INTEGRANTES DEL EQUIPO DE INVESTIGACIÓN (indicar cuál es el investigador responsable)

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VICERRECTORÍA DE INVESTIGACIONES Y POSTGRADOS CONTENIDO

1. Información general

Título del proyecto: Evaluación de marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) en progenitores de mora, para generar una población filial F1.

Nombre de los Grupos de Investigación: (registre la información de los grupos que participan) Grupo de Investigación en Biodiversidad y Biotecnología (Universidad Tecnológica de Pereira)

Nombre del Grupo: Grupo de Investigación en Biodiversidad y Biotecnología (Universidad Tecnológica de Pereira)

Facultad/Departamento: Facultad de Ciencias Ambientales

Clasificación A____

Nombre del Grupo:

Facultad/Departamento:

Clasificación _SC____

Nombre:

Clasificación _____

Nombre:

Clasificación _____

Tipo de proyecto de I&D: Investigación Básica: Investigación Aplicada: Creación: Innovación Tecnológica1_:

Tipo de innovación:

Innovación tecnológica de producto Innovación tecnológica de proceso

Innovación organizacional

Área Estrátegica del Plan de Desarrollo

Biotecnología Artes, Cultura y Humanidades Problemática Social

Salud Ambiental No corresponde a ninguna de las áreas

estratégicas

INTEGRANTES DEL EQUIPO DE INVESTIGACIÓN (indicar cuál es el investigador responsable) NOMBRE/TIPO DE VINCULACIÓN EN LA

UNIVERSIDAD DE CALDAS

DEPARTAMENTO o PROGRAMA ÁREA DE CONOCIMIENTO (según anexo 1)

1_{Se refiere a aquellos proyectos que tienen como objetivo el desarrollo de nuevos productos o procesos,} así como las modificaciones tecnológicas importantes en productos o procesos

x

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Programa de Doctorado en Ciencias Agrarias

1 Ana María López Gutiérrez (Universidad

Tecnológica de Pereira) (Responsable)

Facultad de Ciencias Ambientales

Agronomía, veterinaria y afines

Carlos Felipe Barrera Sánchez (Director) Universidad de Caldas Agronomía, veterinaria y afines

Lugar de Ejecución del Proyecto: (Municipio/Departamento)

Ciudad: Pereira Departamento: Risaralda Presupuesto

Valor total del proyecto: $ 229.824.000 Fuentes de financiación: Sistema General de Regalías. Departamento de Risaralda.

Valor solicitado en esta convocatoria: $

Duración total (meses): 30

2. Resumen ejecutivo

A pesar de su reconocida importancia en la generación de ingresos para pequeños productores el cultivo de la mora ha tenido poco desarrollo tecnológico, la calidad y productividad presentan alta variabilidad, debido principalmente a la falta de variedades reconocidas y a la falta de material de siembra de calidad genética y fitosanitaria. Las investigaciones realizadas desde el año 2000, en mora de castilla por parte del Grupo de investigación en Biodiversidad y Biotecnología de la Universidad Tecnológica de Pereira, han profundizado en el área de materiales de siembra con excelente calidad fitosanitaria y productiva mediante investigación científica y participativa, las cuales promuevan la generación de conocimiento que le permitan al agricultor vincularse a las cadenas productivas de manera más competitiva.

La siguiente propuesta hace parte de un conjunto de investigaciones llevadas a cabo por la Universidad Tecnológica de Pereira, dentro del marco del programa “Mejoramiento de la calidad del material de siembra para la competitividad de la cadena productiva de mora” realizadas en torno a la formalización de materiales de siembra previamente caracterizados, en los cuales se pretende, entre otros, mediante marcadores moleculares de última generación (SNP – Single Nucleotide Polymorphisms) afinar los procesos de caracterización varietal en mora de castilla (Rubus glaucus Benth) y relacionarlos con alguna característica morfológica. Y luego, obtener por cruzamiento una población segregante, a partir de progenitores previamente caracterizados.

3. Conformación y trayectoria del equipo de investigadores (máximo 500 palabras)

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2 Líneas de Investigación:

 Biología molecular  Cultivo de tejidos  Mejoramiento genético  Fitopatología

 Bosques, agro ecosistemas y biodiversidad  Humedales naturales

En los últimos cinco años el grupo de investigación en Biodiversidad y Biotecnología ha centrado su investigación en especies cultivadas y forestales de interés comercial, tales como nogal cafetero (Cordia alliodora (Ruíz & Pavón), guayacán rosado (Tabebuia rosea (Bertol D.C), mora de castilla (Rubus glaucus Benth) y algunas especies y cultivares del género Heliconia.

