Jenny Mireya Avila Coy
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
BACTERIOLOGO
Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Básicas
Carrera de Bacteriología Bogotá D.C.
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Jenny Mireya Avila Coy
DIRECTOR:
Alba Alicia Trespalacios. MSc.
CODIRECTOR: Marcela Mercado. MSc
Pontificia Universidad Javeriana Facultad de Ciencias Básicas
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Tabla de contenido Lista de figuras Lista de tablas Lista de anexos Resumen
Abstrac Lista de tablas Lista de anexos
1. INTRODUCCIÓN 15
2. ANTECEDENTES Y MARCO TEÓRICO 17
2.1 Diagnóstico por infección de 18
2.2 Tratamiento de infecciones por 19
2.3 Resistencia a antimicrobianos 21
2.4 Detección de resistencia a antimicrobianos 22
2.4.1 Dilución en agar 23
2.4.2 RFLP-PCR 23
2.5. Revisión sistemática de la literatura 26
2.5.1. Estrategia de búsqueda y selección de estudios 26
2.5.2. Extracción de datos 27
2.5.3. Análisis estadístico 28
3. JUSTIFICACIÓN 30
4. OBJETIVOS 31
4.1 Objetivo general 31
4.2 Objetivos específicos 31
9
6. METODOLOGÍA 33
6.1 Selección de artículos 33
6.1.1. Criterios de inclusión 33
6.1.2. Criterios de exclusión 34
6.1.3. Estrategia de búsqueda para la identificación de los artículos 35
6.1.4. Identificación y selección de estudios 36
6.2. Extracción de datos 36
6.2.1. Tabulación y visualización de resultados mediante gráficas 37
6.2.2 Análisis de subgrupos 38
6.2.3. Listados de los estudios excluidos 38
6.3. Análisis estadístico 38
6.3.1 Exploración de heterogeneidad entre los estudios 38
6.3.2. Limitación de análisis 38
7. RESULTADOS 39
7.1. Análisis global de la información 39
7.2. Grado de heterogeneidad 40
7.3. Evaluación de las características operativas por medio de
Curvas ROC 42
7.4. Sesgos de publicación 43
7.5. Pregunta de investigación 44
7.6. Análisis según subgrupo de poblaciones 44
8. DISCUSION 46
8.1. Selección de estudios 47
8.2. Discusión de Resultados 35
8.3. Aplicación de los resultados para responder la pregunta
de investigación 48
9. CONCLUSIONES 49
10. RECOMENDACIONES 50
10
( Clasificación de la gastritis según cronología,
características histológicas y distribución anatómica. 17 & Modo de acción, mecanismos de resistencia y
prevalencia de la resistencia entre los antimicrobianos usados para el tratamiento de infección por 20
' Estrategia de búsqueda en SCIENCE DIRECT,
MEDLINE y MEDLINE (ebscohot)-(ovid) y Cochrane 35
+ Modelo de tabla 2x2 para análisis de datos 37
8 Características de los estudios que comparan Dilución
en Agar con RFLP-PCR 40
, Valor de Heterogeneidad (Q) para la sensibilidad y
Especificidad. 42
11
9
( Características operativas de RFLP-PCR vs. Dilución
en agar para todos los estudios 41
& Curva ROC: Características operativas de RFLP-PCR vs. Dilución en agar para todos los estudios 42
' Funnel plot para sensibilidad 43
+ Funnel plot para especificidad 43
8 EUROPA: Características operativas RFLP-PCR vs.
Dilución en agar 44
, ASIA: Características operativas RFLP-PCR vs.
Dilución en agar 45
: AMÉRICA LATINA: Características operativas E-test vs.
12
;
! ; ( Listas de chequeo para cada uno de los estudios incluidos ! ; & Formatos de recolección de datos para cada estudio incluido ! ; ' Tabulación de resultados
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Se realizó una revisión sistemática de la literatura de estudios de pruebas diagnósticas para comparar las características operativas de la prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa de los Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP-PCR) con la prueba Dilución en Agar para la determinación de susceptibilidad antimicrobiana de
para los antibióticos claritromicina, amoxicilina y levofloxacina.
Se realizó una búsqueda de literatura en Medline, Science direct, Ovid y la librería Cochrane de estudios de pruebas diagnósticas sobre resistencia antimicrobiana de a claritromicina, amoxicilina y levofloxacina en los que utilizaran las técnicas de Dilución en Agar y RFLP-PCR; se incluyeron artículos que reportaran las características operativas o los datos para poder calcularas. Dos observadores verificaron los criterios de inclusión en los artículos. La evaluación de la calidad de los estudios incluidos también se hizo por dos observadores por medio de una lista de chequeo. Se obtuvieron las características operativas de los estudios incluidos por medio de tablas 2x2, el análisis de la información se llevó a cabo en el programa RevMan 5 y el análisis estadístico se realizó por medio de gráficas “Forest Plot”, “Funnel Plot” y de curvas ROC.
De los 50 artículos obtenidos en la búsqueda primaria, se incluyeron definitivamente 12 artículos. Se observó que el 42% de los artículos tuvieron sensibilidad del 100%, mientras que el 87% de los mismos presentaron especificidad del 100%. La medida de resumen “overall” proyectó una sensibilidad de 91% (IC 95% 88%-94%) y una especificidad de 99% (IC95% 91%-100%). El test de heterogeneidad mostró estudios homogéneos; además el análisis de la curva ROC mostró que la mayoría de los artículos presentaron áreas bajo la curva amplias, puesto que reportaron buenos porcentajes de sensibilidad y especificidad. Las gráficas de “Funnel Plot” revelaron asimetría por la presencia de sesgos de publicación. También se realizó un análisis por subgrupos en el que se evidenció que la región con más estudios publicados sobre este tema fue Europa, seguida de Asia y América Latina; debido a que solo se encontró información sobre claritromicina, no se pudo analizar el subgrupo de agentes antimicrobianos.
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In this research, we conducted a systematic review of literature from studies of diagnostic tests to compare the operational characteristics of the Polymerase Chain Reaction of the Length Polymorphism Restriction Fragment test (RFLP-PCR) with Agar Dilution test, to establish antimicrobial susceptibility to Helicobacter pylori antibiotic clarithromycin, amoxicillin and levofloxacin. We conducted a literature search of Medline, Science direct, Ovid and the Cochrane library studies of diagnostic tests on antimicrobial resistance of H. pylori to clarithromycin, amoxicillin and levofloxacin using techniques Dilution Agar and PCR-RFLP; included articles that reported the operational characteristics or data to calculate. Two observers verified the criteria for inclusion in the articles. The quality assessment included studies was also made by two observers through a checklist. We obtained the operational characteristics of the included studies on 2x2 tables, information analysis was carried out in the program RevMan 5 and statistical analysis was performed by graphic Forest Plot, Funnel Plot and ROC curves.
