una cepa aislada de un ambiente geotérmico a una temperatura de 68 °C25. En este caso, la temperatura de incubación fue de 40°C, donde se puede observar que la bacteria ha excretado sus amilasas, indicando que. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. estuvo activa, toda vez que las amilasas servirían para hidrolizar las moléculas de almidón (comercial o químicamente puro) que están en el medio de cultivo en azucares menos complejos, para luego asimilar las moléculas más sencillas, como oligosacáridos, maltosa. AC IÓ. N. y/o glucosa, a medida pasa el tiempo, que finalmente se traduciría en crecimiento, al hacer uso de su vías metabólicas para sintetizar sus metabolitos primarios y obtener la energía. CO. M. UN IC. suficiente y necesaria26.. El mecanismo anterior de producción de amilasas fue corroborado por Pedroza y. IC. A. Y. colaboradores27, cuando al ensayar la concentración de almidón, para la producción de a-. ÁT. amilasa con células libres de Thermus sp., empleó 3.204 g/L de almidón de maíz, y obtuvo. RM. 46.48 UA/min a las 22h de fermentación; mientras que al emplear 6.408 g/L, obtuvo 24.90. IN FO. U A/min a las 2h; mientras que, al utilizar 7.369 g/L se logró 43.16 UA/min, a las 22h,. DE. demostrando que la menor concentración de almidón de maíz genera 4.98 veces mayor la. AS. actividad al comparar estos resultados con los obtenidos por Pedroza28, donde se. EM. produjeron 9.33 UA/min a las 27h en fermentador de 1 L a 150 r.p.m., y 1 v.v.m.,. SI ST. utilizando como fuente de carbono 1% p/v de almidón hidrosoluble. El aumento en la producción de enzima se debe probablemente a la mayor afinidad de la bacteria, por el. DE. almidón de maíz empleado como fuente de carbono; lo que sugiere que el almidón. IO. N. hidrosoluble 100% puro podría generar inhibición por sustrato; por otra parte el almidón de. RE. CC. maíz en forma de “maicena” que fue empleado contiene CaCl2 y se conoce que algunas. DI. enzimas como la alfa-amilasa de este género requiere como cofactor el CaCl2.. El estudio de la cinética de producción de amilasas por B. licheniformis FGM-A15 a condiciones de concentración de almidón, temperatura y pH previamente establecidos permitió observar que la producción de amilasas con el almidón comercial tuvo un 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. incremento constante desde las primeras de incubación hasta las 72 h de monitoreo, y con tendencia a ir incrementando. Similares condiciones fue determinado para Bacillus megaterium donde la temperatura óptima para la producción de la enzima por la esta. AC IÓ. N. bacteria fue de 40 °C y que tuvo un mayor crecimiento a los 42 °C empleando un. UN IC. biorreactor agitado con control de temperatura y pH29. Otros resultados indican que la alfa amilasa de BBM1 presentó una actividad significativa entre 30°C y 80°C, con un máximo. CO. M. a 60°C, que también corresponde al máximo de estabilidad; en tanto que la misma enzima trabajó con una eficiencia superior al 80% entre 45°C y 72 °C, pero que su actividad. ÁT. IC. A. Y. decreció rápidamente por encima de 80ºC30.. RM. La mayoría de las amilasas que se conocen presentan mayor actividad a valores de. IN FO. pH neutro o ligeramente ácidos, también se sabe que la actividad disminuye rápidamente a. DE. pH alcalino31, 32, 33,34.En relación al pH del sistema de estudio con B. licheniformis FGM-. AS. A15, este fue de 6.0 y que la producción de amilasas en el biorreactor agitado a 40 °C, tuvo. EM. un incremento hasta un máximo de 0.047 UA/mL a las 72h de evaluación en el biorreactor. SI ST. utilizando el almidón químicamente puro, en tanto que utilizando el almidón comercial se logró producir un tanto mayor cantidad de amilasas equivalente a 0.043 UA/mL. El pH. DE. trabajado también ha sido el adecuado para otras bacterias, así tenemos que el pH óptimo. IO. N. para las alfa amilasas de