El grupo presenta una extensa producción académica, con la publicación de más de 60 artículos en revistas indexadas nacionales e internacionales, libros y capítulos de libros. Además de dos patentes de invención. Actualmente, el grupo se encuentra desarrollando junto con tres grupos de investigación de la Universidad Tecnológica de Pereira y un Grupo de investigación de la Universidad Libre el proyecto: “DESARROLLO DE CAPACIDADES CIENTÍFICAS Y TECNOLÓGICAS EN BIOTECNOLOGÍA APLICADAS A LOS SECTORES DE LA SALUD Y LA AGROINDUSTRIA EN EL DEPARTAMENTO DE RISARALDA”, financiado con recursos del Sistema General de Regalías, vigencia 2014 – 2019.

4. Descripción del proyecto

4.1. Planteamiento de la pregunta o problema de investigación y su justificación

El género Rubus L. posee alrededor de 750 especies (Thompson, 1995; Gustafsson, 1942, 1943; Hummer, 1996). Su importancia radica desde el punto de vista económico y ecológico en que es comestible, ornamental, algunas especies son invasivas y de aparición temprana en procesos de regeneración forestal (Thompson, 1995; Hummer, 1996). Las especies de Rubus comerciales incluyen aquellas que poseen frutos rojos como “raspberries” (R. idaeus L.), y frutos de color negro, “blackberries,” como la especie R. occidentalis L; las moras de los Andes (Rubus Suramericanas) las cuales son consideradas “blackberries” o “Andean blackberries” (Thompson, 1997). Las variedades más cultivadas en el mundo provienen de las especies Rubus occidentalis o de hibridaciones con Rubus ideaus. En Colombia, se cultiva principalmente la variedad conocida como Mora de Castilla, con o sin espinas, Rubus glaucus Benth. Este cultivo está distribuido en el país desde el Putumayo hasta el Magdalena Medio y se siembra entre los 1.600 y 2.400 msnm. Otras variedades cultivadas en el país son la mora negra, Rubus bogotensis HBK, la mora de páramo, Rubus giganteus, la mora pequeña, R. megalococus y la mora grande Rubus nubigenus.

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3 rendimientos, varían ampliamente: de seis a dieciséis toneladas por hectárea, para un promedio nacional de 11 toneladas por hectárea al año (AGRONET, 2008); en cultivos altamente tecnificados se ha llegado a obtener rendimientos de 30 T/ha por año. Con poblaciones de 2500 plantas/ha y óptimo manejo agronómico, se pueden alcanzar producciones de 14 a 16 T/ha por año productivo, después de los 18 meses de establecido el cultivo.

A pesar de su reconocida importancia en la generación de ingresos para pequeños productores, este cultivo ha tenido poco desarrollo tecnológico, la calidad y productividad presentan alta variabilidad, debido principalmente a la falta de variedades reconocidas y a la falta de material de siembra de calidad genética y fitosanitaria. Hasta el momento la siembra de esta especie se realiza a través del empleo de selecciones locales realizadas por los agricultores (Lobo et al., 2002).

La Cadena Agroalimentaria de la Mora en Colombia está conformada por productores asociados, comercializadores, centros de investigación, industrias, entidades de apoyo. En octubre de 2010 se creó el Consejo Nacional de la Cadena de la Mora, como órgano consultivo del Gobierno Nacional en materia de política para la sostenibilidad y competitividad de la cadena. La cadena de la Mora a través del Consejo, constituyó cuatro mesas temáticas: 1) Plan de Registro, Zonificación, Censo y Certificación; 2) Investigación de la Producción y Transferencia (Mejoramiento, Fisiología y Fitosanidad); 3) Mercado, Agro - industrialización y Fomento; 4) Ambiental. A su vez, la mesa temática de investigación priorizó tres temas de investigación básica de alta repercusión en la cadena. Preparando así, una agenda de investigaciones destacando como objetivos:

 Formalizar la oferta de materiales de siembra previamente caracterizados y sometidos a evaluaciones de estabilidad y adaptabilidad.

 Evaluación de materiales promisorios de mora frente al comportamiento de problemas fitosanitarios.