12 of the 50 articles from the primary search were finally included in our research. It was noted that 42% of the articles had sensitivity of 100%, while 87% of them had specificity of 100%. The summary measure "overall" projected a sensitivity of 91% (95% 88% -94%) and a specificity of 99% (95% 91% -100%). The test of heterogeneity showed homogeneous studies; besides the ROC curve analysis showed that most of the articles presented extensive areas under the curve, as reported good rates of sensitivity and specificity. The graphics of "Funnel Plot" asymmetry revealed by the presence of publication bias. We also performed an analysis by subgroups in which the region was evident that more studies published on this subject was Europe, followed by Asia and Latin americas; because they only found about clarithromycin, was unable to analyze
the subset of agents antimicrobials.
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La infección por desde su descubrimiento por Marshall y Warren en 1983, ha sido uno de los fenómenos científicos de mayor importancia en la literatura biomédica mundial (Cervantes ., 2006).
Esta bacteria se considera el agente causal de gastritis aguda y crónica y se asocia con úlcera péptica, carcinoma y linfoma gástrico (Gerrits , 2006). Se estima que entre el 50% y el 80% de la población mundial está infectada por esta bacteria, pero existen diferencias de acuerdo con las razas, países y niveles económicos. En países desarrollados la infección se encuentra en el 10% de las personas de 20 años y aumenta gradualmente con la edad hasta encontrarse entre el 50% y 60% a los 60 años, mientras que en países en desarrollo las tasas de infección alcanzan el 95% (Kuipers ,. 1995).
En Colombia se ha investigado su ocurrencia en material de biopsias gástricas y se han llevado a cabo estudios sero-epidemiológicos. Las zonas montañosas de Colombia como Pasto y Medellín, ofrecen altas tasas de prevalencia con 93.0% y 67.1% respectivamente, en comparación con las tasas medias de las zonas planas como San Gil y Meta con 48% y 61.2% respectivamente (Bravo ., 2003). Cabe mencionar que en Colombia no se han hecho estudios de prevalencia general sobre
, razón por la cual no se tienen datos precisos.
Para erradicar esta bacteria se está empleando un tratamiento erradicador que consiste en antibióticos, que pueden ser varios, asociados a medicamentos antisecretores (antagonistas H2 e inhibidores de la bomba de protones) (Gerrits
., 2006) Los antibióticos usados más frecuentemente en el tratamiento son claritromicina, amoxicilina y metronidazol.
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frente a los antibióticos de uso rutinario, para poder establecer la efectividad de los tratamientos y aplicar nuevas terapias de erradicación.
En los últimos años se han desarrollado técnicas basadas en ácidos nucleicos que se han implementado para detectar las mutaciones que causan la resistencia de la bacteria a los antibióticos. Dentro de las técnicas más usadas están la PCR convencional, PCR en tiempo real, HPLC-PCR, RFLP-PCR, RAP-PCR, FISH, entre otras.
Por medio de estas técnicas se han podido detectar las mutaciones más frecuentes presentes en los aislamientos resistentes, además estas pruebas arrojan resultados en menor tiempo que las pruebas basadas en cultivos como el E-test o Dilución en Agar. La determinación de la sensibilidad y especificidad de estas técnicas es un criterio muy importante a la hora de implementarlas para el uso rutinario del laboratorio.
Por ello este trabajo busca establecer las características operativas de la técnica basada en ácidos nucleicos RFLP-PCR con miras a su implementación como técnica de rutina en la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana de
17
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En 1983, Warren y Marshall, encontraron en los pacientes con gastritis de tipo B ? (@ unos bacilos gramnegativos que se parecían a . Estos microorganismos se clasificaron inicialmente como ; pero posteriormente se reclasificaron como un nuevo género, (Murray , 2003).
( Clasificación de la gastritis según cronología, características histológicas y distribución anatómica.
Tomado de Braunwald E, Fauci A.S, et al. Harrison, Principios de Medicina Interna. 15° edición.
Este importante descubrimiento, premiado en el 2005 con el premio nobel de fisiología y medicina, ha cambiado la forma de ver la úlcera péptica como una enfermedad crónica de causa desconocida a enfermedad infecciosa curable. Actualmente es reconocido como el agente causal de gastritis crónica y aguda y es el mayor factor pre disponente para úlcera péptica, carcinoma y linfoma gástrico (Gerrits , 2006, Kusters al., 2006).
Se estima que el 50 % de la población mundial está infectada por la bacteria. La colonización por aumenta con la edad y la infección aparece en personas de condición socioeconómica baja y en países en vías de desarrollo como
I. Gastritis aguda II. Gastritis atrófica crónica
A. Infección aguda por A. Tipo A: autoinmunitaria, predominante en el uerpo
B. Otras B. Tipo B: relacionada con , predominante
en el antro. 1. Bacteriana (aparte de ) C. Indeterminada.
2.
3. Flemonosa III. Formas poco frecuentes de gastritis
4. MIcobacterias A. Linfocítica
5. Sífilis B. Eosinófila
6. Vírica C. Enfermedad de Crohn
7. Parasitarias D. Sarcoidosis
18
el nuestro, con deficientes condiciones sanitarias, (Cervantes ., 2006) en donde la tasa de infección es del 80% aproximadamente. La infección por ocurre principalmente en la infancia, una vez adquirido el microorganismo, la infección persiste durante toda la vida si esta no es tratada (Gerrits ., 2006).
es una bacteria móvil (motilidad en sacacorchos) y produce abundante ureasa. no fermenta ni oxida los hidratos de carbono, aunque puede metabolizar los aminoácidos por vías fermentativas.
necesita un medio complejo suplementado con sangre, suero, carbón, almidón o yema de huevo, en condiciones microaerófilas, y en un rango de temperatura entre 30° y 37°C (Murray ., 2003).
Los desordenes asociados a usualmente disminuyen o se curan después de un tratamiento exitoso con antibióticos. Sin embargo las terapias antimicrobianas tienen limitantes como son los efectos secundarios, la necesidad de realizar tratamientos combinados, la limitada efectividad, en particular cuando se desarrolla resistencia antimicrobiana, lo que hace vital la necesidad de buscar nuevos tratamientos.
Las cepas de son susceptibles a un número elevado de antibióticos, aunque muchos de ellos no son útiles Esto se debe a que el antibiótico no se distribuye adecuadamente en los sitios profundos de la mucosa gástrica, donde esta bacteria coloniza, o porque el antibiótico se inactiva a pH ácido, condición presente en el estómago, o porque se seleccionan mutantes resistentes durante el tratamiento. (Fariña , 2007).
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aliento, heces, orina o saliva. Estas muestras pueden ser procesadas por serología, test del aliento de la urea o detección de antígenos (Versalovic ., 2003).
La elección del método adecuado depende de varios factores como la edad del paciente, la patología, los síntomas, la disponibilidad local de la prueba, los costos y la información clínica que se quiera obtener, entre otros. Es así como pacientes con sangrado gastrointestinal, pérdida inexplicable de peso o anemia, así como pacientes mayores de 50 años con dispepsia, deben ser examinados a través de endoscopia; si la biopsia se obtiene fácilmente, la prueba de elección es la prueba rápida de la urea (Ong al., 2004). En pacientes que presenten sangrado activo o reciente o que estén tomando antibióticos, la histología es el procedimiento más recomendable (MacOni , 1999).