B. subtilis es variable, pero se encuentra generalmente en el rango. CC. 6.0-7.035. La mayor actividad amilásica para B. amyloliquefaciens se registró a pH 6.0,. DI. RE. aunque existen pocos reportes de alfa amilasas con un pH óptimo por debajo de 5.030.. Al evaluar estadísticamente la producción de amilasas por B. licheniformis FGMA15 en los dos sistemas de ensayo (Control y Problema) se observó que la producción media en el sistema Control fue de 0,375 UA/mL; mientras que, en el sistema Problema 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. fue de 0,213 UA/mL (ANEXO 25) lo que significaría que con el almidón q.p. se produciría mayor cantidad de enzima. Pero el ANOVA de la producción promedio, en relación al tiempo desde las 0h hasta las 72h de incubación en las condiciones de ensayo, expresa que. 36. . Entonces la cinética de producción de. UN IC. analizar estos valores mediante la prueba T. AC IÓ. N. no existe diferencia significativa en la producción en ambos sistemas, y que se corrobora al. amilasas varía en las primeras horas de incubación siendo exponencial en ambos sistemas. CO. M. pero mayor en el Control, pero que a medida que la bacteria se va a adaptando en el. Y. sistema Problema, y las condiciones ambientales van siendo las más adecuadas, se logra. IC. A. producir amilasas en la misma intensidad en dichos sistemas a las 72h. Por su parte,. ÁT. Portillo y Ramírez trabajando con Bacillus subtilis ATCC 6633 y utilizando como medio. RM. de cultivo cáscara de papa, logró determinar que la producción de amilasas se evidencia. IN FO. después de las primeras 48 h en donde se mantiene casi constante a las 72 h después de. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. haber iniciado el proceso de producción de la amilasa15.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES. N. El almidón comercial de Zea mays permitió obtener una producción de amilasas por. AC IÓ. 1.. La producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 desde las 0h hasta. M. 2.. UN IC. Bacillus licheniformis FGM-A15 en forma creciente desde las 0h hasta las 72h.. CO. las 72h de incubación en un biorreactor agitado con el almidón comercial de Zea. A. Y. mays tuvo una tendencia de producción logarítmica hasta un valor de 0.0426 UA/mL. 3.. IN FO. RM. ÁT. IC. a las 72h.. La producción de amilasas por Bacillus licheniformis FGM-A15 fue similar. DE. estadísticamente, utilizando el almidón comercial de Zea mays y el almidón. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. químicamente puro a las 72h.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RECOMENDACIONES. AC IÓ. N.  Hacer una prueba preliminar de los biorreactores a utilizar para verificar su. UN IC. correcto funcionamiento.. M.  En cada toma de muestra monitorear y controlar el pH del Caldo Almidón.. CO.  Al momento de preparar la solución de Caldo Almidón, los reactivos deben. Y. ser esterilizados por separado, ya que algunas sales reaccionan al ser. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI ST. EM. AS. DE. IN FO. RM. ÁT. IC. A. mezclados ocasionando un precipitado.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. N. 1. VARGAS S. Selección y evaluación de bacterias del genero Bacillus productoras. AC IÓ. de amilasas en cultivo sumergido. Tesis digitales Universidad Nacional Mayor San. UN IC. Marcos. 2002. Oficina General del Sistema de Bibliotecas y Biblioteca Central. M. UNMSM. Disponible en:. Y. CO. www.sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtualdata/tesis/salud/.../antec_fund_cientif.pdf. IC. A. 2. BERNAL L, MARTÍNEZ B. Una nueva visión de la degradación del almidon.. RM. ÁT. Revista del centro de investigación Universidad La Salle. 2006; 7(25):77-90.. IN FO. 3. RAJAGOPALAN G, KRISHNAN C. a-Amylase production from catabolite derepressed Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate.. DE. Bioresource Techonology. 