UNIVERSIDAD A U T O N O M A DE NUEVO LEON
FACULTAD DE MEDICINA
INTERACTION DE LA PEROX1SOMIONA A1
CON EL F A C T O R DE NECROSIS T U M O R A L ALFA
IN V I T R O
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Q.F.B. MARIA SACHIKO LEO W O N G
Como requisito parcial para obtener el Grado de
DOCTOR EN CIENCIAS con Especialidad en
Farmacologia y Toxicologia
U N I V E R S I D A D A U T Ó N O M A D E N U E V O L E Ó N
F A C U L T A D D E M E D I C I N A
I N T E R A C C I Ó N D E L A P E R O X I S O M I C I N A A l
C O N E L F A C T O R D E N E C R O S I S T U M O R A L A L F A
IN V i l R O
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Q . F . B M A R Í A S A C H I K O L E O V V O N G
C o m o r e q u i s i t o p a r c i a l p a r a o b t e n e r el g r a d o d e
D O C T O R e n C I E N C I A S c o n e s p e c i a l i d a d e n
F a r m a c o l o g í a y T o x i c o l o g i a
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I N I K K A C C I O N l > K La H Ë R O X I S O M 1 C 1 N A A l ( . O N y 1, l ' A C ! O K J>>
N K C R O S I S T U M O R A L A I . P A t» W w w
A p r v l m c u' M d e I« TC M S :
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D R A . m i ' i L l O l ^ p l ' . S < ¿ A R 7 . A I K ' A I S A S C o m m o n d e I e s »
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D R . e o C . M A R I O O . S . A R « A 4 I N A S C A R M O N A C o m i c o » d « l<»sis
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I N T K H A C C I Ó N l > K i A P K R O X I S O M K ' . T N A \ \ C O N t i .
F A C I O R D E N V . C R O S I S T l l M O K A I . A l . V . X l > M I R O
Pro^ciiiadct jvftr
o r a M o n a S d d u k u L w W o t i g
M e U7kh%jr> f u e ruMltzadn e n cl D c p a r u u n c n t f t d e V i u n d c i i l i i ^ » y 'IVnKvloKia (Je to FiCdJujO de M v U u u ü <k l a U n i v e r s i d a d /Vutànuoei 4 « Nu««t> L ^ i u . b u i « te
M a r i J S a c b i k o L e v W o n g F o c h a d e i n J u u u i n n ; M a r r o d e l
U o i vcr»wln<1 A i u ó n o c v * iW. NIIEVI) I f o n f j r u l l ' i d ti»* M r i l i n i k i
l ' i m l o d e ) fcí«T»i<iikr l N l ' K H A C C I O N I I P, \
1 * K H O X I f c O M l C l ^ i A A l C O N l . l F A C T O H N M R O S 1 S I T M O B M A L F A I B v r r t t o .
N ú m e r o íle p ) i g ¡ n a & 111 C a n < l i d a l o p a c a l u o b t e n c i ó n d e l g r a d o d e D o c t o r e n C i e n c i a s c o n c - p o c i . i I i d a d e n F a r m a « o I o g) a y T o x i r o k i g fa.
F a t n i a c o l o g ¿ h y I u * j c o l e g í a
P r o p ó s i t o y M ' l ' U l o d t h i f U d i u : lái b j s i | u M ] ) de «k U i t ü t n i <nl v CMTOFTTM en h j u t l r i
a m i s «j c á n c t , ha c o t d u i t<k> «J rlr i w r a c r i n n r a » r t r e .twrnM^iiAfKot. » floiw I t i i n k - r i M i r i K a | M i u < a s laminen poMnciacirt«i [ r r m i k n di»ntiuu¡a l u A n i J r )<e n ^ m e v U n u i u t U r f l e m a I t j v i t normal y kB e l ^ l t * i f ú e ^ d M » .
Iv»tw l p l t i | o < 1 0 9 <amn> resultado <IH i n l e ' v i de Ilei«rnunar b «uSIcrKid y l i j j u d e ¡tiierjcción u t i n í I» A I ( P A O y H I « t u f de n r ^ i i u i l u n v m l ( I N I - ) ya c|i«t a m h f v < w n | a * w s han d c n u s i n u b e f e w « ' a u n i u A , láJcs u i d j t n u c i d o d c i e r w <iHnlas d u m « »o» ^ la actividMl A la e u J a s i . Ottrern«niíi del mimen> y u m a A o d e pcroibMjmaa, ifitmhneitopvnia y
eii iBiJCnlCR. A d e m á s «e e x l u d í o «I e f c c u t «cnMUIiüKlur d e la Actii«ann.i'ia D ( A e i )>) t n h r e el l'NI* pr* j e m a en la r/wnhinat 1 i*m V A I * T N t ' y el d c v U t U m a i ile l a t c o n l ' i i x i i i n í i PA H M n o m k i o e y P M < S f l u o í o i i f t c i l o m " c i u kíi»«a%
f"ara m u d i r la c i i o m u c i i L t d d e u i u w l w u n e i a . « v e n ] i l c J i u n l o s i M i o d o t de t i " l de m p e n r x n a x f d ú g c o , W T T y S R K . Ja <Jti«Tinir»;irti) M U | « de Í A K < v / j n n v i ^ i m u de mnln|>lMaci(Sn e í v ^ i i d d e enmVxnarjt'»» i I m c t v a p r ftcicnhiUiii.
( X M / I O M l o n e i y f . M i c l i i A i M i v b a s e e n Jos r c s u l u d o t se c o n c l u y o qiK la P A I i m t i s c c i u n ^ de n a i i e i d ujm el T K h en l u lnteaa «xJulatvs d e hrpHKnna ( í ' L O J ' R J - ' S ) , asfcn iw <H«T*»2), affejxrf la. tfe m a n f c <KI'-2U) y < a . cárvtK (NI11A).
R p r n i u l o m i t i M <00 lo Ael O m u n r i i l u Ib v n a i h i l i c l t d a la i^lúli&ts del INI* p r e s i o n e 011 la c m n h n K K M l ' A I + I N F . sin e m b a r g o el d a i w se o b s e r v ó en las ceiuUre». es d e t í ' 1 » w ITIAÍHUVO I« K l a i i > i d d < l , e s t e hcclv» p r o r » " re&ha/ar «J p w t ' í w m i r m t f c m i» Art l> p ^ p c * < n l * n K i « t ( ^ r i el c a i u de la u n b i i b C i O » P A l - M t V n i i r c a r t í k U ^ i n v ó pMcitCiavi en l¡a£ i c l i i l . u ck attenot .1. r k col.irt <lxwn> y ( l k p l « 2 ) . p a <1 contn>nt>*n U c o m U i H c i ü n P A I * 5 - l 1 u o r a u n c i l o te D b u T w i m « r > c t a M i d c i a i u n ) « i g « n u c c n k a .
D a l i c o t t U (««i» a m i q u e r i d a m t i r i r ú . M m i t G « a d a l u | > e
q a k o c o a s u e j « n p l o m « i « v u a » d i s f r u t a r i n t c a s a n t « « t v c a d a i n o m c i t n d e l a v i d « .
\ t n i m a r a v i l l o s o « j w » J u a a I l d e f o n w M n i j«r»n m a e s t r o d e i a » p * r m a a c n c i A .
A C R A D F . C I M 1 F . N T O S
( • r u c i a s a l G r a a t i | i i r i | o p u r el ( C ^ a l o d e la v i d a , l a y l u h e n r i i c m n c *
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A m i p a d r e , J o s ¿ A h i a h a n , p o r t r a n s m i t i r m e d a m o r a la l e c t u r a , s u s c a v i h a ^ z i u y u b m u j n s c j i » s i e m p r e e s o r í n e n m i m e n i ? y c o r a z ó n .
A T « i * h r r n (VM «u y a p o y o
A l l>r. m e d . A l f r e d o P i A e y r o p o r s e r p a r t e d e m i h i s t o r i a , p o r c o m p a r t i r «I pavytx.it> K a i w i t i i k i a . p o r t u c o n s t a n r c a p o y o . t r a b a j a r c o n él f u e u n y r a n d d e i l e
A l a I k r a . L a a r a g. M a n i « « « 4 « V l l l a r r « ! . 51 o su yuia» « x p v n v a c i a v p a ^ ' v / K i a e s t e t r a b a j o n o h a h r i a $idi> p o s i N c
A k a M í u m b r u s d u la C o m i s i ó n d e t e n i s : D r a . a e d . L o a n ) « ? ( » a r a O . . D r . ( J . M a r i o C é a a r S a l i a a & C . , P h . |>. J u l i o S c p ú t v c d a S . y l>r. med. focar l o r t r s A .
IV>f s u !>cni|">, ^ c i l a U criticai y v a l i o s a s » u g t i r n u a » .
A l a D r a . V i c t o r i a B t n n ú d c s t d « R n c f e a p o r s u * c o m u r t i ^ r a ü a b r a * <ic à n i m o
A l P h . I L S a l v a d o r B o r r e g o A . P o r sai Ayuda e n el u m l m i e s t a d í s t i c o
A l a Q . C . R . M » y » ¿ C o n t r o r a « G, T i i s g l a n d e s ( l a b i l i d a d e s l u c i e t c n « « t e " a b a j o « i g u a l m e n t e imacSci m e j o r , £ ( a c i a ¿ p o r t u a j n i s t ^ l '
A D o c t o r « M a r t h a S a l a z a r y M a r e o F l o r e a p o r s u c o n t i n u a y d c ^ i m c r e s a d a a y u d a .