 Buscar materiales con mayor adaptabilidad y tolerancia a las fluctuaciones climáticas que ocurren con mayor frecuencia en las zonas de cultivo.

 Garantizar a mediano plazo la sostenibilidad del cultivo mediante la utilización de plantas de mora mejor adaptadas a las diferentes zonas de cultivo.

La apuesta entonces, es incrementar los rendimientos mediante la evaluación del comportamiento de materiales promisorios de mora frente a problemas fitosanitarios de alta repercusión en la producción, realizar investigaciones en mora, de cara a problemas de cambio climático y evaluar en pruebas de adaptabilidad y estabilidad materiales promisorios de mora, debidamente caracterizados.

Las investigaciones realizadas desde el año 2000, en mora de castilla por parte del Grupo de investigación en Biodiversidad y Biotecnología de la Universidad Tecnológica de Pereira, han contribuido al fomento y desarrollo de actividades agrícolas alternativas en el cultivo de la mora, especialmente en el área de materiales de siembra con excelente calidad fitosanitaria y productiva mediante investigación científica y participativa, las cuales promueven la generación de conocimiento que le permiten al agricultor vincularse a las cadenas productivas de manera más competitiva.

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4 del material de siembra para la competitividad de la cadena productiva de mora” realizadas en torno a la formalización de materiales de siembra previamente caracterizados, en los cuales se pretende, entre otros, mediante marcadores moleculares de última generación (SNP – Single Nucleotide Polymorphisms) afinar los procesos de caracterización varietal en mora de castilla (Rubus glaucus Benth) y relacionarlos con alguna característica morfológica. Además, obtener por cruzamiento una población segregante, a partir de progenitores previamente caracterizados.

4.2 Marco Teórico

La familia Rosacea comprende alrededor de 90 géneros y unas 3000 especies, dentro de las cuales se incluyen: árboles frutales de importancia económica como manzanas (Malus pumila Mill.) y peras (Pyrus spp.); frutos de hueso como duraznos (Prunus persica); numerosas especies ornamentales como la rosa (Rosa spp.), y frutos blandos como la fresa, la frambuesa y las moras, entre otros. Varias clasificaciones de la familia han sido propuestas basadas en la morfología, mientras que Schulze-Menz (1964) proponen la categorización de la familia en subfamilias: Maloideae, Amygdaloideae, Rosoideae y Spiraeoideae basados en el número de cromosomas y el tipo de frutas (Longhi et al, 2014).

Los géneros de la subfamilia Rosoideae tienen muchas especies, por ejemplo, el género Fragaria tiene 21 especies reconocidas y descritas, entre tanto, el género Rosa tiene unas 120 especies y el género Rubus unas 750 especies (Eriksson et al, 1998). Las especies de la subfamilia Rosoideae exhiben una alta variabilidad morfológica y diferentes niveles de ploidía, por lo tanto, la determinación y clasificación filogenética de las especies de cada uno de los géneros ha sido objeto de numerosos análisis con herramientas moleculares.

4.2.1. Marcadores moleculares para géneros de la subfamilia Rosoideae

En los géneros Fragaria, Rosa y Rubus, se han desarrollado y utilizado exitosamente marcadores microsatélites (SSR) para identificar cultivares. En Fragaria, un grupo de 10 SSRs han sido empleados para caracterizar los bancos de germoplasma de fresa (Govan et al, 2008), y más recientemente Chambers et al. (2013) usó 16 SSRs con un gran número de repeticiones para discriminar cultivares de una colección de 219 individuos. En Rosa, se han utilizado 24 SSRs para caracterizar unos 70 híbridos (Esselink et al, 2003). En Rubus, por su parte, 21 SSRs se utilizaron para discriminar entre 148 accesiones cultivadas y silvestres de moras (Bassil et al, 2012). Otros marcadores moleculares, como los SNP (Single Nucleotide Polymorphism), han sido generados a partir de genomas de la subfamilia Rosoideae empleando el método de secuenciación de Sanger a partir de librerías de expresión (EST) o por secuenciación directa de productos PCR que han amplificado regiones genómicas de interés (Vilanova, 2008).