El único método de diagnóstico que evalúa la resistencia antimicrobiana son los cultivos de utilizados para susceptibilidad antimicrobiana a los agentes antimicrobianos usados en la terapia de erradicación, aunque esta prueba no se realiza rutinariamente en el diagnóstico inicial de la infección por (Gerrits
, 2006).
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20
& Modo de acción, mecanismos de resistencia y prevalencia de la resistencia entre los antimicrobianos usados para el tratamiento de infección por .
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A
4 Metronidazol, tinidazol 20-95%
Reducción de la prodroga por las nitroreductasas, lo que conduce a la formación de radicales de anión-nitro e intermediarios del imidazol y daño subsecuente del DNA.
Ausencia de lreducción del imidazol causada por la reducción o supresión de la actividad de las proteinas transmportadoras de electrones (p.e. RdxA, FrxA, FdxB).
0 Claritromicina, eritromicina 0-50%
Unión al rRNA de la subunidad ribosomal 23S, resultando en la inhibición de la síntesis de proteínas.
Puntos de mutación en el rRNA del gen 23S.
Amoxicilina 0-30%
Unión de los antibióticos Beta-lactámicos a las proteínas de unión a la penicilina (PBP por su sigla en inglés), inhibiendo la división celular.
Disminución de la unión de la amoxicilina a las PBP D (tolerancia)o PBP 1A (resistencia generada por puntos de mutación en el gen " ),y reducción de la permeabilidad de la membrana (resistencia).
tetraciclina 0-10%
La unión al ribosoma previene la asociación con el aminoacyl-tRNAy la posterior síntesis de proteínas.
Puntos de mutación en el rRNA del gen 16S y reducción de la permeabilidad de la membrana.
B
Ciproflaxacina, moxifloxacina, levofloxacina
0-20%
Inhibición de la DNA girasa y las topoisomerasas, interfiriendo con la replicación del DNA.
Puntos de mutación en el gen de la DNA girasa, .
9 Rifabutina 0-2%
Unión a la RNA polimerasa, resultando en la inhibición de la transcripción.
puntos de mutaciones en el gen de la RNA polimerasa, #.
9 Furazolidona 0-5%
Reducción de la prodroga por las nitroreductasas, lo que lleva a la formación de radicales de anión nitroy al subsecuente daño del DNA,
Desconocido.
1 5 Omeprazol, Iansoprazol,
pantoprazol No reportado
Inhibe la fuerza motriz de protones de la bacteria, y la desestabiliza en el sitio de colonización en el estómago.
Desconocido.
1
Subcitrato de bismuto, subsalicilato de bismuto, ranitidina,
citrato de bismuto
No reportado Inhibe la síntesis de proteínas,ATP y membrana celular. Desconocido.
*La prevalencia de la resistencia antimicrobiana en muestra una variación regional entre diferentes países. En países industrializados, la prevalencia de la resistencia es más baja que en países en vía de desarrollo.
Adaptada de Gerrits et al, 2006.
21
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Los medicamentos que generan más resistencia antimicrobiana son los nitroimidazoles (metronidazol y tinidazol), presentando una tasa de resistencia aproximada de 35% en los países industrializados (Gerrits ., 2006). En países como Colombia, donde el uso indiscriminado de antibióticos es muy frecuente, la tasa de resistencia es mucho mayor, razón por la cual algunos grupos no utilizan este medicamento en la terapia erradicadora contra .
La resistencia a las penicilinas (amoxicilina) y tetraciclinas (tetraciclina) se presenta en menor proporción, pero en países donde los antibióticos se obtienen sin prescripción médica (por ejemplo Brasil o El Salvador), la resistencia es mucho mayor, presentándose en tasas de hasta el 72% y el 59% de amoxicilina y tetraciclina respectivamente, aunque estos datos requieren de más reportes que los confirmen (Wu ., 2000).
Dentro de los mecanismos de resistencia de los antibióticos a nivel genético, solo uno, la presencia de puntos de mutación, concierne a . El sitio blanco en los macrólidos (claritromicina) es el 23S rRNA, especialmente el dominio V donde los antibióticos se unen e interrumpen la síntesis de proteínas. Los primeros puntos de mutación asociados con resistencia a macrólidos fueron 2142 (A2142G) y 2143 (A2143G) (Versalovic ., 1996), aunque también han sido descritas otras mutaciones como la transversión A2142C, que es poco común. También se han generado otras mutaciones ! (A2143C, A2142T, A2143T), pero estas cepas mutantes son muy inestables (Mégraud, 2001).
La amoxicilina es el único β-lactámico usado para el tratamiento de infecciones por . Un posible sitio blanco de la amoxicilina pueden ser las proteínas de unión a la penicilina (PBPs), involucradas en la síntesis de péptidoglucano. Alteraciones en las PBPs pueden afectar la unión de los β-lactámicos y conferir resistencia a los mismos (Mégraud, 2001).
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Se han desarrollado muchas técnicas para determinar la resistencia o susceptibilidad de frente a antimicrobianos, estos se pueden clasificar en métodos basados en cultivos y basados en ácidos nucleicos. Los métodos basados en cultivos son Dilución en Agar, microdilución, E-test, pero como la resistencia de se hace más frecuente y mayor, se han empezado a desarrollar métodos basados en ácidos nucleicos como polimorfismos de longitud en los fragmentos de restricción (RFLP), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), PCR en Tiempo Real (RT-PCR), amplificación de polimorfismos aleatorios (RAP), Cromatografía líquida de Alto Rendimiento (HPLC) e Hibridación fluorescente in situ (FISH), entre otras.
La PCR y RT-PCR permiten amplificar los fragmentos de DNA que presenten mutaciones que puedan conferir resistencia antimicrobiana a las cepas de . Los ensayos de hibridación por PCR en Tiempo Real, amplifican el fragmento de DNA de interés en presencia de una o dos sondas marcadas con fluorescencia. Después de la finalización por PCR, la temperatura se incrementa para determinar el punto de fusión de las sondas. Cuando hay desajustes presentes en la secuencia blanco, se obtienen temperaturas de fusión más bajas comparadas con el combinado híbrido. Esta técnica se puede hacer tanto en biopsias como en heces (Gerrits ., 2006).
La HPLC es una técnica colorimétrica que permite detectar rápidamente puntos de mutación en las cepas de a partir de la separación del DNA sobre una fase sólida por medio de una fase móvil, esta separación se puede evidenciar a través de un cromatograma que muestra las mutaciones como dos o más crestas. Una vez determinadas las crestas, se procede a amplificar el segmento mutado por medio de la PCR (Posteraro ., 2006).
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diagnóstica con numerosas aplicaciones. La técnica de FISH puede detectar resistencia a antibióticos de sin necesidad de llevar a cabo una PCR. En esta prueba, el es hibridado con una sonda específica para
marcada con fluorescencia, que contiene la mutación de interés y esta reacción se visualiza por media de un microscopio de fluorescencia (Vega ., 2007).