A l S r . R o b o t < * » o w í l « A - , Q - C . R . K c o « t i a r r í a M „ B l a u q u Ü a < i o a » 1 c x . a c o a a p a r l e r o s d e d o c l v r u d o j t r a b a j o y a t o d o * a q u e l l o s Q u i e n e s n o Kc n o m b r a d o a q u í
T A B L A OK C O N T E N I D O
C a p í t u l o
I W T R O D I ^ f l Ó N
P á p n a
(
2 M A l t K I A L Y M t l X > t M J S 1 7
2 . 1 M a t e r i a l 17
7 1 I 1 "H2<S ( Z - l u U l S I S
1 \ 2 M a t e n a J p l á s t i c o 1S
2 . 1 . 3 M a i u r u J t i c v i d r i o 1 6
2 1 4 A g e n t e s a m i n e o p l á s i c o s IK
2 1 4 ) Percutís« » m i u n a A l | f ¡
2 1 4 2 F a c p t r d e n e c r o s i s »uino™f re ( T N F J
K x u i i i b i i v i i i u h u m a n » ¡ g
2 ) 4 3 A c t i n c m i n n a f> 1 9
' 1 4 4 M i t o i r i c i n a C | y
2 ) . 4 S ^ - f l u o f o u r o c i l o
2 I 5 K e a c l i v o t
2 ) f> r x ) u i p i t KUIK-IUÍ ) 9
2 . 2 M é t o d o s 2 0
7 7 I l í n e a s c e ) u ) « i c »
2.2. i. I ( . ' n t c r i M d e s e l e c c i ó n 2 0
2 2 ) . 2 M a n i e o i m i e n t o d e l a s l i n c a s
c c l u l o p & 7 1
2 . 2 I 3 P r e p a r a c i ó n £ i n o c u l a c i ó n XI
2 . 2 2 A m i n e o p l o s i c o ? ( v > l u b i ) i z a a ó n y d i l u c i ó n ) 2 3
2 2,2.) P í r o n s o m i c i i s A I 2 J
2 . 2 . 2 2 K¿etor d e n e c r o s i s t u i i t o r a l a ) t k
2 . 2 . 2 i A i u m m i c i n a D , M i t u m i c i n a C y
O p i r n j A
2 7.7 4 F > | > r » s i c i o n i n i i R u r r c n l c rlc.
P A J + T S P
2 . 2 . 2 5 P r c t r a u m i c n t o COTÍ A c u n v i m i im) U
2 2 2 6 K»po$icj<Jti c o n c u r r e n t e P A l - M i t y
P A I - 5 F O
2 2 3 I n c u b a c i ó n
2 2 4 k v a l u u c i ó a d e la C i t v t c u c i d k ]
2 2 4 I fcvaluaeiAn i D o r t o l ó g k c a
2.2.4.2 P r u e b a ú e « x < l u s i 6 n d e c o l o x á i i t e
A z u l d e T r i p a ñ o
2 2 4 3 Pwt*> dL- MTI'
? ? 4 4 P i u c t e J e siilfu(«xb*inirH K
2 7 *> F v a l i m o ó n d e lus l i t i o s
2 2 5 1 M o r f o l ó g i c a
2 2 5 2 P x c l i f i ó n d e c o l o r a n t e A I
2 2 5 3 P t u c h a dw M ' I T
2 2 5 4 P r u e b a d e S u i f u / o t f c i r n i n u H
1-RIM-ha d e A N O V A
2 2 6 O e f i m c i t m d e la i n l t i u c o ó r
3 K K S I I L I A I K I S
3 I A v a l u a c i ó n m o d o l o g i u .
í ) I F x p o M c i o n a P o r o x i v u n i c i n a A 1 p<« 4 8 b
3 1 2 E s p o s ^ ó " «
3 ) 3 ) j > p o « i u ó n a P A I » T N F
3. I 4 P f c t r a t a n M f f l ' o c o n A c i i n o m i c i n u D
3.1 5 I'.Icelo rlp la T'AI c o n a n t i n o > p ) á s i c o s
1 1 5 1 L i e c i o d e l a a d m i n i s t r a c i ó n
C4MrihiniMÍa d e P A I < M i l o m i c m a
P ó g m a
C a p i c u l o l ' x p o »
1 M 7 K f r c i o <le l a » d i r i o t » l i " i : i ó o
a h t i b i n a d a P A 1 * 5l luoroiiracil<> 4 4
3 . 2 V i J l a i c i A n c o n \ o i ) rtr I n p a n o 4 3
3 2 1 l - x p o s i o ó n a l ' A l 4 5
3 . 2 2
Lteto
a la « c p o s i c i ó ü a T N h 4 83 2 3 t f c c i ü d e l a a d m i n i s l i a i i ó n c n i r i h i n i n J o a
P A l - T N r 4 *
3 2 4 f r í t / M i u n i c m o A t f i n o m t f i T n T> 5 0
3 2 S b ' l e t t o d e la c x p v s K í ó n d e la I ' A 1 c o n o t r o ^
a n l i n o t p l á s i c « * •>!
% 7 *> 1 K*f*>sn»ÓH ¡t In I ' A 1 * M | ü > m i c : » « i C 5 )
^ 2 5 2 r e p o s i c i ó n a l a P A I • 5
-K l u u r o i m e i l o $ 2
3 - 3 K v a f a a c i ó o c o a M ' I T
3 3 ) H e e t o d e la e x p o s w j o n a P A I S ^
2 h f e e i f v a la c x p u i i u i u » « ("NT 5 8
3 3 3 L f e c t o d e la a d m i n i í t r a c i ó o u r n i b i n a d a a
l ' A l + I N F 5 9
3 3 4 S o b r e v i d a c c l u J t u u l w u o i O e x p c ^ i u ó o d e
P A I y ?Al < I"NK M
T f e c i o d d pri.trau«m»cTMf> c o n A e t i r w m j c t n * I ) 6 5
3 3 . 5 1 b c r u i b i l i b a c i ó n p o r l a 6 1
3 3 5 2 S c u s i h i l i a c i i i n p o r 2 4 h
^ 3 6 C f c c l u ik- 1aít*po«iCi<iH J e la l ' A l i ^ m o ' » m
a j r t i n e o p l a $ i o * > 6 9
3 ^ 6 1 K v p n s K W x i a la T a 11 M i i o m i c t r * C ft<>
3 1 6 2 K * p o s i c i ó n a l a P A I 5
C a p í t u l o l ' i ^ i o a
. L 4 li-VaJuaciÂa r u * S R R 7 2
3 . 4 . 1 L f a a o de l a c x p o & K i ú n a P A I TI
3 4 . 2 K J c c i « * la c * p o s » a ó n s T N F 7 5
3 4 3 h f c c t o d e la a d i r i m i s u a c t ó i i c u i i i b i i i a d a a
P A K T N P 7 6
3 4 . 4 K f c t i o d e l p r c i r a f a m i c n t n c o n A m n o m i c i n a D 4t0
3 4 . 4 . 1 S e o s j b i l Í 7 ú c i o o p o r i h
.1 4 4 . 2 S e a s i D J i z a c t o o p o i 2 4 ti SO
T d í F í c e l o d e la c a p a n i c m n <Jc la P A I c o n n i x n
a c t u i i v p l á s i c u s 3 3
3 . 4 . 5 1 l ' j p i s i c i ó n a la I ' A W M f t o m i c i n a C VI
S 4 . 1 ? P v p o s t c i r t n a l a I ' A l i S
-I l u o r o i t r a c i l o M
XS A o á l i s i s d e 1a í n K r a c c á ó n 8 5
3 . 5 ) C u i n U i n a c i c r i P A I < I N I - 8 5
3 . 5 . 2 E x p o s i c t ó o a P A I
>.5.2 1 S c i i s i b i l L o c J ú n p i e v i u cor» A c l - D
p u r I h RR
3 . 5 2 2 S e n s i b i l i z a c i ó n p r e v i a n o n A d - I )
p o r 2 4 h 8 9
3 >.3 E x p o s i c i ó n o P A H Ï Nf «»)
3 5 3 . 1 S c i u i b i l i 7 a c u r i l p u r v i a u m A d * l >
p o r I h W
3 . 5 i 2 J>t*nsibiíi2dci<^n p r e v i a c a o A c t - Ü
p o r 2 4 li <p|
3 5 4 E x p o s i c i ó n a P A I » M i l 0 2
3 5 S FxpoMCioxi a l ' A U
Ca|»ir«do P á g i n a
4 D l & T I T S I O N 9 4
4 1 T u * j c i d a d s e l e t t i v a d e l a P A I '>5
4 7 Livctci d e l 1741' s o b r e d i Htni¿i£ l i l l a * c e l u l a r »
4 3 ( J n n t h i n a c i ú n P A | » T N h
4 4 S « u s i b i l i ¿ a t ) 6 t i w m A c i - D |f*>
4 S C o m b i n a c i ó n P A 1 - M f l l y i
4 6 0 , n m h i n a c i ó n P A I t ^ F U 102
4 7 C o m p a r a c i ó n d e l o s meuvlcw» de c v n l u n c i ó n |i>2
í t O N O , I I S I O N F S , P K R S P K C r i V A S Y
( O M u r m n o v t s j e n
5 I O o i K l u ü i i m c A KM
5 2 T V r ^ p r c i i v a * j ( n
1 ^ C o n t r i b u c i o n e s IOS
L I S T A D E F I G U R A S
f-iRiim r a ^ m s
l a D í m í i i I i « u(p6<> <ie c u r v a s d e i i i l « i a u ¡ A n d e n > e d j c a o K m o s 3
I b E j e m p l o ü c í s U g o a i s m u v < t m p « l i ü * o e i U r t e l K ^ - 5 9 2 y «I
p n v p r n n o l 4
2 K a i w i m k n h u m b o l r l l t a n a c o n f r u t o v e r d e y $
3 T o u n a » a i s U d a s d e l I r u t o d e K. b v u n b u k l u a u y >ia¡ e l e c l w 7
4 K M j u c n t a c v m p u e a f i z a J o d e ' T N V »IT« I I
5 S e c u e n c i a d e a m i n o á c i d o s tliil F u c t o i d e n e c r o s i s l u m e i a J
a J I a ( i
6 h j i ^ n p l i » ik* d i ^ i n b i t r . k i n d e iifw p l ^ A d e p o z o s 2 5