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5 Los estudios de caracterización molecular también han perseguido la búsqueda de marcadores asociados a resistencia de enfermedades. Dentro de las que se destacan: Botrytis cinerea (moho gris), Phytophthora fragariae y P. cactorum, Verticillium dahliae, y miembros del género Colletotrichum, especialmente, C. acutatum (Antracnosis). Por ejemplo, el gen que controla la pubescencia en el tallo, gen “H”, fue mapeado en una población de raspberry (Rubus idaeus), su forma homocigota (HH) se encuentra difícilmente y está asociada a un gen letal, sin embargo, la forma heterocigota (Hh), se ha asociado a resistencia a Botrytis, pero susceptibilidad al mildeo polvoso (Sphaerotheca macularis) (Jennings at al, 1982; Jennings et al, 1989).

4.2.2. Aspectos biológicos y filogenéticos del género Rubus

Una de la revisiones taxonómicas más reciente identifica en el género Rubus unas 429 especies agrupadas en 12 subgéneros: el más grande es el subgénero Idaeobatus (conocidas como “raspberries”, 117 especies), el subgénero Malachobatus (115 especies provenientes de Asia), y el subgénero Rubus (también conocido como Eubatus Focke; son llamadas comúnmente “blackberries” con unas 132 especies aproximadamente) (Tabla 1). Solo tres de los nueve subgéneros restantes tienen más de seis especies. Numerosas especies y taxa se consideran infragenéricas pertenecen al subgénero Rubus y han sido reconocidas por Focke (Gustafsson, 1943; Weber, 1996).

Tabla 1. Subgéneros de Rubus y número de especies (Focke, 1894).

Subgéneros Número de especies

Anoplobatus (Focke) Focke 6

Chamaebatus (Focke) Focke 5

Chamaemoras (Hill) Focke 1

Comaropsis (Rich.) Focke 2

Cylactis (Raf.)Focke 14 (4 series)

Dalibarda (L.) Focke 5

Dalibardastrum Focke 4

Idaeobatus ( Focke ) Focke 117 (9 secciones)

Lampobatus Focke 10

Malachobatus (Focke) Focke 115 ( 7 secciones)

Orobatus (Focke) 19

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6 Las especies de Rubus comerciales incluyen aquellas que poseen frutos rojos como “raspberries” (R. idaeus L.), y frutos de color negro, “blackberries” como la especie R. occidentalis L; las moras de los Andes (Rubus Suramericanas) son consideradas “blackberries” o “Andean blackberries” (Thompson, 1997).

La variabilidad genética del género Rubus es conocida en todo el mundo y ha sido ampliamente estudiada desde muchos aspectos fenotípico, morfológico, cromosómico y molecular (Alice y Campbell, 1999; Graham y McNicol, 1995; Graham et al., 1997a, 1997b). Uno de los aspectos más interesantes del género es la variabilidad en el número de cromosomas, la poliplodía e hibridización es prevalente en Rubus, solo los subgéneros Idaeobatus, Dalibarda, y Anoplobatus son predominantemente diploides, mientras que Dalibardastrum, Malachobatus, y Orobatus son exclusivamente poliploides (Thompson, 1995, 1997). La hibridización en Rubus se presenta principalmente entre especies estrechamente relacionadas (Steele y Hodgdon, 1963, 1970; Naruhashi, 1979, 1990; Kraft, Nybom y Werlemark, 1995) y en algunos casos entre subgéneros (Gustafsson, 1942; Jennings, 1978; Weber, 1995; Alice, et al., 1997), incluso, varios híbridos intersubgenéricos son de importancia comercial (Waught et al., 1990).

4.2.3. Marcadores moleculares para el género Rubus

La variabilidad genética del género Rubus es conocida en todo el mundo y ha sido ampliamente estudiada desde muchos aspectos fenotípico, morfológico, cromosómico y molecular (Alice et al, 1997; Graham y McNicol, 1995; Graham et al., 2002, 2004, 2006).

La especie Rubus glaucus, mora de los andes, está distribuida en las tres cordilleras de Colombia, combina características del subgénero Idaeobatus, y del subgénero Rubus. Es un anfidiploide ó alotetraploide fértil, que se originó por la fusión de los genomas de dos especies (Jennings, 1988). La mayoría de las especies del género Rubus son plantas perennes que emiten ramas o cañas de tallo corto, formando una macolla hasta de cinco metros de diámetro. Las ramas y hojas están provistas de espinas curvas, los tallos jóvenes y el reverso de las hojas están cubiertos de una cera blancuzca que le da el color característico de la especie (León, 1987). Delgado et al. (2010) encontraron para cultivares de la especie R. glaucus un número de 28 cromosomas, asumiendo como número básico del género Rubus n=7, Rubus glaucus con lo cual se corroboraría que esta especie es tetraploide (4x).