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El método de Dilución en Agar es el gold standard en lo que a pruebas de sensibilidad a antibióticos se refiere. Este método se debe hacer incorporando el antibiótico en estudio en el agar Mueller-Hinton suplementado con sangre de cordero al 5%. El inoculo de la bacteria se prepara en una suspensión salina equivalente al patrón de McFarland 2.0 (que contiene de 1*107 a 1*108 UFC/ml), a partir de un sub cultivo de 72 horas en agar sangre. El inoculo se replica directamente en las cajas de Dilución en Agar que contienen el agente antimicrobiano y se incuba a 35+2°C por tres días en condiciones microaeróbicas producidas por un sistema generador de gas adecuado para campylobacterias. Para el control de calidad se recomienda usar la cepa control ATCC 43504 bajo las condiciones ya mencionadas. (Performance Standards for antimicrobial susceptibility Testing; Eighteehth informational Supplement, 2008).
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24
restricción determinada no se presenta siempre en todos los individuos. La ausencia de la diana de restricción se debe normalmente a una sola diferencia nucleotídica que suele ser biológicamente neutra (Griffiths ., 2002).
La PCR-RFLP es un método muy usado para detectar cambios mutacionales en de muestras de biopsias o de heces (Versalovic J, 1997; Ribeiro ML et al, 2003). El método es simple y se basa en la presencia o ausencia de un sitio de restricción con el fragmento de DNA amplificado (Gerrits et al, 2006).
Esta técnica se usa generalmente para detectar mutaciones en blancos pequeños de secuencias conocidas, principalmente puntos de mutación de uno o pocos pares de bases y pequeñas inserciones o deleciones. Esta técnica puede detectar puntos de mutación tan poco frecuentes como de 10-6 hasta 10-8 por base (Parsons y Heflich, 1997).
Este método consiste en una amplificación de una secuencia blanco por PCR seguida de la digestión del producto de la PCR por una enzima de restricción que corta al sitio de mutación. Esta técnica es usada frecuentemente para detectar mutaciones en los genes , así como para genotipificar enfermedades humanas. Usualmente las mutaciones se detectan por la pérdida del sitio de restricción en la secuencia del tipo natural, pero algunas mutaciones pueden ser detectadas por cambios en la secuencia formando un nuevo sitio de restricción. Sin embargo, la última situación evita la caracterización más allá de la mutación por la secuenciación de un producto de PCR intacto (Parsons y Heflich, 1997).
La principal limitación de la sensibilidad de esta técnica es la eficiencia de la restricción, pues no todos los sitios de restricción pueden ser analizados porque la enzima de restricción no siempre mantiene la integridad de los fragmentos. Otra limitación de la sensibilidad es el “background” o ruido de fondo de la PCR, generado por la amplificación de secuencias del tipo natural que han sido cortadas por la enzima de restricción (Parsons y Heflich, 1997).
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todos los sitios de restricción detectados por esta técnica son del mismo interés (Parsons y Heflich, 1997).
La PCR-RFLP es usada principalmente como un tamizaje rápido de mutaciones previamente descritas. Cuando la visualización de los productos de digestión se realiza en un gel cubierto por bromuro de etidio, la sensibilidad de la detección de la mutación es generalmente menos de 1 en 100. Una segunda ronda de PCR seguida de la restricción y detección de productos no radio marcados pueden incrementar la sensibilidad a un 10-3 o 10-4 (Parsons y Heflich, 1997).
Las fases de la RFLP-PCR son:
1. Tratamiento del DNA cromosómico con enzimas de restricción (endonucleasas).
2. Obtención de fragmentos de DNA de distinto tamaño.
3. Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos obtenidos (patrón de restricción).
4. Comparación de los patrones de restricción de diferentes cepas (Sarabia, 2006).
Las endonucleasas son enzimas de origen bacteriano que cortan el DNA extraño en unos puntos concretos llamados “Dianas de restricción”. Las dianas de restricción son secuencias nucleotídicas concretas de 4 a 8 pb de longitud. Las enzimas de restricción rompen la molécula de DNA por las dianas de restricción, obteniendo fragmentos que permiten obtener un patrón de restricción (Sarabia, 2006).
26
restricción para la endonucleasa !!, produciéndose con ésta dos fragmentos de 700 pares de bases que comigran. Mientras que, la generación de la mutación puntual A2143G crea un sitio que es reconocido por la endonucleasa # !. Estudios realizados en mayor detalle señalan que las cepas que portan la mutación A2142G presentan mayor resistencia a claritromicina, lo que ha generado un mayor interés en el estudio molecular del mecanismo de resistencia de este antibiótico (Vallejos
., 2003).
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Se define como una revisión que se ha hecho usando un enfoque sistemático para minimizar sesgos y errores aleatorios que están contenidos en la sección de materiales y métodos. Una revisión sistemática puede o no incluir un meta-análisis. Un meta-análisis es un análisis estadístico de los resultados de estudios independientes con objetivos generales para producir una estimación del efecto para un tratamiento (Egger ., 2001).
La validez se puede definir como el grado con que los resultados de una medición se corresponden con el estado de veracidad del fenómeno medido. Son sinónimos de exactitud y precisión; y la confiabilidad o reproducibilidad significa que las mediciones realizadas en ocasiones diferentes, o por observadores diferentes, o por pruebas paralelas, determinaran los mismos resultados (Manterola , 2003).
Para realizar una revisión sistemática de la literatura el primer paso por seguir debe ser la formulación de la pregunta, esta debe ser clara, pues las preguntas mal enfocadas conducen a decisiones poco claras y confusas acerca de qué estudios conviene incluir en la revisión y cómo resumir sus datos (Clarke ., 2003). Una vez definida la pregunta, se puede establecer las estrategias de búsqueda y posteriormente, el análisis de la información.
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población, intervenciones y comparaciones, resultados y diseño y calidad metodológica.
Con los criterios de inclusión y exclusión ya establecidos, se procede a desarrollar una estrategia de búsqueda considerando los términos de búsqueda. La estrategia debe no sólo contemplar las bases de datos electrónicas, también debe tener en cuenta la búsqueda manual de artículos y la información personal de expertos acreditados en el tema.
Acto seguido, se debe realizar la selección de los estudios por más de un observador de manera independiente; es importante crear estrategias para solucionar problemas cuando se presenten desacuerdos entre los observadores.
Teniendo los estudios seleccionados, se debe evaluar la calidad metodológica de los estudios por más de un observador, mediante el uso de listas de chequeo; esta lista debe tener en cuenta el número de muestra, la reproducibilidad de los estudios, las conclusiones obtenidas, entre otras.
Luego de evaluar la calidad de los artículos, se procede a la obtención de datos por más de un observador para evitar posibles sesgos (Egger ., 2001).
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La extracción de datos se debe hacer por más de un observador, debe diseñarse la forma de tabular los resultados, también se deben considerar todos los tipos de subgrupos si lo requiere y realizar lista de estudios excluidos.
Los datos se pueden recopilar mediantes gráficas “Forest Plot”. Este tipo de gráficas muestra los resultados de los estudios individuales como cuadrados centrados en la estimación puntual de los resultados de cada estudio. Una línea horizontal pasa por el cuadrado mostrando su intervalo de confianza (Lewis ., 1982) y su longitud significa el efecto de la prueba.