2007; 2: 25-58. EM. AS. 4. ASGHER M, JAVAID M, RAHMAN S, LEGGE R. A thermostable a-amylase. SI ST. from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for starch processing.. DE. Journal of Food Enginnering. 2006.. N. 5. TRIPATHI P, LEGGIO L, MANSFELD J, ULBRICH-HOFMANN K, Arvind.. CC. IO. apha- amylase of mung bean (Vigna radiata) correlation of biochemical properties terciary structureby homology modelling. Phytochemistry. 2007; (Mayo):. 1623.. DI. RE. and. 6. MONTOR J, OLVERA C, REYES D, SACHMAN B, RAMÍREZ L, DEL MORAL S. Caracterización bioquímica de AmiJ33 una amilasa de Bacillus. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. amyloliquefaciens aislada de suelos cultivados con caña de azúcar en la región de Papaloapan. Rev. Electrónica Nova Scientia 2013; 6 (12): 39-59. 7. CARRERA J. Producción y aplicación de las enzimas industriales. Revista de. AC IÓ. N. biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial. 2003.. UN IC. 8. WISEMAN A. Manual de biotecnología de las enzimas. Editorial Acribia S.A.. M. Zaragoza- España. 1985.. CO. 9. ZOE M. Coproduction of Alfa- amylase and beta-galatosidase by Bacillus subtitulis. IC. A. Y. in complex organic substrates. Bioresource Technology. 2005; (Diciembre):150.. ÁT. 10. ABU E, ADO S, JAMES D. Raw starch degrading amylase production by mixed. RM. culture of Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae grown on Sorghum. IN FO. pomace. En: African Journal of Biotechnology. 2005; 4 (8): 785-790.. of. Aspergillus. ochraceus.. Revista. Latinoamericana. de. AS. characteristics. DE. 11. NAHAS E, WALDEMARIN M. Control of amylase production and growth. SI ST. EM. Microbiología. 2002; 1(1): 5 12. DURANGO E. Producción de enzimas amilasa microbiana, mediante fermentación. DE. en sustrato líquido. Universidad Pontificia Bolivariana. Centro de Investigaciones,. CC. IO. N. Monteria, Cordova. 2008.. DI. RE. 13. OLUSANJO I, NGACHI E, IHUOMA F. Comparative studies on a-amylases from malted maize (Zea mays), millet (Eleusine coracana) and Sorghum. Carbohyfrates Polymers. 2006.. 14. SÁNCHEZ C, MEJÍA C, FIGUEROA C, ESQUIVIA M, AGUDELO L, ZAPATA N, GÓMEZ M. Estudio de cepas nativas amilolíticas. Vitae ISSN 0121-4004.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Revista de la Facultad de Química Farmacéutica.. Universidad de Antioquia,. Medellín - Colombia. 2005; 12 (2): 21-28.. N. 15. PORTILLO J, RÁMIREZ A. Obtención de amilasa por cinética de crecimiento con. AC IÓ. el microorganismo Bacillus subtilis ATCC 6633 utilizando como medio de cultivo. UN IC. cáscara de papa. [Tesis Licenciatura]. El Salvador: Universidad de El Salvador,. M. Facultad de Quimica y Farmacia. 2009. CO. 16. VARELA L. Amilasas. [Tesis para obtener el grado de maestro en Biotecnología].. IC. A. Y. Universidad Autónoma de Chihuahua. 2010.. ÁT. 17. WIND D, BUITEIAAR M, EGGINK G. Characterization of the new Bacillus. RM. stearothermophylus isolates: a highly thermoestable a amylase -producting strain.. IN FO. Appl Microbiol Biotechnol. 1994; 41: 155-162.. DE. 18. SARMIENTO C, VARGAS H, PEDROZA A, MATIZ A, POUTOU R. Producción. AS. de α-amilasa con células libres e inmovilizadas de Thermus sp. Pontificia. SI ST. 317.. EM. Universidad Javeriana. Bogotá, D.C., Colombia. MVZ-Córdoba. 2003; 8 (2): 310-. DE. 19. MENDOZA G. Biorreducción y Biosorción de Cromo por Pseudomonas. IO. N. aeruginosa y Bacillus licheniformis en cultivo sucesivo utilizando efluente de. DI. RE. CC. curtiembre. Tesis para obtener el grado de Maestro en Ciencias. Universidad Nacional de Trujillo. 2014.. 20. PAZ I. Diseño Integral de Biorreactores Continuos de Tanque Agitado Aplicados a Procesos de fermentación. [Tesis para obtener el grado de Doctor en Ingeniería Automática]. Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales. 2010.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..