En Colombia hay algunos esfuerzos en el estudio de la diversidad genética del género, Zamorano et al. (2004) realizaron una caracterización molecular y morfológica de especies del género Rubus utilizando microsatélites aleatorios RAMS. Colectaron 31 muestras en la zona sur del país y cuatro muestras de la Universidad del Quindío procedentes de cultivo in vitro y un material cultivado del Municipio de Miranda (Cauca), para un total de 36 materiales que se conservan en una colección en Palmira. Las colectas se realizaron en los departamentos de Valle, Cauca y Nariño, las especies colectadas y observadas, por el grupo de la Universidad Nacional sede Palmira, fueron Rubus glaucus, R. urticifolius y R. robustus. También se observó la especie Rubus idaeus que cohabita en algunos sitios del Valle con R. glaucus y R. urticifolius.

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7 encontraron valores de similitud del 85 y el 100% para los doce cebadores RAPDs utilizados, sugiriendo así menor variación entre los materiales cultivados.

Marulanda et al, (2007) evaluaron la diversidad genética de especies cultivadas y silvestres del género Rubus, entre ellas, R. robustus, R. urticifolius, R. glaucus y R. rosifolius mediante AFLP y marcadores microsatélites desarrollados para la especie R. alceifolius. Este estudio arrojó patrones de bandeo específicos para cada una de las especies, además los microsatélites utilizados permitieron distinguir genotipos diploides de tetraploides. Se encontró además, que ambas técnicas (AFLP y SSR) se complementaron para explicar las relaciones entre especies cultivadas y silvestres del género Rubus en la zona andina colombiana.

Marulanda y López (2009) realizaron caracterizaciones tanto moleculares como morfoagronómicas para especies cultivadas y silvestres de Rubus glaucus con y sin aguijones. Las caracterizaciones moleculares fueron realizadas con SSR desarrollados para otras especies del género Rubus, los cuales fueron transferibles a la especie Rubus glaucus. Las evaluaciones tanto morfológicas como moleculares permitieron diferenciar materiales cultivados y no cultivados de R. glaucus.

Duarte et al (2011), evaluaron la huella genómica y las relaciones genéticas de genotipos élite de Rubus glaucus colombianas, mediante el análisis de marcadores AFLP generados con el uso de tres combinaciones de cebadores. De un total de 179 loci amplificados por las tres combinaciones, 20% resultaron polimórficos, con un alto porcentaje de similitud entre los genotipos evaluados.

Finalmente, Marulanda y López (2012), desarrollaron marcadores microsatélites específicos para la especie R. glaucus, con el fin de obtener mayores poderes de discriminación, encontrando, que el número de marcadores microsatélites necesarios para una identificación de ciertos cultivares es de 12 SSR, aunque se concluyó la necesidad de desarrollar marcadores moleculares más discriminatorios y posiblemente asociados a características morfológicas de interés.

4.2.4. Biología reproductiva en Rubus glaucus

En mora de castilla (R. glaucus) se presentan dos tipos de propagación natural, por semilla y vegetativamente. En uno de los primeros reportes sobre esta especie, se resalta la semejanza de las plantas desde Guatemala hasta Ecuador y se sugirió la posibilidad de que sea una especie apomíctica (Darrow, 1952), donde la producción de semilla se da tanto por recombinación genética entre los genomas parentales, como semilla con información genética idéntica a la planta madre. Un estudio preliminar sobre la biología floral de R. glaucus, señala en primer lugar que el número de pistilos es mayor al número de estambres por fruto, en una proporción de 2:1. Y con respecto al método de polinización que permite un mejor cuajado de fruto, se encontró que la polinización cruzada muestra un número mayor de drupeolas formadas, que el método de autopolinización, así como una mejor calidad en la distribución y tamaño de las drupeolas. El estudio concluye que la mora es una especie de polinización cruzada, que permite un 20% de autopolinización y que puede presentar incompatibilidad parcial (Santana y Echeverri, 2000).