28
en ellas se dibuja un eje de coordenadas donde en el eje Y se ubica la sensibilidad y en el eje X la tasa de falsos negativos o el complemento de la especificidad. Ambos ejes oscilan entre 0 y 100. El punto de la curva con mayor rendimiento conjunto de sensibilidad y especificidad estará en el extremo superior e izquierdo de la curva, es decir será el punto tangencial que le permitirá a la curva tener mayor área bajo la curva. Una prueba diagnóstica no válida es aquella que coincide con la diagonal. (Mercado ., 2003).
Una de las características operativas es la sensibilidad, también llamada tasa de verdaderos positivos (TVP), que es la capacidad de detectar a los enfermos (proporción de individuos con la enfermedad que presentan un resultado positivo). El complemento de la sensibilidad es la tasa de falsos negativos (TFN) (Begoña., 2001).
Otra característica operativa es la especificidad también llamada tasa de verdaderos negativos (TVN) es la capacidad de detectar a los individuos sin la enfermedad (proporción de individuos sin la enfermedad que presenta un resultado negativo). El complemento de la especificidad es la tasa de falsos positivos (TFP) (Begoña., 2001).
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El primer paso para el análisis estadístico es la evaluación de la heterogeneidad. Las pruebas de heterogeneidad son análisis estadísticos formales para examinar si la variación observada en los resultados del estudio es compatible con la variación esperada únicamente por azar. Mientras más significativos sean los resultados de la prueba (el valor p sea más pequeño), es más probable que las diferencias observadas no sean debidas únicamente al azar (Clarke ., 2003).
29 Fórmula
Donde Efi es el estimador del tamaño del efecto del i ésimo ensayo; Ef es el promedio de los estimadores del tamaño del efecto de los k ensayos; y W es el inverso de la varianza del tamaño del efecto de cada i ensayo clínico (varianza de cada Efi). La estadística Q se distribuye como una función de distribución χ2 con k-1 grados de libertad (Bermudez 2000).
Es importante analizar si la revisión sistemática de la literatura presentó sesgos de publicación, desde hace tiempo se ha reconocido que el sesgo de publicación es un problema en este aspecto, debido a que significa que la probabilidad de encontrar estudios está relacionada con los resultados de esos estudios. Una manera de investigar si una revisión está afectada por un sesgo de publicación consiste en preparar un "gráfico de embudo" (funnel plot) y examinar si tiene signos de asimetría. Sin embargo, si hay asimetría, deben considerarse también otras razones distintas al sesgo de publicación (Clarke ., 2003).
30
' .< % % ! %=
La resistencia a los antimicrobianos que ha venido desarrollando , ha llevado a la disminución de la efectividad de los tratamientos y, por tanto, a la búsqueda de nuevas alternativas. Esta resistencia es debida en gran parte al uso indiscriminado de antibióticos por parte de la población, situación que es bastante frecuente en Colombia.
Esto hace sumamente importante la necesidad de utilizar técnicas que permitan detectar la resistencia del microorganismo frente a los antibióticos usados más comúnmente como tratamiento erradicador. Dentro de las técnicas para determinar susceptibilidad antimicrobiana, se encuentran las basadas en la detección de ácidos nucleicos, rápidas, reproducibles y fáciles de estandarizar.
El propósito de este trabajo es evaluar las características operativas de la prueba basada en ácidos nucleicos RFLP-PCR para detección de susceptibilidad antimicrobiana de a claritromicina, amoxicilina y levofloxacina.
En Colombia no se han implementado esta prueba basada en ácidos nucleicos en la determinación de la susceptibilidad o resistencia de a los antimicrobianos utilizados en las terapias de erradicación de la infección, por tan motivo este trabajo pretende analizar las características operativas de estas pruebas que permitan a futuro implementar alguna de ellas en los laboratorios de microbiología.
31
+ 1.# %$
+ ( 1.# %$ 7# # !
Comparar las características operativas de la prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa de los Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP-PCR) con la prueba Dilución en Agar para determinación de susceptibilidad antimicrobiana de
+ & 1.# %$ # # E %
· Realizar una revisión sistemática de la literatura para encontrar artículos que permitan evaluar las características operativas de la prueba de RFLP-PCR con la prueba Dilución en Agar para la determinación de susceptibilidad de
a claritromicina, amoxacilina y levofloxacina.
32
8 3% = # %
Mas del 90% de la literatura científica escrita sobre las pruebas de Reacción en Cadena de la Polimerasa de los Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP-PCR) con respecto a prueba estándar de Dilución en Agar, sugiere características operativas superiores al 95% en la determinación de susceptibilidad antimicrobiana a claritromicina, levofloxacina y amoxicilina en
33
, 0# " 7E! "# ! #$% %= % #0C % ! "# ! % # ! < !
, ( , ( (
· Los criterios de inclusión que se tuvieron en cuenta para la realización de este trabajo se explican a continuación.
· F Se incluyeron artículos de pruebas diagnósticas en donde se utilizaban pruebas de Dilución en Agar y RFLP-PCR para determinar la susceptibilidad de a los antimicrobianos (claritromicina, levofloxacina, amoxicilina) y se describan las características operativas de estas pruebas
· F Estudios en los cuales se presentaron aislamientos clínicos de a partir de individuos de todas las edades, con y sin tratamiento antimicrobiano de diferentes patologías gástricas asociadas con la presencia del agente patógeno en estudio.
· / F estudios en los cuales
intervinieron pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, medida por la técnica de Dilución en Agar y determinación de mutaciones asociadas a resistencia,
determinada por RFLP-PCR para aislamientos de , las
pruebas debieron haber sido evaluadas para claritromicina, amoxicilina y/o levofloxacina, en cualquier concentración y combinación de las mismas.
· F el desenlace de las pruebas de este estudio fue
34
aquellas cepas que hayan resultado ser resistentes por la técnica de Dilución en Agar y en los cuales este definida claramente las características operativas de las prueba a evaluar o estén los datos para poder calcularlas.
· Se incluyeron artículos en donde se evalúo uno o más de estos antimicrobianos, aunque evaluara otros que no sean de interés de esta revisión.
· !G FEstudios realizados y publicaciones entre 1998 a 2008.
, ( & ;
· Se excluyeron artículos de pruebas diagnósticas en donde se utilizaron las pruebas de RFLP-PCR y de Dilución en Agar para determinar la susceptibilidad de solo a los antimicrobianos (Metronidazol, furazolidona, ampicilina) o cualquier otro que no sea interés de esta revisión y no contemplara los antimicrobianos objetos de estudio.
· Estudios en donde no se evaluaron las características operativas de las pruebas.
· Artículos con fecha de publicación anterior a 1998.
· Artículos en idiomas diferentes a los idiomas inglés o español.
· Artículos que evaluaron los antimicrobianos de interés de esta revisión por pruebas diferentes a la RLFP-PCR o Dilución en Agar.