7 A L i n e a s c e l u l a r e s e x p u e s t a s a P A l 1 T N f y c o n t r o l e s 3 0
7 I J L i n e a s c e l u l u r o i e x p u e s t a * a P A I ' l M ' y c o n t K ' f c a 4 0
7 C L i n e a s c e l u l a r e s e x p u e s t a s a P A l ' I N I y c o n t r o l e s 4 )
8 V i a b i l i d a d d e l i n e a s celular*.-« e x p u e s t a * a P A l p o s 4 8 h .
P r u e b a d e u / u l d i i U i p a n u 4 5
9 C S n l v d e m c l a n o m a tcftiilns w i n A711I d e t n p s n n 4 9
IQa C u r v a s d o s ^ - r e s p u e s t a d e l í n e a s c e l u l a r e s c v p u e s i a * a
P e r o x i s o n u c i n a A ) p o c 4 K h S I
1 0 b C u r v a s d o s i s i f S f n £ « ( A d e c c l u l a s d e l " h u n f t , h c p a k i m a y
h c p a t o b l x s l o m a e x p u e s t a s a P A l p t » 4 S 1i, e c u s u *
r e s p e c t i v a s l i n e a s d e c o r r e l a c i ó n o b t e n i d a p o r m o J e l o
p i ^ t c m á l k c o $ 5
1 0 c C i u v a k d o s i s 1 i m p u e s t a J e i^IuJiiS d a c u l ó n . o d e n a C a . d e
c o l n n y a l c n o C a d e m a m a e x p u r g a s a P A 1 p o r 4 S h , c o n
r c c p c c r t v a & U w d « c o r r e l n c i ^ B o b i e n d a p o r m c x l c l o
m a t c m a u c o $ 6
1 Ud C u r v a s d u s j s r e s p u e s t a d e í i b r v W a i t O i , p i u l a s d e roelanoma
y C a . d e c ú i v i x e x p u e s t o s a P A l p o i 4El h , c o n s u s
r e s p e c t i v a s t i n c a n d e c o r r e l a c i ó n o b t e n i d a p o r m o d e l o
J i f c u r a P e c i n a
I S b ( C r e c i m i e n t o d e c é l u l a s d e C o l o n , A i i t a u C U . d e u i l i t a y
A d a w C a d e o i a i x u e x p u e s t a * a PA>, T N P y P A i » )"N> p o r
4 8 h . P r u e b a dg S R B 7 8
) Se C r e c i m i e n t o d e ( i b i o b l i u i u » , c é l u l a ; e s d e D i e l a r o m a y C a .
d e c e r v i v e x p u c s i a s a P A l , T N F y P A l < T N F p o r 4 R h .
P r u e b a d e S K B V*
1 9 a C r e c i m i e n t o d e c é l u l a s d e h í g a d o d e C h a n g ,
h e p a t n h ) a & l í t i n a . c a l m i y a l c D o T a de. r o l n n c i p u e ^ t a * a
l ' A l y P A J ( T N F p o r 4 X h . S e n » b i l » ¿ a t H > o p r e v i a c u o A c M >
C ' j u j / m l , } p o r 1h y 2 4 h P r u e b a d e S R U t i
) 9 h C r e c i m i e n t o d v fibroblastos, c é l u l a s d u a d c n o C s . d e m a m a ,
mclanotna
y a d e n o C a d e e é r v t x e x p u e s t a s « l ' A l y P A l i T N I ' p o r 4Kli. S e n si luí i » a c i ó n p t e v i a c o n A c t - U( I p y / m i •) p o r i b y 2 4 b . P r u e b a d e SsRJi 8 2
2 0 L i n c a s c e l u l a j e ^ J a s a P A I , M i l y P A I » M U ( p e t o T . )
p o r P r u e b a d e .SRR 8 3
21 L í n e a s u l u l a r e * e x p u e s t a s a P A ) , 51-1) y P A 1 - M U
0 / p / í n J .) j * > r 4 í í h . d e S K I J 8 4
2 2 C o m p a r a c i ó n e n u « l a V i a b i l i d a d o b s e t v a d a V B T S U S l a
v i a b i l i d a d e s p u r a d u d u l i n c a s c e l u l a r i a c i p u c l a i a
P A I • l*NF ( P n i c b a d e M T T )
2 3 a C o m p a r a c i ó n c M r c la v i H b i t i d a r i o b s e r v a d a v e r s u s l a
v r a b j l t d d d e s p e r a d a d e l i n e a s c e l u l a r e s c i p u c s i K a P A l
previamente" « t e n s i b i l i / a d a s c o r A a - I ) p o r I h 8 8
?1I> L o m e t a t a c ó n i i d r c 1% v i a b i l i d a d o b s e r v a d a v e n t u s l a
v i a b i l i d a d e s p e n d a d e linea& c e l u l a r e s e x p u e s t a s a P A l
p r e v i a m e n t e s o % s i b i l i a d a s c o n A « I ) p o r 2-Jrt V9
2 4 a C o m p a r a c i ó n e o t r e la V i a b i l i d a d o b s e r v a d a v e r s u s l a
v i a b i l i d a d e s p e r a d a d e 1 i o e a i c e l u l a r e s e x p u e s t a « a
U S T A D F T A R I A S
T * M » 1>4B»
I A c o o D ^ d e T N F c i i aJ¿'U<ia¿ c é l u l a s b J a j i c o ( 2
2 a K v a l u a c i ó n i n o i f o l i j y i t a d e l i n e a » w l u l u i u s e ^ p u u a » <
P A I p o r 4 8 b "15
2 h C o n c e r n r a c i o n c s m f t w t m a « , r i n f i i f n i a y m í n i m a s d e l ' A l
c o l i n c a » c e l u l a r e s e x p u e s t a * c o m p u e s t o por -iHh
t H v o l u a e i o n n t o c l o l n g i c a d e l i n e a s c e l u l a r e s e x p u e s t a s a
T N F p o r 4 S h 3fi
4 E v n l u a c i ó n i n o i / b l ó ^ i c a i d e l i n a i ( x - ' u l ^ t c s a
d o s d o s i s d e P A I e n c o m b i n a c i ó n c o n ! , 5 , II) y 1 6 0
ug,*ml i k ' I W p g c 4 K h 3 ?
5 1'.valuación m o r f o l ó g i c a d e l i n e a s c e l u l a r e s e x p i i c v i a s a
P A I y l*A C C N I p o r 4 3 h p r e w i M l u A d a i c o n I i t ^ m L
d e A c l i n o m i c i n a D p o r ) h y 2 4 h 1 2
6 F v a l u a c i ó » m o r t b i d R i c » d e l i n e a « c e l u l a r e s e x p u e s t a s a
P A K M i l y P A I «-Mil p u i 4 S l i 4 4
7 F v u l u a c i ó n m o r f o l ó g i c a d e l i n c u s c e l u l a r e s e x p u e s t a * a
P A I . 5 K U y l ' A I i S F V | * * - 1 8 h 4 4
Xa V i a b i l i d a d d e l i n e j s c e l u l a r e s e x p u e s t a * a
P c n i x i i H A t i c i n B A l p o i 4 B h P r u v í « d e i i / u l i k ' i n p o i H i 4 ?
Xh C o n c ^ m i r a c i o n c s m a x i j n a s , c i r i f i i n i i . i y m í n i m a * d e P A 1
0 1 l i i m a * c e l u l a r e s c i ) i u t . > ( d t »1 com|M«cslo p o r 4 8 h A71J
¿ s t n p a a o 4 7
9 V i a b i l i d a d d e l i n e a s c e l u l a r e s e x p u e s t a s a d o s d o $ i s d e
P A ) y oclxo c o m b i n a c i o n e s d e P A W T N F p o r 4Sti >>Twefc»
de Azul de i n p a t o 4 8
1 0 V i a b i l i d a d d e l i n c a s c e l u l a r e s e a p u e * t » x a 1 ' A I ,
P A 1 • T N F p o r 4 8 h y n o « . n s ¡ b i l i / i i l « y s e n s i b i l i z a d a s
coi» d e A c l i n o m i c i n a H p o i I b y 2 4 h . h u « t a d a
A z u l d e t i i p o n o SU i n a
' ( ' o b l a P á g i n a
11 V i a b i l i d a d d e t ú i u t h i x i u l u c s » p n i t w a T A I , M i l y
P A ) I M i l p o r 4 X h . Piuefca d r A ¿ a J d e V i p a a o 5 2
1 2 V i a b i l i d a d d e l i n e a * c e l u l a r e s e x p u e s t a s a P A I , 5 F U y a
la u t m h i n a e i ú n d e K A I * 5 F U p i n 4 8 h P r u e b a d e A z u l d e
c n p a n o S ?
I * C o n c e n t r a c i « * « ; i n h i b i t o r i a s 5 0 ^ ( C I 5 0 ) d e l ' A i y i NI*
e n l í n e a s c e l u l a r e s e x p u e s t a s u l o s c o m p u e s t o s p o r 4 V h .
P r u e b a d e M T T
1 4 S o b r e v i d a d e l i n e a n c e l u l a r e s e i p u e ^ l a ^ a P A l y
P A 1 + 7 N F | x w 4 3 h C h I u v o | i u i l < i n ^ i > e n a u s e n c i a d e
k i t u o m p u m U n p o r T2h. P r u e b a d e M ' I T 6 4
15 C o n c e « r r a c i n n c A t n h i h i i o n v SOV. ( C ( s f l ) d e M i t u m i v i m
y * f J u o r o n r a c i l o « o d i f e r e n t e s l i n c a s c e l u l a r e s d e
a c u e r d o a l a g r u e b a d e W I T 6 0
16 I n h i b i c i ó n t o t a l d e l c r e c i m i e n t o ( I T t l ) , i n h i b i c i ó n d e l
c r e c i m i e n t o 5 ( J % ( 0 ( 5 0 ) y c o n c e n t r a c i ó n l e t a l *>0*»
( ] . C 5 t > ) d e l i n c a s c e l u l a r e s e x p u e s t a s a P e r o x i s o m i c i n a
A l p u r 4 8 h . 7 4
17 í n d i c e s d e c x i m b i r u t L i ú n d e l í n e a s c e l u l u i u s e x p u e s t a s a
P A I • l"NF 8 7
A B R E V I A T U R A S
A r i . l ) A v u n o n n e n a D
A d e n e g a . A d u n i M i i i i i i v i M i i
A N O V A AnàJi545 d e v a n a n a e l i t r e g m p i «
A T C A c v l n i r d o m a c t i i c A
Q L C u r c i i i o n v i
C l i o C o n c e n t r i K k i n i n h i b i t o n o 5 0 %
C O ? B i o n d o d e c a n n i n o
(-TI5U r v i K i u i l i n i ' i ^ n I o n a
<*] m a x C o n c e n t r a i : i ó n l ò x i c a m a x i m a
d i n i n ( R i n c o n t r a i i6n i n x i c a m i n i n \ a
° C O a d v s t c l s i i a
r i M S O D i m e t t i s u l f o v i d u
G i W jnh(bici<in d e l c r e c i m t e n t o 5 l > %
CIRI" IhIiiIiicióii l u l a l d e l <Tf*NMU*nl<»
F i g u r a
S F i ; 5 - F l u o r o u r a c i l r .