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8 La mayoría de los cultivares de red raspberry se han originado a partir de dos subespecies: las raspberries europeas, R. idaeus, plantas diploides caracterizadas por sus inflorescencias sin vainas y frutos en forma de dedal; y la raspberry norteamericana, R. strigosus, otra especie diploide de frutos redondeados. Los híbridos entre estas dos especies han sido exitosos. Cinco cultivares parentales dominan los ancestros de raspberry (Dale et al., 1993). Los cuales incluyen ‘Lloyd George’ y ‘Pyne’s Royal’ derivados de R. idaeus, ‘Newburgh’ derivado de R. strigosus, y ‘Preussen’ y ‘Cuthbert’ derivados de cruzamientos entre R. idaeus y R. strigosus. Los mejoradores han utilizado recientemente otras especies del subgénero Idaeobatus, como R. occidentalis, R. cockburnianus Hemsl., R.biflorus Buch., R. kuntzeanus Hemsl., R. parvifolius Hemsl., and R. pungens oldhamii [Mig]. Maxim), y una del subgénero Anoplobatus (R. odoratus L.) para desarrollar nuevos cultivares (Daubeny, 1996).

Por su parte, las blackberries fueron domesticadas en Europa en el siglo XVII y en Norte América en el siglo XIX (Jennings, 1988). A medida que se presentaba el desplazamiento de los colonos a nuevas áreas, se promocionó la siembra de especies nativas de blackberries en donde se permitió el cruzamiento natural. Estas selecciones silvestres incluyeron los cultivares ‘Aughinbaugh’, ‘Dorchester’, ‘Lawton’, ‘Eldorado’, y ‘Lucretia’, los cuales fueron liberados en la década de 1850 (Jennings, 1988). La superioridad de estos cultivares contribuyeron enormemente al aumento en los cultivos en Norte América.

La mayoría de las blackberries cultivadas en Europa están relacionadas, o se han derivado, de R. ulmifolius, R. nitidioides y R. thrysiger (Hall, 1990). Los mejoradores de blackberries todavía no han aprovechado un vasto reservorio de especies e híbridos que se presentan en muchas partes del mundo (Hall, 1990).

Para el caso de Rubus glaucus, solo se presentan dos reportes de cruzamientos, uno realizado por la Universidad de Maryland (Estados Unidos), donde se cruzaron muestras de R. glaucus colectadas en Venezuela, sin resultados positivos y el otro realizado por el Departamento de Agricultura de los Estados (USDA) y la Universidad de Oregon, a partir de R. glaucus ecuatorianas, con resultados experimentales positivos en el origen de progenies, pero no se reportan otros resultados relacionados con el cruzamiento (Postman, 2001).

4.3 Objetivos Objetivo general

Caracterizar materiales promisorios de mora de castilla (Rubus glaucus Benth) diferenciales en características de interés agronómico, mediante marcadores moleculares, con el fin de seleccionar parentales para procesos de cruzamiento.

Objetivos específicos

1. Caracterizar cultivares promisorios de mora de castilla contrastantes para una característica morfológica, mediante marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) obtenidos previamente, a partir de la evaluación del transcriptoma. 2. Obtener por cruzamiento una población segregante de mora de castilla,

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9 4.4 Metodología propuesta

A continuación se describe la metodología para alcanzar cada uno de los objetivos:

Para el Objetivo específico 1. Caracterizar cultivares promisorios de mora de castilla contrastantes para una característica morfológica, mediante marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) obtenidos previamente, a partir de la evaluación del transcriptoma.

Antecedentes

Para la obtención de marcadores SNP, el Grupo de Investigación en Biodiversidad y Biotecnología realizó durante los años 2012- 2014, la identificación de genes involucrados en la tolerancia de cultivares de mora de castilla al ataque de antracnosis (Colletotrichum gloeosporioides) mediante el análisis del transcriptoma (RNA - seq). Las nuevas metodologías de pirosecuenciación recientemente desarrolladas, han facilitado el estudio de los transcriptomas en plantas conocidas como modelos biológicos. La metodología de RNA – seq, consiste en la obtención de un conjunto de ARN (total o fraccionado, tal como cadenas de poly (A) +), la posterior obtención de ADNc con la enzima transcriptasa inversa lo que finalmente permite tener una librería de cDNA con adaptadores que son dispuestos en uno o ambos extremos de los fragmentos. Cada molécula, con o sin amplificación es secuenciada de forma tal, que se obtienen secuencias cortas. Estas lecturas pueden tener un tamaño que oscila entre 30 – 400 pb, dependiendo de la tecnología de secuenciación. Luego de la secuenciación, los resultados de las lecturas son alineados a uno o varios genomas de referencia o transcritos de referencia, o son ensamblados de novo sin la secuencia genómica que produzca una transcripción (Wang et al., 2008).