· Artículos en los cuales se utilizaron cepas ATCC como muestras a estudio y no aislamientos clínicos.
· Artículos en los cuales se utilizaron cepas de aisladas de patologías no gastrointestinales.
· Artículos con más de una versión.
35
, ( ' # D B 9
Para la búsqueda de los artículos se utilizaron bases de datos de MEDLINE, SCIENCE DIRECT, OVID y Librería Cochrane (CCTR) desde 1998 hasta el 2008. Se realizó también una búsqueda manual en revistas de gastroenterología desde 1998. La búsqueda se realizó en idioma inglés y español. Se utilizó la estrategia de búsqueda mediante la utilización de una combinación de encabezados temáticos y palabras de texto relacionadas con la detección de pruebas basadas en ácidos nucleicos para susceptibilidad antimicrobiana de . Los estudios pertinentes se recuperaron de las bases de datos mediante la utilización de los términos de búsqueda amplios que aparecen a continuación.
La estrategia de búsqueda se realizó mediante la combinación de los términos MeSH (Medical Subject Headigns): $ , Resistance, Susceptibility, Sensibility, RFLP-PCR, Agar Dilution, Antimicrobial, Antibiotic, Clarithromycin, Amoxicillin, Levofloxacin, Molecular Test ? '@.
' Estrategia de búsqueda en SCIENCE DIRECT, MEDLINE y MEDLINE (ebscohot)-(ovid) y Cochrane
Se realizó mediante la combinación de los siguientes encabezados temáticos (Egger 2003). #1. RFLP-PCR
#2. Agar Dilution #3. Molecular test #4. Molecular testing of #5. Antimicrobial susceptibility #6. Antimicrobial resistance #7. Gastric biopsies
#8. Clinical isolates #9. Clarithromycin #10. Amoxicillin #11. Levofloxacin
#12. COMPARATIVE- STUDY-TRIAL
#13. #1 or #2 or #3 or #4 or #5 or #6 or #7 or #8 or #9 or #10 or #11 or #12 or #13 #14. #1 AND #2
F AND
36
, ( + % 9 /
La identificación y selección de los estudios se llevó a cabo de la siguiente manera (Manterola 2003).
· FSe realizó por expertos. Se buscaron artículos tanto
en español como en inglés. Para los artículos no publicados (aún que fueron incluidos), se obtuvieron informes completos por escrito que se adicionaron al formato de recolección de datos. En los casos en que se encontró más de una versión del mismo estudio, únicamente se seleccionó uno, y este fue el más reciente.
· F la selección de los
estudios se realizó por dos observadores, aplicando los criterios de inclusión y exclusión anteriormente mencionados, para disminuir los sesgos.
· # F en los casos en que hubo
desacuerdos entre los observadores, estos se resolvieron por discusión, de acuerdo a los criterios ya establecidos.
· #; F los artículos que no cumplían con los criterios de inclusión o que tenían alguno de los criterios de exclusión, se excluyeron de la revisión.
· # F la
evaluación de la calidad de los estudios se realizó por más de un observador utilizando una lista de chequeo, esto con el fin de lograr una evaluación más objetiva. Para poder evaluar la calidad de los estudios, los observadores utilizaron una lista de chequeo con los aspectos más relevantes de estos y de esta manera se incluyeron en la revisión ? ; (, Jaeschke ., 1997@.
, & #;
37
que se ubicaron los valores absolutos de las pruebas en estudio y posteriormente fueron recalculados los valores de sensibilidad, especificidad y valores predictivos de cada una de las pruebas? ; &@.
Los cálculos de las características operativas fueron realizados de la siguiente manera: = a/(a+c) $ (valor predictivo positivo) = a/(a+b)
# 9 = d/(b+d) $ (valor predictivo negativo)= d/(c+d)
+ Modelo de tabla 2x2 para análisis de datos
a: verdaderos positivos, b:falsos positivos, c: falsos negativos y d: verdaderos negativos
Se calculó un valor medio con su respectivo intervalo de confianza del 95% para cada una de las características operativas de las pruebas (sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo). Adicionalmente se determinó para cada antimicrobiano si la prueba en estudio (RFLP-PCR) cumplía con la hipótesis planteada, comparada con la prueba estándar ? ; &@
, & ( / $ 4 9 F Después de
seleccionados los estudios y extraídos los resultados de las características operativas, los datos de cada estudio fueron recolectados en la tabla de resultados ? ; '@.
Los resultados de cada estudio se ingresaron en un Software (RevMan 5), el cual permitió graficar y visualizar los resultados, estimando el valor en porcentaje de sensibilidad, especificidad con su intervalo de confianza del 95%, mediante el uso del diagrama de bosque “Forest Plot”. El tipo de variables del desenlace principal utilizado fue el valor de las características operativas.
"
VP
FP
38
, & & ! FSe realizó análisis de los siguientes subgrupos: · Subgrupo tipo de antimicrobiano: Claritromicina, amoxicilina, levofloxacina · Subgrupo área geográfica: Latinoamérica, Europa, Asia, Norteamérica,
Australia.
, & ' ; F el análisis de los estudios excluidos, se realizó usando un listado de exclusión que contenía el título, el autor, el año y las respectivas causas de exclusión ? ; +@.
, ' !
Para cada estudio se calcularon los parámetros diagnósticos de RFLP-PCR y Dilución en Agar (Sensibilidad, Especificidad, Valor Predictivo Positivo y Valor Predictivo Negativo con sus correspondientes Índices de Confianza).
, ' ( #; 5
La posibilidad de variabilidad entre los resultados de diferentes estudios se determinó mediante el test de heterogeneidad (Forest plot) mediante el modelo de efectos aleatorios con un alfa = 0.05 que tomó en cuenta dos fuentes de variación: la variación interna y la variación entre estudios.
39
: # < !"
Después de realizar la búsqueda en las bases de datos teniendo en cuenta los criterios de inclusión y exclusión, previamente establecidos, se obtuvieron 50 artículos. Posteriormente, tras eliminar aquellos artículos que no trataban estrictamente el uso de las pruebas Dilución en Agar y RFLP-PCR para determinar susceptibilidad antimicrobiana de los antibióticos de interés en este estudio (claritromicina, amoxicilina y levofloxacina), se seleccionaron 32 artículos. La selección de los artículos para ser incluidos (inclusión secundaria) fue realizada con los resúmenes de forma independiente, y sin conocimiento de los artículos seleccionados por el otro, por dos investigadores. De estos 32 artículos se marcaron en base a su título y resumen teniendo de nuevo en cuenta los criterios de inclusión y exclusión. Entonces se obtuvieron los artículos completos que se consideró podrían cumplir con los criterios de inclusión/ exclusión, para un total de 16.
Los desacuerdos, como ya se mencionó en la metodología, se resolvieron por discusión entre los dos observadores y los expertos hasta llegar a un mutuo acuerdo. Por lo tanto, se incluyeron definitivamente 12 artículos: Alarcón, Baglán, Dzierzanowski, Garrido, Kobayashi, Marais, Masaoka, Mégraud, Pina, Ribeiro, Umegaki, Vega ? 8@. Los análisis de resultados y las gráficas ROC, fueron clasificados según las características y los subgrupos previamente mencionados.