H I I V I J
1C I n d i c e d e c o m h i n e c m n
1 . C 3 0 C < w i n i r a r . i o n Icial
M M o l v
M U M M e d i o m i m m o e s e i i c i o l
M i t M u l t i m e d i a C!
m i M1I1 l i t r o
| i L M i C 7 o l ì ( r o
M I T 3 ( 4>5 ) d i m c l i l 1 i b / o l - 2 2 , 5 b r o m u r o
0«fi-mi t u l i t r o l i o
C A P Í T U L O U N O
I N T R O D U C C I Ó N
E l c á n c e r , e n f e r m e d a d q u e p u e d e a f e c t a r a d i s t i n t o s ó r ^ a r v v s y m j x l o v e s
c a r a c t e r i z a d a p o r l a p r o l i f e r a c i ó n d e s o r d e n a i l a d o l a s c é l u l a s , l o q u e p r o v o c a
gTHvcs » l l u m c n m c ; u n l a f u t i r í a y e t i | j f i u i c i ú n i l c l o s t o j i d o s H f n ' t í u l o s E n 1H
m a y o r í a d o l u s c á n c e r e s , l a t c é l u l a « e t i l c n i i a í s e a g r u p a n e n m a s a s d e n o m i n a d a s
t u m o r e s m a l i g n o s , e n l a a c t u a l i d a d e s UJI p r o b l e m a d e s a l u d m u n d i a l D e s d e h a c e
a ñ o s , s e h a n l l e v a d o a c a b o i n n u m e r a b l e s e s f u e r z o s p a r a p r o v e e r d e n u e v a s
o p c i o n e s t e r a p é u t i c a . A s í , s e h a o b s e r v a d o q u e e l u a t a m i e i u o c o n 361o u n
m e d i c a m e n t o p r e s e n t a l i m i t a c i o n e s c l a r a s , y a q u e s o l o e s e f e c t i v o Si <1 t u m o r s e
e n c u e n l i a e n u o e s t a d o d e I v c d i A K K ' m l e n i | > i d t M A d e m á s , l a U n i c i d a d h a i : í a e l
t e j i d o n o r i n & l y l o i e f e c t o * i n d e s e a b l e s h í u i s i d o s i s t e m á t i c a m e n t e m o t i v o d t t
c s i u d i o P o r e l l o , l a b ú s q u e d a d e e s q u e m a s d e t r a i a m i c n c u e x i t o s o s h a c o n d u c i d o
I*oi l o c¿üuo; l a a J i i i i i i i s t r j c i ó n c o n j u n t a <Je d o s o v a r i o s c o m p u e s t o s l i a p e í t r i n i d o m e j o r a * l o s r e s u l t a d o s y r e d u c i r l a s l i m i t a c i o n e s m e n c t o n u d a s
l i n e l t r a t a m i e n t o c o n m á s d e u n m e d i c a m e n t o o p r o c e d i m i e n t o , s e r e q u i e r e
d c f m u si u c u n i I n l t r a t c t ó a e n t r e e l l o s , e s d e e u si 1» i n f l u e n c i a i j u e u n a s i B U r n e u
a c t i v a t u v i e i a s o b r e 1» r e s p u e s t a d o o t r o a g o n í a . p u d i e r a e s l a r n o t o r i a m e n t e
i M T f n v t r i s i l « o d i ^ i l i t a d a h n . s u s e r d e m a y o r u n í ul?ul <> «ur i n c l í c v
La.s i n t e r a c c i o n e s ftirmacnJóKicas p u e d e n l l e v a r s e a c o b o e n d o s s e n t i d o s , y a
p o ^ i ü v o o n e g a t i v o , m i s m a s q u e n o s o n d e f i n i d a s d e m a n e r a u n i f o r m e , p o r It» <|ue
h a n g e n e r a d o c o n t r o v e r s i a s y a m b i g ü e d a d e s fcsto s e b a d e b i d o a Id e x i s t e n c i a d e
í i i f c r m u » « i h j c n v o » c n t f c ( o s Hor e s lo se l i a c o n s t 4 c r « l o d e f i n i r
p a r a l o s f i n o s d e l p r e s e n t e e s t u d i o .
I n t e r a c c i ó n p n i r i v a : d i c e s « d o l a m a g n i t u d d e l o s e f e c t o s d e d o s f á r m a c o s i j u c
a d m i n i s t r a d o s d e m a n e r a c o n j u n t a s o n m a y o r r s ilc l o p r o v t s m p a r a l a
a d m i n i s t r a c i ó n i n d i v i d u a l d e e l l o s , f a i n l c i v r i A n P O M I I V A , t a m b i é n I A U U H H Í KÍÍ I c o n e l n o m i n e d e p o t e i t c j a c i o n i u i
U n o d e l o s f i n e s d e l a s i n t e r a c c i o n e s p o s i t i v a s e s m e j o r o l o s r e s u l t a d o s d e la
q u i m i o t e r a p i a c l í n i c a A c t u a l m e n t e , e x i l i e l a H o s c t e ó r i c a y e x p e r i m e n t a l p a r a
d e m o s t r a r l a e x i s t e n c i a d e p o t e n c i a c i ó n a t r a v é s d e s u s m e c a n i s m o s d e a c c i ó n u
p e i s u » e f e c t o s c o m p l e m e n t a ! i o s e n l a c i n é t i c a c e l u l a r
I a v e n t a j a p r i n c i p a l d o i v j t a s c o m b i n a c i o n e s r e s i d e e n l a a p l i c a c i ó n d e d o s i s
m e n o r e s d e c a d a u n o d e l o s f á r m a c o s , c o n lo c u a l i i l o s e f e c t o s t ó x i c o s f u e r a n d e
d i s t i n t a n a t u r a l e z a , Ja t o l e r a n c i a g l o b a l a l o s m e d i c a m e n t o s m e j o r a r i a
c o n s i d e r a b l e m e n t e Lri l a f i n l a t e m u e s l r a o d i s t i n t o * t i p o s d e u i l c i a c c i ó n d e
H * 100 h m a x
150
liO
110
SO
O
-30 _
IO _
l-iuiin« l a
D i s u m o * t i p o s d e c u r v a s d e i n t e r a c c i ó n d e m e d i c a m e n t i » :
I C u r v a d e r e l a c i ó n d o s i s - e f e c t o II C u r s a d e a s o c i a c i ó n ( s u m a c i ó n i d e d o s a g e n t e s a g o n i s t a s v III C u r v a d o p o t e n c i a c i ó n
I n t e r a c c i ó n n e g a t i v a : d i c c s e d e l a m a g n i t u d d e l o s e f e c t o s d e d o s f á r m a c o s q u e
a d m i n i s t r a d o s d e m a n e r a c o n i u n t a . s o n m e n o r e s d e l o p r e v i s t o p a r a l a
a d m i n i s t r a c i ó n i n d i v i d u a l d e e l l o s L a i n t e r a c c i ó n n e g a t i v a , t a m b i é n e s c o n o c i d a
c o n e l n o m b r e d e a n t a g o n i s m o A r i e s v S i m o n i s «<3» h a n c l a s i f i c a d o e s t e c o n c e p t o
d e a c u e r d o a l a a f i n i d a d h a c i a l o s r e c e p t o r e s e n a n t a g o n i s m o c o m p e t i t i v o y
a n t a g o n i s m o n o c o m p e t i t i v o t ' n l a fig I b s e m u e s t r a u n e j e m p l o d e a n t a g o n i s m o
c o m p e t i t i v o e x
P o r o i r á p a n e , n o s e c o n s i d e r a r a i n t e r a c c i ó n ( i n t e r a c c i ó n c e r o ) : c u a n d o l o s e f e c t o s
d e l o s f a r m a c o s a d m i n i s t r a d o s al m i s m o t i e m p o s e a n e x a c t a m e n t e a q u e l l o s q u e s e
h u b i e s e n p r e v i s t o a p a r t i r d e la s u m a d e s u s e f e c t o s p o r s e p a r a d o A e s t e
f e n ó m e n o s e le c o n o c e t a m b i é n c o m o s u m a c i ó n
H * 1 0 0 L m a x
iffo - ,
F i g u r a I b
P o r o t r a p a r t e , p o r raíles d e a ñ o s cf h o m b r e h a m a n t e n i d o i n t e r é s c o n s t a n t e e n l o s
p r i n c i p i o s t e r a p é u t i c o s d e n a t u r a l e z a v e g e t a l . E l P a p i r o d e E b e r e ( 1 . 5 0 2 a . c . } e n
f--g>pto, e s cJ p r i m e r d o c u m e n t o e s c r i t o s o b r e l o s u s o s d e v e g e t a l e s e n l a
t e r a p é u t i c a .
E n C h i n a e l e m p e r a d o r S h e n N u n g , d e s c r i b i ó u n c o n j u n t o d e m i l p í a n t a s
m e d i c i n a l e s .
E l a v a n e e q u e h a e x p e r i m e n t a d o l a e i e n c i a m é d i c a h a p e r m i t i d o e s t u d i a r l a s
p l a n t a s d e s d a u n a ó p t i c a m á s p r o f u n d a . A s i , s e h a n e x t r a í d o , a i s l a d o , i d e n t i f i c a d o
y e s t a b l e c i d o l a s r e l a c i o n e s d e e $ B \ i c t u i » > a c n v ) d a d d e m i l e s d e p r i n c i p i o s a c t i v o »
A c o n t i o u a e i ó o s e d e s c r i b e n l a s c a r a c t e r í s t i c a s d e l a s u b s t a n c i a o b j e t o d e l
p r e s e n t o c s c u d i o .
L a P e r o x i s o r a i c i n a A l 0 5 1 4 X < 3 , 3 , 8 , 8 \ 9 . 9 ' b e K ü l u d r o x i 3 , 3 \ 4 , 4 '
-t c -t r a h i d n j - ( 7 , 1 0 ' ) - b Í a o -t r a c e n o o a - 1 . 1 ' - ( 2 H . 2 I I ' ) - d i o o a ) . « » 1 1 1 1 8 a n t r a c e o o f i a
d i m á - i c s a i s l a d a d e l a s s e m i l l a s d e l fruto d e l a s p l a n t a s d e l g é n e r o K a r w i n s k i a »
( f i g . 2 ) D r e y c r y c o i s <7> a i s l a r a ) y c a r a c t e r i z a r o n e s i a s u s t a n c i a y o t r a s t r e s
c o n o c i d a s « n n o T - 4 9 6 , T « S 1 6 y T - 5 4 4 e n f u n c i ó n d e s u p e s o m o l e c u l a r
E s t u d i o s d e t o x i c i d a d d e l a T - 5 1 4 r e a l i z a s p o r H e r m u d e z y e o l s c o n
a c ú n a l e s d e d i f e r e n t e s e s p e c i e s m n s ü m m a J i o ^ i o n & í c a r t t t e r i 2 a d a s p o r n e c r o s i s
c a i m 4 u h u l i l l a r m a s i v a y d e g e n e r a c i ó n g r a s a e n h í g a d o , l e s i ó n c d l o s c a p i l a r e s
p u l m o n a r e s y d e g e n e r a c i ó n h i d r ó p i c a d e l r í f l ó n . L a e s t r u c t u r a m o l e c u l a r d e l a s
t o x i n a s y w e f e c t o s s e m u e s t r a n e n l a f í g . 3 .
1 « s e l e c t i v i d a d p a r a h í g a d o y p u b n ó o U c v a r ó o a l o s a u t o r e s a t a d a e n n i n a c i ó a d e
H i » u r a 2
OH O OH OH OH O
OH»
o c * * o o C H j O OH 0 4 |
0 * » 0 M O CH»
CH* OH
T - M 4
R C « n >
L a g r & f i i a ü v l e t a l i d a d q u e s e e n c o n t r ó c o 1cé¡ e s t u d i o s a n t a s m e n c i o n a d o s m o s t r ó
u n a p e n d i e n t e m u y e m p i n a d a , p e n d i e n t e q u e n o s e p r é s e n l a c o a frecuencia y n o s
h a b í a d e u n a v a r i a c i ó n b i o l ó g i c a e s u e c á i a o n , e s t e r e s u l t a d o l l e v ó a q u e s e
a n a l i z a r a ed e f e c t o d e l a T - 5 1 4 s o b r e l i n e a s c e l u l a r e s n e o p l á s i c a s y b e m g n a &
C o n el p r o p ó s i t o d e i n v e s t i g a r l a t o x i c i d a d d e l c o m p u e s t o , P i d e y r o y c a l a . t i u i i K
K a l i z a r o n e s t u d i é in v i t r o c o n d i s t i n t a s l i n e a s c e l u l a r e s , d o n d e d e m o s t r a r o n q u e
a l g u n a s c é l u l a s n e o p t á s i c a a p o ^ e o a n a m a r c & l a s e n s i b t t r d a d a l a T - 5 1 4 al s e r
u t f n p a r a d a s e o o l a s l i n e a s c e l u l a r e s b e n i g n a » , d e e s t a . m a n e r a s e d e m o s t r ó s u
t o n i c i d a d s e l e c t i v a . L a s c é l u l a s m á s s e n s i b l e « h v ] m i » w m a la T « S 1 4 f u e r o n
b e p a t o m a ( P L C / P R F / 5 ) , A d e n o c a r c i o o m a d e C o l o n ( L o v o ) y c a r c i n o m a
p u l m o n a r d e «él u l a s p e r v i e r t a s ( N C J - I 1 6 9 ) ( i d .
F s t o f u e c o r r o b o r a d o p o r F i e b i g ( e s a l a t e i w t t w i I ) e n l a U n i v e r s i d a d d e
F r i b u r g o raí A l e m a n i a , q u i e n e o c o n l r b u n 6 3 % d e s e n s i b i l i d a d d e l a s l i n e a s
c e l u l a r e s e s t u d i a d a s , p r i n c i p a l m e n t e m u l a n o o i a , h c j x i t o m a , a d e n n u m i n u m a d e
p u l m ó n , a s i c o m o t a m b i é n e n c a r c i n o m a * d e o v a r i o y c o l o n . O t r o s e s t u d i o s
r e a l i z a d o s e n el I n s t i t u t o N a c i n n a l d e C á n c e r e a l o s E s t a d o s U o i d o s e n l i n e a s
c e l u l a r e s d e m e l a n o n a , m a r e a , rìfióo, c o l o o y S N C , i n d i c a m i s u p o t e n c i a l u s o
G O O M a o u n e o p M s i c o .
B n e l d e p a r t a m e n t o d e F a r m a c o l o g i a y T o x i c n l o g í a d e e s t a , f a c u l t a d , s e h a n
ncalÙMSo e s t u d i o s p a r a d e t e r m i n a r tí p r o b a b l e m e e a n u s n o d e a o c i t a d e l a T - 5 1 4 ,
U n e f e c t o d e p r e s o r a o b r e e l n ú m e r o d e p e r v x i s o « ! » » h e p á t i c o s d e i * t a s y M a f i f l t a
fe a c i c u l a r » a » y u n s i n h i b i c i ó n d e l a e n z i m a m ^ ' n * * b o v i n a in v i t r u ( M » s m
o v h a i g o , a l i n v e s t i g a r s e e l e l e c t o d e l a T - S 1 4 s o b r e l a a c t i v i d a d d e l a C a l e s a
h e p á t i c a d d r a t ó n a l b i n o e n c o r t e s d e tejido y h o m o g e n l z a d o s , n o s e d e m o s t r ó t a
m h i b t c i ó o d e l a a * 2 i m a , t a n t o e n p r o c e s o s b i o q u í m i c o s c o m o b i o q u í m i c o s . E s t o
t n d i o ó q u e c u a n d o s e u t i l i z a l a e n z i n i a p u i f l c a d s , l a T - 5 1 4 s o l a m e n t e d i s m i n u y e
l a a c t i v i d a d d e l a i n c a ¿n v i t r o y n o c u a n d o l a e n z i m a e s t t e n l o s p e r o s i s o m a s ;
y a « a e n fragmento d e t e j i d o o e s s a í n a l e s e o c n p l c t o s c u * E l d e c r c m e n t o e n l a
a c t i v i d a d d e l a e n r i m a y» v r t m s e t s n p l c a e n n u e s t r o l a b o r a t o r i o c o a fines d e
c o n t r o l d e v a l i d a d
O t r o s e s t u d i o s d e m o s t r a r o n q u e T - 5 1 4 p n i d u i » u n a i m P T u p c a ó o d e l a c o r t i m n d a d
d e l a m e m b r a n a p e m x s o o i a ! e n c é l u l a s d e l e v a d u r a s i n t a c t a s , e a p e c i f i c a i r n c o t c
H y u f f t n ^ a p o t v m u r p h a v C a n d i d a b o i d t m i r i s t K s t c e f e c t o l l e v A a d o K x n i i A r a l a
T - 5 1 4 c u m o " P e r o i l s o m i e l a a " . D e a c u e r d o c o n l a C o m i s i ó n i o i e r n a e i o n a ] d e
n o m e n c l a t u r a s ( 1 U P A C ) s e l e a s i g n ó a t o d o s l o s c o m p u e s t o s d e K . h u m b n l d t í p i a
c o n s i o o d e i m t ó o 7 , 1 0 ' : P w u s o a u e i n a A < i « y P e r o x e o m i c i n a B a l o s i s ó m e r o s
P o r o t r o l a d o , e l F a c t o r d e n e c r o s i s t u m o r s l ( T N F X e s u n a p r o t e í o a
m e t a b o l i c a m e n s e a c t i v a , d e l a c u a l s e h a n d e s c r i t o d o s t i p e s o y p .
L a h i s t o r i a d e l d e s c u b r i m i e n t o d e l T N F a e o r n e a z ó e l s i g l o X I X , c u a n d o u n
c i r o j a o o d e N u e v a Y o r k , l l a m a d o W i l l i a n o C o l c y («"»> n o t ó q u e i n f e c c i o n e s
o i s i p e l s t o a a s m t e r c u r r e r t c s p o d í a n d a r t u g a r a l a r e s o l u c i ó n p a r c i a l d e n e o p l a s m a s ,
a d e m á s o b s e r v A q u e l a a d m i n i s t r a c i ó n d e p r e p a r a c i o n e s d e r i v a d a s d e c u l t i v o s d e
b a c t e r i a s ( e m q x o c o e o y ¡ u r r a t i a ) i n d u c í a n n e c r o s i s b e m o r r á g i c a e o v a r i o s
H o n o r e s , m a s t a r d e s e d e s c u b r i ó d e ID a ñ e r a i n d e p e n d i e n t e u n m e d i a d o r e n r u l a n t e
d e l a e m a c i a c i ó n d u r a n t e l a e n f e r m e d a d m f c c c i n s a al q u e s e l e U a m ú raqnortina
0 « . y r e s u l t ó s e r «J T N F t
E l T N F a e s p r o d u c i d o p r i n c i p a l m e n t e p o r m a c r ó f a g o s y o t r a s e m u l a s , c o m o
m o o o c i t o a , c é l u l a s B , c é l u l a s N K , a s t i o u U » y c é l u l a s d e K u p f f e r , « t r e s p u e s t a a
e s t i m u l a c i ó n c o n p r o d u c t o s b a c t e r i a n o s c o n o c i d o s c o m o e n d o t o x w a s (i«,m>.
A d i c i o n a ] m e n t a al T N F , s e p r o d u c e e n l o s l ú ü b c i t o s T el c u a l s e c o n o c e c o m o
T N F f l ó l i n f b t o x i n a <2».