Ninguno de los artículos incluidos en este estudio proporcionó las características operativas, pero si suministraron los datos para calcularlas. De los 12 artículos, 4 no suministraron datos para el cálculo de especificidad, permitiendo solamente calcular la sensibilidad.
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40
8 Características de los estudios que comparan las pruebas Dilución en Agar con RFLP-PCR
! !G C !
7 9 4 # $ $
Mégraud 1999 Francia E-Test-DA, RFLP 516 Aislamientos clínicos Claritromicina 91% 100% 100% 99,70%
Ribeiro 2003 Brasil DA, RFLP-PCR 52 Aislamientos clínicos Claritromicina 100% -- --
--Marais 1999 Francia E-Test-DA, RFLP 47 Aislamientos clínicos Claritromicina 87,90% 100% 100% 100%
Vega 2003 España DA, RFLP-PCR 66 Aislamientos clínicos Claritromicina 84,80% -- --
--Alarcón 2003 España DA, RFLP-PCR 96 Aislamientos clínicos Claritromicina 89,30% 100% 100% 95,70% Dzierzanow ska
2001 Polonia DA, RFLP-PCR 33 Aislamientos clínicos Claritromicina 86,90% 100% 100% 76,90%
Garrido 2007 Chile DA, RFLP-PCR 10 Aislamientos clínicos Claritromicina 100% -- --
--Umegaki et al 200 Japón DA, RFLP-PCR 28 Aislamientos clínicos Claritromicina 100% 100% 100% 100% Baglan et al 2006 Turkía DA, RFLP-PCR 28 Aislamientos clínicos Claritromicina 100% 100% 100% 100% Kobayashi
2006 Japón DA, RFLP-PCR 7 Aislamientos clínicos Claritromicina 100% -- --
--Pina 1998 Francia DA, RFLP, DEIA 45 Aislamientos clínicos Claritromicina 91,30% 100% 100% 91,60%
Masaoka 2004 Japón DA, RFLP-PCR 41 Aislamientos clínicos Claritromicina 93,30% 90,90% 96,50% 83,30%
Sen: Sensibilidad; Esp: Especificidad; VPP: Valor Predictivo Positivo; VPN: Valor Predictivo Negativo; DA: Dilución en Agar
como especificidad del 100%. La gráfica de Forest Plot también mostró intervalos de confianza muy variados entre características operativas, debido al número de falsos positivos y falsos negativos presentes en cada estudio; el estudio de Kobayashi mostró un tamaño de muestra pequeño, evidenciándose en un intervalo de confianza poco preciso ? (@. Con respecto a la medida de resumen “overall” se calculó el valor global de la sensibilidad y especificidad y sus intervalos de confianza (S = 0.91 IC95% 0.88 – 0.94) y (E = 0.99 IC95% 0.91; 1) p<0.0001.
: & 7 3
Para evaluar si los estudios seleccionados cumplieron el requisito de homogeneidad se calculó el estadístico Q (DerSimonian ., 1986; Bermudez ., 2000) de la
41
Donde Efi es el estimador del tamaño del efecto del i ésimo ensayo; Ef es el promedio de los estimadores del tamaño del efecto de los k ensayos; y W es el inverso de la varianza del tamaño del efecto de cada i ensayo clínico (varianza de cada Efi).
La estadística Q se distribuye como una función de distribución χ2 con k-1 grados de libertad.
La fórmula aplicada permitió estimar el grado de heterogeneidad, arrojando los valores estimados en tabla 6.
Según los datos obtenidos se puede concluir que no existe evidencia estadísticamente significativa para decir que los estudios son heterogéneos.
42
, Valor de Heterogeneidad (Q) para la sensibilidad y especificidad *(α=0.05) con χ2= 19.62
Estimador del Efecto en
estudio Estadístico de Q
Valor de p *
Sensibilidad 0.66 0.78
Especificidad 7 0.99
: ' #
Con respecto a la curva ROC, se observó que los estudios que tuvieron mayor área bajo la curva fueron Umegaki y Baglán, puesto que ambos artículos presentaron una sensibilidad y una especificidad del 100%; el estudio que presentó la menor área bajo la curva fue el de Masaoka, ya que su sensibilidad fue del 93.3% y su especificidad del 90.9%. Los demás estudios presentaron diferentes porcentajes de sensibilidad, mientras que la especificidad estuvo alrededor del 100% ?9 &@
43
: +
Para evaluar la presencia de sesgos en este estudio, se utilizó el gráfico de embudo (Funnel Plot), en este se graficó el error estándar (precisión de la muestra) vs la sensibilidad y la especificidad del estudios (tamaño del efecto evaluado). El gráfico de embudo mostró asimetría hacia la izquierda, lo que indica posible presencia de sesgos de publicación ?9 ' / +@.
' Funnel plot para sensibilidad.
44
: 8
En cuanto a la hipótesis planteada se puede decir que no existe evidencia estadísticamente significativa para concluir que más del 90% de la literatura seleccionada reporte valores de sensibilidad y especificidad de RLFP-PCR frente a Dilución en Agar superiores al 95%. P>0.05.
: , ! D
Se clasificaron los estudios de acuerdo al lugar en donde se realizaron las pruebas y al origen de las muestras. Los subgrupos poblacionales identificados fueron: Europa, Asia y América latina.
El primer subgrupo poblacional fue el correspondiente a los estudios realizados en Europa, fue precisamente este subgrupo el que más estudios presentó (7/12). De estos estudios, todos proporcionaron datos para calcular la sensibilidad y 86% de estos (6/7) también proporcionaron los datos para determinar especificidad, que fue de un 100% para todos los estudios. En cuanto a sensibilidad, 6 artículos mostraron sensibilidades entre el 85% al 91% y 1 mostró un sensibilidad del 100%. En el artículo de Mégraud se observó un intervalo de confianza poco preciso (55%-100%) posiblemente por la presencia de un falso negativo ?9 8@.
45
El segundo subgrupo poblacional fue el correspondiente a Asia, a este subgrupo pertenecieron el 25% de los estudios (3/12). El estudio de Umegaki presentó sensibilidad y especificidad del 100%; el astudio de Kobayashi no proporcionó datos para calcular especificidad y los estudios de Masaoka y Kobayashi mostraron una sensibilidad del 100%. El intervalo de confianza de menor precisión fue el del estudio de Kobayashi para sensibilidad y el de Masaoka para especificidad (59%-100) ?9 ,@.
, ASIA: Características operativas RFLP-PCR vs. Dilución en Agar
El tercer subgrupo poblacional fue el de América latina, al cual correspondieron el 17% de los estudios seleccionados (2/12); ambos estudios solo proporcionaron datos para calcular sensibilidad la cual fue del 100%. Con respecto al estudio de Garrido, se observó un intervalo de confianza poco preciso (69%-100%) debido a un número de muestra pequeño ?9 :@.