Kl g n d o d e h o m o l o g í a e n t r e T N F c e y T N F 0 e s d e l 4 6 % e n l o s o u u J e ó t i d o s y d e l
2 $ % c u l u s a m i n o á c i d o s <aa). L a f o r m a p r e c u r s o r a d e T N F a e o n s á s t e d c 2 3 6 aa>
e n 1 s m > q i ^ p a r a d T N F p e s d e 2 0 4 aa> a n t e s o d u r a n t e l a s e w e c j ó n s e e l i m i n a n
p e r ^ c i ó n e n z ú n á r i c a a m m o á c i d " " K - t o m i n a l i » d e l a s f o r m a s p x w u r s o r a s p a r a
d v c o m o r e s u l t a d o T N F c x » j l u b l e , d e p e s n m o l é c u l a d e 1 7 k D e y T N F 0 d e p e s o
m o l e c u l a r d e 2 0 k D a L o s T N F <* y p s e u n e n a el m i a ñ o r t v e p t o r d e l a s c é l u l a *
b l a n c o . Eja I a s f i g i r a s 4 y 5 s e m u e s t r a u n « a q u e m a c n m p u l a r i s d o d e l T N F a l f a y
Figura 4
Esquema computerizado del
TNF
alfa.
-70
Met
- 6 0
LeuProLysLysThr
SerPheLeufleVal
-20GlyProGInArgCHu
1ValArgSerSerSer
21GlnAlaGluGlyGln
41
ValGUuLeuArgAsp
61
GlnValLeuPheLys
81SerAxgDeAlaVal
101
CysGlaArgGluThr
121GlyGlyValPheGIn
141
TyrLeuAspPheAla
SerThrGluSerMet
-50
GlyGlyProGlnGly
-30
AlaGly Al aThrThr
- 1 0
GluPheProArgAsp
11
ArgThrProSerAsp
31
LeuGl nTrpLeuAsn
51
AsnGlnLeuValVal
71
GlyGlnGiyCysPro
91
SerTytGlnThrLys
111ProGluGlyAlaGlu
131
LeuGluLysGlyAsp
151
GluSerGlyGlnVal
BeArgAspValGlu
SerArgArgCysLeu
LeuPheCysLeuLeu
LeuSerLeuDeSer
LysProValAlaHis
ArgArgAlaAsnAla
ProSerGluGlyLeu
SerThrHisValLeu
ValAsnLeuLeuSer
AlaLysProTrpTyr
ArgLeuSerAlaGJu
TyrPheGiylleDe
LeuAlaGluGluAla
PheLeuSerLeuPhe
HisPheGlyValIle
ProLeuAlaGioAla
ValValAlaAsnPro
LeuLeuAlaAsnGly
TyrLeulleTyrSer
LeuThrHisThrDe
AlaD eLysSerPro
GluProüeTyrLeu
DeAsnArgProAsp
Alaleu
Figura 5
D u r a n t e J o s ó J t i r n o s a ñ o s s e h o o d e s c r i t o u n a a m p l i a g o m a d e a c t i v i d a d e s
b i o l ó g i c a s d e l T N F q u e i n f l u s s i e n d i f e r e n t e s p r o c e s o s , e n t r e lu* q u e
s e e n c u e n t r a n a u t o g é n e s i s , d i f e r e n c i a c i ó n e i n m t m ú f T C g u l a c á ó n ; u s a a a u n e s e n
a l g u n a s c é l u l a s b l a n c o s e i n d i c a n c*i la t a b l a 1.
C é l a l a s o tei Uto b l a n c o
E f e c t o 1
1 i n r m • u n t b f i f a B a u b c q n o t e p n I M ^ M à » IL» 2 a k M U ^D^BCfiAft dò i^^^^BÉÉ
L À b m l |
M a c n ; u a v A f *
» w i - ^ X i ^ « y ^ • A l i s i v U h á o R o d á í j n c a i i U a r a o S i t i k i A p M i f l M t t i i K U n i i — n » « ú y i t g i y t f t
j f c s e c e e o O m i a g A de CnJMM, « • e w s B A O
» I p L > i^m^ p o p w l c i ù p ^ p ^ ^ ^ A e v b IvM ^b
N t M W M
<Sc r ^ r v r v M E - 1 S 0 , H c L » t S I
t v m x s a d o w B T - » , M C S - 7
M u • n i » i i n nei irrr»n
11 II •! • ! M i l l i II Il» i n t M e w m ; « ì m i - W I
I r i n i H i t ] f r t h h C m M t r M 7S60
f S r r t M i n n ( I f T M G r t i i l n m i H P M I - V 6
A A m b d i i m i k cctom. K T - 0
C V M M J I A ' K H c t j
r » » • i ^^latiM*
N t M W M
<Sc r ^ r v r v M E - 1 S 0 , H c L » t S I
t v m x s a d o w B T - » , M C S - 7
M u • n i » i i n nei irrr»n
11 II •! • ! M i l l i II Il» i n t M e w m ; « ì m i - W I
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f S r r t M i n n ( I f T M G r t i i l n m i H P M I - V 6
A A m b d i i m i k cctom. K T - 0
C V M M J I A ' K H c t j
* « ; n n i vira*
T a M a I
A c c t o n s del T M F a i a l g t a s i l u t a n
K s t u d i o s i n _ v i t t o b a u d e r o u s t r a l o d c f e c t o e i t o t ó x i c o d e i T N F e n c i c r t a s l i n e »
c e l u L a r e s ( a l e a c o r n o M e - l S O y H e L a > H 2 1 ( C a . C é r v t x ) , B T - 2 0 » M C F - 7 ( C e . d e
i r i a m a ) y M c G < 3 0 - 8 0 ) 6 ( H e p a t o m a X n o a s l p a r a L a c é l u l » n n t m a l e a ; e s t e b e c h o
A u n q u e d m e c a n i s m o d e e s a c r t o t o x i c í d a d s e l e c t i v a a ú n n o s e h a a c l a r a d o , n o
p a r e c e d e b e r s e a d i f e r e n c i a s e n el n ú m e r o o típo d e r e c e p t o r e s d e s u p e r f ì c i e p a r a
c i T N F . P o r o t r e p a s t e , Y a s r n i n e h y c o i s , h a n d e m o s t r a d o e n h e p a i o c i t o s d e
r a l a q u e e l T N F p r o d u c e u n a d i a n m u c i ó o d e l a a c t i v i d a d d e l a a d e m á s d e
u n s i g n i f i c a t i v o d e c r e m e n t o a e l o ú m e v o y t n m a f l o d e p e r o x i s o e n a s .
T a * r e s u l t a d o s o b t e n i d o s d e l o s e s t u d i o s d e f a s e c l i n i c a I y IT n o h a n s i d o
a l a t t a d o n s a , d d > i d o a l a p r e s e n c i a d e Inxécid&d c a w i i o v a s c u l a r 00+, l a c u a l «ss l a
l i m i t a n t e m á s i m p o r t a n t e , a d e m á s d e a l t e r a c i ó n e n d m c t a b o l i w n o d e l o s U p i d o s
<3)x t r o c n b n c i ü i p e m a y l e u c o p a i a o n
P o r o t r o l a d o , al e x a m i n a r e l T N F e n a d i c i ó n a o t r o s a g e n t e s , t a l e s c o m o
m t e r f e r o n y, s e o b s e r v ó q u e d i c h a c o m b i n a c i ó n a u m e n t ó a p r o x i m a d a m e o t o 1 0
v e c e s l a c i t n t o x i c i d a d e n l o s s i g u i e n t e s t u m o r e s : b i l i a r , p m s t á á c o y s a r c o m a
E s t o h a s u g e r i d o q u e l a a d m i n i s t r a c i ó n c o m b i n a d a d e e s t o s
c o m p u e s t a s p u d i e r a e m p l e a r s e e n t a t e r a p i a d e e r t a s n e o p l a s i a * .
L a P A ) y e l T N F p r e s e n t a n a l g u n o s e f e c t o s e o c o m ú n , l o c u a l e s t a b l e c e l a
p o s i b i l i d a d d e q u e s u a s o c i a c i ó n resulte e n u n e f e c t o s i n è r g i c o s o b r e l a s « ¿ l u l a s
n e o p l é s t c a s .
de km Efec** ammna & Im PAI y
r>aiMininAii d e la actrvidsd d e la P A I i n v t v o e i n v i ü o . T N F i n y t v o
TlfrniimnHi del o ú a c r o y tamaflo d e p e r o u s o m a s in v i v o
Hl i n t e r é s d e o b s e r v a r e l e f e c t o d e l a P A 1 e n c o m b i n a c i ó n c o n o t r o s a g e n t e s
s f r i n e c p l á s t c u s c o o d u j o a e s t u d i a r a l a t o x i n a e n c o a j u D t o c o n M i t o a u e i n a C , 5
-fluorouraeüo y A c t i n o m k i n a - D , e s t a ú l t i m a e s u n i n h i b i d c c d e l a s í n t e s i s d e
p r o t e í n a s , d e l c u a l s e h a e v i d e n c i a d o q u e « e n s i h t l i x a al e f e c t o t ó x i c o d e l T N F e s
l i n e a s c e l u l a r e s q u e DO p r e s e n t a n e f e c t o a l e e v p m i c t ó n cesi e l T N P
L a t n i i o r o i c i n a C e s u n a n t i n c o p ' A s j c o g e n e r a d o r d e r a d i c a l e s l i b r e s y «d 5
-flucrourecilv u n a n o m e t o b o l i t n .
• piOv<3iLc e s t u d i o p r e t o x i c d e m o s t r a r i n v i t r o l a i n t e r a c c i ó n d e e s t o a a g e n t e s .
HlP*Vrr.üls
B F a c t o r d e m r a t s t u m c v a l d f e a c t ú a . i n v i t r o , d e m a n e r a s i n è r g i c a o o n l a
P e r o x i s o m K i / t a A l s o b r e c é l u l a s n e o c l á s i c a s .
O B J E T I V O G E N E R A I
A n a J i z a r la p o s i b l e U i t o ^ e i ó n d e l a P e * n » « s o m t c Í n a A l y el F a c t o r d e n e o o s i s
O B J E T I V O S E S P E C I F I C O S
1. P r o l i f e r a r y e s t a n d a r i z a r l a s l i n e a s c a l i l l a r e s b e n i g n a s y m a l i g n a s requeridas
p a n e l e s t u d i o .
2 . D e t e r m i n a r l a s c o n c a i t r a c i o n e s t ó x i c a s m á x i m a * ( C T m a x ) , l u m i m a s ( C T m i n )
y 5 0 % ( C T 5 0 ) c o n l o s m é t o d o s m o r f o l ó g i c o y d e i r i p a i H i , l a s
c o n c e n t r i * : i o n e s i n h i b i t o r i a s 5 0 % ( C l S O ) c«m e l m é t o d o d e M T T y l a
m h i b i c i ó a d e l c r e c i m i e n t o 5 0 % ( G I S O ) c o a e l m é t o d o d e S R J 3 , e n l a s l i n e a s
c e l u l a r e s e x p u e s t a s a P o t u i s o m i d o a A l .
3 . D e t e r m i n a r l a s c o n c e n t r a c i o n e s I Í W K J S TQAXUDHS ( C T m a x X m i n i m a » ( C T m m ) y $Cfi>i ( C T 5 0 ) c o n e l m é t u d o m o r f o l ò g i c o , l a s c o n c e n t r a c i o n e s i n h i b i t o r i a s 5 0 % ( O S O ) . e o o d m é t o d o d e M T T y l a i n h i b i c i ó n d e l c r e c i m i e n t o 5 0 %
( G I S 0 ) e o n d m é t o d o d e S K B , e n l a s l i n e a s c e l u l a r e s e x p u e s t a s a TT47.
4 . D e t e r m i n a r l a c o m b i n a c i ó n d e P A I + T N F q u e p r u d t v s s e n c a d a u n a d e I b a
l i n e a s c e l u l a r e s u n a c o n c e n t r a c i ó n i n h i b i t o r i a d e l 5 0 % ( c o m b a n a c i ó n
t s o e f e c t o ) . p o s t e r i o r a una. e x p o s i c i ó n d e l o s c o m p u e s t o s d e 48K.
5 . D e t e n n i n a r l a e x i s t e n c i a y t i p o d e i n t e r a c c i ó n e d l a s l i n e s s c e l u l a r « e x p u e s t a s
a la c o m b i n a c i ó n i s o e f c e t o d e P A 1 + T N F p u r 4 3 h .
C A P I T U L O D O S
MATERIAL Y M É T O D O S
2 . 1 M A T E R I A L
2 . 1 . 1 ü i c u c cID I I K I
L a s l i n e a s c e l u l a r e s u t i l i z a d a s p a n e i e s t u d i o f U e r o n o b t e n i d a s d e
A m e r i c a n t y p e c u l t u r e c o l l e c t i o n ( A T O C ) y s o n l a s s t g u i e o t e s :
C t í u l a s b e p é u e a s d e C b a n g Q u c g liver
H e p a t o m a P L C / P R F t f
H e p a t o b l a s t o m a H e p G 2
<s>i..ia< b e n i g n a s d e c o l o n C C D 3 3 - C o A d e n o c a r c i n o m a d e c u t o n L o v e
A d e a w c a r w K N u e d e n m u » B T - 2 0
M c l w x v n a S K - M E L 2
C a r c i n o m a e s c a m o s o d e c e r v i x S4HA
F i b r o b l a s t o s m u n o o s U 9 2 9
2 . 1 . 2 M a t e r i a l p l f a t k o
P l a c a s p a r a c u J t i v o c x l u l s r d e 9 6 p o n « d e s t ^ e r f K j e p l *
0» S i g r n a
F r a s c o s d e c u l t i v o T 2 5 C o s t a r 3 0 5 S
P i p e t a s a u t o m á t i c a s d e v o l u m e n g r a d u a b l e E p p e a d o r f
P u n t i l l a s p a r a p i p e t a s E p p c o d c r f d e d i v e r s a s c a p a c i d a d e s
2 . 1 . 3 M a t e r i a l á e v i d r i o
F r a s c o s p a r a m e d i o d e c u l t i v o d e 1 L
M a t r e r o E r l e n r n c y e r d e d i v e r s a s c a p a c i d a d e s
V a s o s d e p r e c i p i t a d o d e d i v e r j a s c a p a c i d a d e s
P i p e t a s H o t t l e a d e
5 , 1 0y
2 5i dL2 . 1 . 4 A g e i t t * i B | i a » p l i a e o »
2 . 1 . 4 . 1 P e r o u M M i i i e i a a A *
P A I Oel l o t e d e p r o d u c c i ó n DO. 8 0 f u e a j s l a d a y p u r i f i c a d a e n e l
D e p a r t a m e n t o d e F s m a c o l o g i a y T o x k o l o g í a d s e s t a f a c u l t a d » l a c u a l f u e
s o m e t i d a a u n e s t r i c t o c o n t r o l d e c a l i d a d q u e i n c l u y ó p r u e b a s
fisicoquímicas, g o m a l ( » g r á f i c a s y b i o l ó g i c a s c o m o i n h i b i c i ó n d e l a
y a c t i v i d a d c e l u l a r .
F a c t o r á e n e c r o s i s t a a a o r a l a ( T N F ) r e c o u b l n a a t e b a m a n o
S e u b t u v o d e l a C o m p a f t i a Si&ma C b e n t C o . ( T - 0 I 5 7 )
Hx p r e s a d o « l e v a d u r a s « p r e s e n t a c i ó n d e 1 0 | i g / m l . e n PH¿>, 9 5 % p u r o
(StJtf» p a g e y HK1-C); p r o b a d o p a r a e n d o t o v i n a s y c u l t i v o c e l u l a r . C o a
2 . 1. 4. 3 A c ü n o m i c i n a D M e r c k J t C o , I n c .
2 . 1 . 4 ^ M i u m i e i » ( M f t o a n - C » ) B r í s t o l .
2. 1 . 4. 5 S - F l u o r o u r a á l o ( R b o n u r a c i l - L . F R h O n o - P o u l e n c R o r e r .
Z 1 - 5 R e M Ü v w
Rt&cüp&s f**áecatóte**
M e d k » d e c u l n v o M H M
( M í n i m u m « s w m ' a J t n e d n i m E a g J e ) Siguí* M - 0 6 4 3
S u e r o fetal b o v i n o S i g m a F-:>442
T r i p s i t A S Í B n u T - 2 2 7 1
C o l c s a o t e a z u J d e t r i p e r o S i g r w t T - 6 1 4 *
W l J
V<*>5 dimetiltiawȒ-2) 2 , 5 b r o m u r o d e d i f c n i l t e t r a x o l i o S i g n a M - 2 1 2 6
D u n e U l ^ u l f ú n d o S i g m a D - 2 ^ 5 0
S u l f u r o d a m i n a B S i g m a Tox-6
k t a n o l a h v t l u l o M e r c k
2 . 1 4 K q o i p o s e a e r a l
l n v e r t o s c u p i o 1 M 3 5 C a r i Z d s s
L e c t o r d e p l a e a « H T S - 7 0 0 0 P w f c i n E ) m « s
I n c u b a d o r a c o n t e m p e r a t u r a y h u m e d a d c o n t r o l a d a P r e c i s i ó n
C a m p a n a d e flujo l a m i n a r V e o t c r
P i p e t e a d o r a u t o m á t i c o Si g r o a P 5 9 2 S
2 . 2 M É T O D O S
? 1 1 i j a t f t s c e t a l a r e s
X 2 . 1 . 1 C r i l t r i M d e i e l K c l t e
• L i n e a s c e l u l a r e s s e n s i b l e s a l a P A l c i u q .
• F i b n t b l a s i n i m u r i n o s L - 9 2 9 , pcw 9 1 r e s p u e s t a p r o l i ferMiva b a c í a e l T N F .
» 14L l i n e a c e l u l a r d e a d e n n c a r c i o o i n a d e m a m a B T - 2 0 p r e s e o t a
s e n s i b i l i d a d e s p c m i á n a i h a c i a el T N F ,
• C a r c i n o m a d e c 4 r v i x represara u n a d e t a s a i f i a m e d a d e s m á s f r e c m a i h a
e n l a p o b l a c i ó n f e m e n i n a e o M á x i c o . A c t u a l m e n t e p a c i e n t e s c o n
d i a g n ó s t i c o d e c a r c i n o m a ç é e v i e w u t e r i n o r e c u r r e o t e s e e n c u e n t r a n e n
u v o j d i o d e f a a e c l í n i c a I c o n P A l
F a i w l i n e a » c e l u l a r e s p r e a e n l a n tea s i g u i e n t e s e s a c t e r i s t i c e a :
4 A d a p t a b i l i d a d p a r a e r o » e n m e d i o »encallo y c o m ú n ( M í n i m u m e s s m t i a l
m é d i u m H a g l c { M E M ) s u p l c m e n i a d o c o n 1 0 % d e s u e r o f e t a l b o v i n o
( S F B ) ] .
W D u p l i c a c i ó o d e m a s a c e l u l a r Q u e p e r m i t e c o l e c t a r m i n i m o 2 i 10*
c é l u l a a ^ m L , d o s v e c e s p o r a q n s n a .
c) A d a p t a b i l i d a d p a r a u t i l i z a r s e e n m i c m c u l t i v o s .
«0 C a p o c i d o d d e t o d a s l a s l i n e a s c e l u l a r e s d e formar m o n o c a p a .
U n a v e z e s t a b i l i z a d a s l a s l i n e a s c e l u l a r e a , a e m a n t i e n e e n m a ñ e r o m i n i m o d e
p a s a j e s ( n o s u p e n u r a d i e z ) , c o n «1 f i n d e c o n s e r v a s s u s c a r a c t e r á s ü c a s d e
L a s c é l u l a s s e £ r a c c * > o a n « n a l í c u o t a s d e 1 x 1 06 c é l u l a s . y s e c o n s e r v a n e o J i i l i ú g e n o l i q u i d o b a s t a s u e m p l e o .
2 . 2 . 1 . 2 M a a t e n i m i e a t e d e l a s l i a e a s c e J a l a r t s
E n e l m a n t e n i m i e n t o d e ( a s l i n e a s c e l u l a r e s s e c o n s i d e r ó l o s i g u i e n t e :
t ) R e q u e r i m i e n t o c e l u l a r c o n t i n u o d e 2 x 1CJ6 c é l u l a s d o s v e c e s p o r s e m a n a .
b ) C a m b i o d e m e d i o d e c u l t i v o , s e g ú n l a d e n s i d a d c e l u l a r .
c) P o s i b i l i d a d d e c o o t a m i n a e j ó o m i c r o b i a n a ; p a r a e l l o s e m o n i t o r a i r o a
c o n t i n u a m e n t e l a s l i n c a s « c t u l a r e s p a r a o b s e r v a r s u c o m p o r t a m i e n t o d e
tfecimiemn y a p a r i e n c i a m i c r o s c ó p i c a .
d ) A d e m á s s e m a n t u v o u n n ú m e r o l i m i t a d o d e p a s a j e s ( n o s u p e r i o r a d t c ¿ )
p a r a e v i t a r e n v e j e c i m i e n t o c e l u l a r .