46
H "% < %=
Cada vez es más frecuente la utilización de las pruebas basadas en ácidos nucleicos para la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana a través de la detección de mutaciones asociadas con resistencia, debido no solo a su efectividad sino al mínimo de tiempo que requieren para su desarrollo. Razón por la cual se hace indispensable conocer las características operativas de las pruebas basadas en ácidos nucleicos más frecuentemente usadas para obtener resultados más confiables. La Revisión Sistemática de la Literatura es un tipo de estudio que permite evaluar las características operativas de las pruebas por medio de la compilación de datos de estudios realizados con estas y su análisis estadístico.
H (
Uno de los inconvenientes que se presentó durante el desarrollo de este estudio fue la poca disponibilidad de artículos sobre el tema, pues si bien es cierto, que el uso de técnicas basadas en ácidos nucleicos es cada vez más frecuente, estas se utilizan de forma individual o directa, de manera que no se comparan contra un método de referencia como es la Dilución en Agar; además en aquellos artículos en los que se utilizó una técnica fenotípica para determinar susceptibilidad antimicrobiana previa a la detección de mutaciones asociadas a resistencia, fueron más comúnmente usadas técnicas como la prueba del elipsómetro (E-test) o difusión en disco, debido a que estas pruebas son de más fácil realización (Mégraud
., 1999).
El hecho de que no haya una prueba de referencia basada en ácidos nucleicos limita la comparación de la prueba RFLP-PCR a la determinación de resistencia o sensibilidad frente al antibiótico en estudio, pues la prueba de referencia (Dilución en Agar) no permite la detección de mutaciones y por tanto este aspecto no puede ser evaluado en esta comparación.
47
encontraron artículos donde refirieran esta técnica como método para detectar mutaciones en amoxicilina o levofloxacina, lo que limita el análisis de esta prueba a sólo un antibiótico y no permite comparar sus características operativas en una dimensión más amplia. Para la exploración de sesgo de publicación se utilizó el método gráfico del embudo “Funnel Plot” donde la simetría de la gráfica indica la ausencia del sesgo de publicación.
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Con respecto a los resultados, se tomaron como resultados positivos los aislamientos resistentes, pues a estos eran a los que se les buscaba luego la presencia de mutaciones. Se encontró que no todos los estudios proporcionaron datos para determinar especificidad porque tomaban como su número de muestra total cepas determinadas como resistentes por el método de Dilución en Agar, limitando el cálculo de todas las características operativas. Sin embargo, de los estudios que permitieron calcular especificidad, el 87% proporcionó una especificidad del 100%, mostrando que esta prueba evita detectar falsos negativos. En cuanto a la determinación de sensibilidad, se encontró una variación que va del 85% al 100%; esto se debe principalmente a que a las cepas resistentes por Dilución en Agar sólo se les identificaron las mutaciones más frecuentes, sin embargo, el hecho de que la prueba no determine la mutación, no quiere decir que la cepa no sea resistente, pues es muy probable que presente otras menos comunes. Las mutaciones detectadas en los estudios fueron A2142G, A2143G y A2144G reportadas por 7, 12 y 4 artículos respectivamente (Alarcón ., 2003; Baglan .,2006; Dzierzanowska .,2001; Garrido .,2007; Kobayashi
.,2006; Marais ., 1999;Masaoka .,2004; Mégraud .,1999; Pina .,1998; Ribeiro .,2003; Umegaki .,2000; Vega .,2003), ya que estas son las principales asociadas a resistencia en .
48
Los sesgos de publicación se evaluaron mediante el uso de las gráficas de embudo “Funnel Plot”, estas gráficas mostraron asimetría para ambas características operativas; aunque el sesgo de publicación ha sido asociado con asimetría en la gráfica de embudo, es importante recalcar que también debe ser considerado como un recurso genérico para examinar si los estudios pequeños tienden a mostrar efectos de tratamientos o de técnicas más grandes (Clarke ., 2003). Dado que los artículos incluidos en este estudio presentaron tamaños de muestra reducidos, es posible que se hayan incrementado los resultados que favorezcan las características operativas, asignándole más “positividad” de lo que realmente tienen. El sesgo de publicación también pudo ser generado por la tendencia de la literatura médica de publicar estudios con resultados efectivos, reduciendo la posibilidad de encontrar estudios con resultados negativos (Bermúdez ., 2000).
En cuanto a los subgrupos se encontró que la región que más estudios desarrolló fue la de Europa, presentando los mejores datos de especificidad en contraste con los datos de sensibilidad que fueron muy variados; la región de América latina presentó mejores datos de sensibilidad (100%); sin embargo, esta región fue en la que menos publicaciones se encontraron con respecto a las otras regiones, esto puede deberse a la poca exploración de técnicas basadas en ácidos nucleicos y a la falta de recursos para implementar la técnica de RFLP-PCR.
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49
* < % #
( Se encontró que la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa de los Polimorfismos en la Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP-PCR) no presentó características operativas iguales o superiores al 95%, comparada con el estándar de referencia Dilución en Agar.
& De los antibióticos evaluados, el único que permitió determinar las características operativas para las técnicas RFLP-PCR y Dilución en Agar fue la claritromicina, presentando una sensibilidad y especificidad global del 91% y 99% respectivamente.
' No se puede realizar un análisis global de las características operativas de la técnica RFLP-PCR con respecto a los antibióticos motivo de este estudio porque no hay suficiente información disponible, ya que no se han hecho investigaciones sobre el tema.
+ El análisis estadístico mostró que los estudios incluidos en esta revisión sistemática fueron homogéneos.
8 Hasta el momento no se han realizado estudios experimentales ni revisiones sistemáticas de la literatura que comparen las características operativas de la pruebas basadas en ácidos nucleicos (RFLP-PCR) con la Dilución en Agar para determinar susceptibilidad antimicrobiana para en Colombia.
, Las revisiones sistemáticas requieren un esfuerzo considerablemente superior que las revisiones de literatura convencionales.
: Este es el primer trabajo de revisión sistemática de la literatura realizado en Colombia sobre pruebas basadas en ácidos nucleicos para detección de resistencia antimicrobiana.
50
(I # 0# "! % #
Se recomienda llevar a cabo estudios en los que se tengan tamaños de muestra mayores y que utilicen tanto técnicas basadas en ácidos nucleicos como técnicas basadas en cultivos, de manera que estas se puedan complementar y así arrojar resultados más confiables, de manera que se puedan realizar nuevas revisiones sistemáticas con el objeto de analizar métodos modernos.
También se recomienda realizar investigaciones en Colombia que permitan determinar las mutaciones asociadas a resistencia presentes en las cepas de
colombianas, especialmente aquellos antibióticos que no fueron evaluados en esta revisión.
Adicionalmente se recomienda realizar estudios con la técnica RFLP-PCR con antibióticos diferentes a la claritromicina utilizados como terapia erradicadora de , para poder evaluar las características operativas de esta técnica de manera más amplia.
Por último, se recomienda la estandarización de la prueba RFLP-PCR con el propósito de aplicarla en los laboratorios clínicos como prueba de rutina, ya que esta prueba pueden ser una alternativa para detección de susceptibilidad para
51
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