L a s c é l u l a » s e e u J l i v n r o n r u l i n a n a f n c n t e e n m e m e v a p a eti f r a s c o s d e c u l t i v o
T 2 5 , c o n M H M y S F H ( 9 . I ) , s i n a n t i b i ó t i c o a 3 7 ° C « m u n a a t m ó s f e r a d e
C O » a l 5 % y 1 0 0 % d e h u m e d a d r e l a t i v a
P a r a p r e v e n i r l a c o n t a m i n a c i ó n d e todo c i c u l t i v o , a l a m i t a d d e l o s f i a s c o s
s e l e re&lÍ2Ó el c a m b i o d e m e d i o d e c u l t i v o l o s l u n e s y l o s j u e v e s ; y a la
o t r a m i t a d l a s m a r t e s y v i e r n e s .
A c a d a l i n e a c c l u J v s e l e m i d i ó l a d e n s i d a d d e s i e m b r a » l a c u a l d e b e s e r
s u p e r i o r a 2 t 10® c é l u l a s , l o c u a l p r o p o r c i o n a u n 7 0 — 9 0 % d e c o n f l u e n c i a
d e s p u é s d e 7 d i o s d e m a n t e n i m i e n t o o d e s p u é s d e A ó 5 d í a s d e l e n s a y o ; e s t a d e n s i d a d a e u t i l i z ó d o s v e c e s a la. « e x n e n a p a r a m a n t e n e r l e s c é l u l a e n
2 . 2 . U f R p a n c ü i « i i o t i U d á i < k fcaa c é t u b s
T o d s l a s c é l u l a s e n m o n o c a p a s e s e p a r a r o n d e l o s f r a s c o s d e c u l t i v o
a d i c i o n a n d o I m L d e t r i p s i n a a l OJ25% y m a n t e n i é n d o l i t ó a 3 7 ° C p w o o
m á s d e I S m i n u t o s , l a t r i p s i n a s e i n a c t i v ó c o n d S F B p r e v i a m e n t e
a ñ a d i d o a l m e d i o d e c u l t i v o fcfFAC
L a s c é l u l a * s e ae|iaiar«wi e n t r e s i , m e d i a n t e u n s u a v e y r e p d i d n p i p e t e o y
p o s t e r i o r m e n t e s e c o n t a r o n e o l a e d a n a r a d e N e u h a u e r .
U l t e r i o r aJ c o r n e o s e r e a l i z a r o n l a s d i l u c i o n e s n e c e s a r i a s p a n o b t e n e r u n a
s u s p e n s i ó n c e l u l a r d e S x 10* c s l u l a V m L . l a s c é l u l a s s e i n o c u l a r o n e n t m a
p l a c a d e 96 p o w » e n vn v o l u m e n d e 1 0 0 (ti e s d c c i r 5 , 0 0 0 c é l u l a s .
D e d i e z a d o c e p o z t r i c o a c é l u l a s o o s e e r p u s i e m n a l o s m e d i c a m e n t o s y a
q u e s e u t i l i z a r o n d e c o n t r o l , a o t r o s c u a t r o p o z o s s e l e s a d i c i o n ó u n a
a l í c u o t a d e 1 0 0 |±L d e m e d i o , l o e ^ m i * « s e c o n s i d e r a r o n c o m o b l a n c o s m
m e d i c a m e n t o y finalmente s e s e m b r a r o s d o s p o z o s c o n m e d i o d e c u l t i v o
y l a s d i f e r e n t e s d o s i s d e o l o s a g e n t a s e n e s t u d i o , cstrv? p o z o s s e
c o n s i d e n a o t l c o r a u M a n c o s COn m e d i c a m e n t o .
L a s p l a c a s *e p r e i n c u b a r o n p a r 2 4 b , a l a s c o n d i c i ó n « d e t e m p e r a t u r a y
p r e s i ó n m e n c i o n a d a s , p a r a p e r m i t i r s u e s t a b i l i z a c i ó n a m e s d e a d i c i o n a r
l o a m e d i c a m e n t o s .
m A i t i i ( o p l b k « ( S o l n b d b a c i ó a y d i l a c i ó n )
l i l i P t m t t O t t k á i a A i
P a r a l a e v a l u a c i ó n d e l a P A 1 , s e p r o b a r o o 1 0 d i l u c i o n e s s e r i a d a s ; s e
e m p l e é u n a e s c a l a g e o m é t r i c a b a s e d o s (ii>. s e u t i l i z ó c o r n o e c o c c n t r a c i ó n
m á x i m a d e 4 0 p g / m L ( 7 7 8 * J O * M ) y c o m o c o n c c M r r a ó n m i n i n » d e
0 . 0 7 n g / m l . ( 1 . 3 6 x 1 0 * ' M ) .
L a P A 1 s e d i s o l v i ó e n e i a n o l a b s o l u t o ; e s t u d i o s p r e l i m i n a r e s m o s t r a r o n
q u e l a c a n t i d a d d e a o l v e o t e u t i l i z a d a ( < 1 % d e l v c J u m c n t o t a l ) o o a l t e r e la
v i a b i l i d a d cxJular <H). L a s d i l u c i o n e s s e p r e p a r a r o n c o n m e d i o d e c u l t i v o
M E M .
? 2 . 7 * F a c t o r d e n e c r o s i s t a m o r a l a l t e
A l T N F , s e l e 1 / a c c i o o ó y c o n s e r v ó e s c o n g e l a c i ó n a — h a s t a s u
r e q u e r i m i e n t o P o s t e r i o r m e n t e , c a d a a l í c u o t a s e a f o r ó c o n m e d i o d e c u l t i v o
s l m L . , p a r « p r c p w a r l a s d i l u c i o n e s . L a s c c s i c a i t i a c i o i i e s e m p l e a d a s p a r e
e v a l u a r el d a ñ o c e l u l a r f u e r o n l a s s i g u i e n t e « ' 1 , 5 . 10, y 1 6 0 T t g / m L , o s l a s
c o n c e n t r a c i o n e s s e s e l e c c i o n a r o n c o n h a s e e n t a r e s p u e s t a d e a l g u n a s
l í n e a s c e l u l a r e s r e p o r t a d a p o r P r e n s e n y c o i s , o m y Jlm'd y c o i s , o n
2 , 2 , 1 3 A c t i n o m i c i B a D» M i t o a j c i a a C y ^ F l o o n w r n e i l o
L a A c t - D , M i t y S F U s o o s o l u b l e s e n r n e d t o a c u o s o , s e a O a d i e r o o al m e d i o
d e c u l t i v o y s e p r e p a r a r o n j u s t o a n t e s d e c a d a « r p a r i m e r t o .
U n a s o l u c i ó n d e A c t - D d e l j i g A n l . « p r e p a r ó c o r e l a s e n s i b ü i ^ c i ó n d e
l a s l i n e a s celulares» o « s t u d i o .
P a r a l a M j ( s e p r e p a r a r e « ! o c h o s o l u c i o n e ; s e r i a d a s cO e s c a l a g e o m é t r i c a
b a s e d o s , a e u t i l i z ó c o m o c o n c e n t r a c i ó n m á x i m a l O O t i g f a i L y c o m o
c o n c e n t r a c i ó n m i n i m a d e 0 . 7 8 h g t ai l •.
P a r a el S M / s e p r e p a r a r o n oc¿*> a o l u c t n n c s s s o t a d a s e n c á c a l a g e o m é t r i c a
b a s e d o s , c o m o c o n c e i i t i a c i ó n m á x i m a s e e n p l e v o « y u n a
c o n c e n t r a c i ó n m í n i m a d e 3 ^ O j i g f a i l . .
C o n l a f i n a l i d a d d e e s t a b l e c e r l o s o o n c e n o a e t o n e s i n h i b i t o r i a s 5 0 % c o n «1
m é t o d o d e M T T , l a s K n o a s c e l u l a r e s s e c v p u s i ^ o a a l a s c o n c e n t r a c i o n e s
d e M i l y 5 F U y a mcncHmacfei* p o r u n p e r i o d o d e 4&h,
1 2 1 4 E x p o s t c M a c o a e a r r e o t e d e P A l + T P í F
P a r a b u s c a r e l e f e c t o d e l a i n t e r a c c i ó n d e l o s c o m p u e s t o s e n l a s d i s t i n t a s
l i n e a s c e l u l a r e s , s e s e l e c c i o n ó l a c o n c e n t r a c i ó n d e P A 1 q u e p r o d u j o e l 5 0 %
d e d o / l a y l a c o n c e n t r a c i ó n i n m e d i a t a i n f e r i o r p a r a c a d a l i n e a c e l u l a r , l a s
c u a l e s s e m e z c l a r o n c o n 1 , 5 , 1 0 y 1 6 0 o g / m L d e T N F , s e s e m b r a r o n
o a i r o p o z o s d e c a d a c o m b i n a c i ó n , e a d a e n s a y o s e r e a l i z ó p o r t r i p l i c a d o e n
e a d a u n a d e l a s p r u e b a s d e c r t o t o x i o d a d .
2 . 2 . 2 ^ P r e t r a t a m i e n t o c o a A c t i a o m k i i i l>
A d i c i o n a l m e n t e l a s l i n c a s c e l u l a r e s s e s e n s i b i l i z a r o n u t i l i z a n d o d i n h i b i d o r
d e s í n t e s i s d e p r o t e í n a s : A c t i n o m i c u i a l>. L a p r e v i a e x p o s i c i ó n a e s t e
c o m p u e s t o a u n a e n n o e n t r a c i ó o d e l j i g / m L p e r m i t e q u e c é l u l a s n o r m a i e s y
n e o p l ¿ s i c a s l e s p o o t f e m a l T N F q í v L a e x p o s i c i ó n s e l l e v ó a c a b o e n d o s
p e r i o d o s , u n o c o r l u d e I b y o t r o p r o l o n g a d o d e 2 4 h . B m e d i o d e c u l ! Í > o s e
r e t i r ó a l t e r m i n a r e l t i e m p o d e e x p o s i c i ó n y s e a f l a d i ó l a V A 1 y l a