El análisis de expresión diferencial mediante RNAseq, de cultivares de mora de castilla susceptibles y tolerantes, cuando fueron infectados con Colletotrichum gloeosporioides, permitieron seleccionar mediante los programas Bowtie2 v2.2.4 (Langmead and Salzberg 2012) y Samtools v0.1.19 (Li et al., 2009) 200 genes donde se encontraron marcadores SNPs. A partir de estos genes, se diseñaron 100 primers para genotipificación por medio de PCR. Para este

diseño se utilizó el software BatchPrimer3,

(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/index.html).

Los marcadores SNPs previamente descritos serán validados para ser utilizados en evaluación de cultivares de mora de castilla previamente caracterizados por el grupo de Investigación.

Para la caracterización con los marcadores SNP se utilizarán los siguientes elementos:

Material vegetal

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10 caracterizaciones moleculares con marcadores microsatélites y/o evaluaciones de campo se reportaron previamente (López et al, 2013; Marulanda et al, 2012).

Extracción de ADN

Para la extracción de ADN se utilizará tejido foliar sano y el kit comercial Plant DNeasy Mini Kit (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Las reacciones de amplificación se llevarán a cabo mediante condiciones descritas por Marulanda et al. (2007, 2009), y un perfil de amplificación “touchdown”. Los primers para detectar posibles diferencias SNP, se referencian en el anexo 1. Las reacciones de amplificación se llevarán a cabo en un volumen final de 12,5 µl con 0.3 µM de cada uno de los primers, 15 µM de cada DNTP, 1 X de buffer de reacción (10mM de Tris HCl, 50mM de KCl, 1,5mM de MgCl2), 1U de Taq polimerasa, 2 mM de MgCl2 y 10 ng/µL de ADN. Se realizará un programa de amplificación, de 32 ciclos con desnaturalización a 95°C por 60 sefundos; apareamiento por 60 segundos, con disminución de temperatura de 1°C, cada dos ciclos desde 64°C a 59°C, 10 ciclos a 58°C, y 10 ciclos a 57°C; extensión a 72°C por 60 segundos; y una extensión final a 72°C por 5 min. La separación de los productos amplificados se realizará mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 6%, los cuales serán corridos en cámara vertical Sequi-Gen Sequencing Cell de BioRad, a 110 W durante una hora a una temperatura de 50°C. Los geles serán teñidos con nitrato de plata siguiendo el protocolo de Benbouza et al. (2006).

Finalmente, los productos amplificados serán secuenciados, y las secuencias obtenidas serán verificadas mediante un análisis BLAST (Basic Local Alignment Search Tool – NCBI), posteriormente, se alinearán mediante un análisis Clustal Omega (EMBL –EBI), con el fin de encontrar la posible diferencia nucleotídica en las muestra analizadas.

Análisis de los resultados de amplificación

Se realizará una correlación entre los polimorfismos generados en la amplificación de los SNP, y los cultivares evaluados con características diferenciales (Presencia - Ausencia de aguijones, respuesta diferencial ante el ataque de C. gloeosporioides), generando los siguientes grupos:

 Perfiles SNP iguales y cultivares con aguijones.  Perfiles SNP iguales y cultivares sin aguijones.

 Perfiles SNP iguales y cultivares tolerantes a C. gloeosporioides  Perfiles SNP iguales y cultivares susceptibles a C. gloeosporioides

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11 Progenitores:

Se utilizarán como progenitores los materiales de mora previamente caracterizados morfológica y molecularmente (López et al, 2013; Marulanda et al, 2012), y diferentes en al menos una característica de interés. A continuación se detallan los progenitores:

UTP 1: Cultivar de alta producción (17 Ton /ha /año), sin aguijones, con sobreexpresión de genes ante el ataque de C. gloeosporioides.

UTP 7: Cultivar de alta producción (17 Ton /ha /año), sin aguijones, con sobreexpresión de genes ante el ataque de C. gloeosporioides.

UTP 4: Cultivar de alta producción (15 Ton / ha/ año), con aguijones, susceptible al ataque de C. gloeosporioides y tamaño de fruta superior.

Los progenitores se dispondrán en potes individuales, manteniendo las condiciones de nutrición y fitosanidad para asegurar su floración.

Cruzamientos y Diseño experimental

Se realizará una polinización cruzada controlada, con tres progenitores. El modelo de cruzamiento será dialélico recíproco 3 x 3 (sin considerar autofecundaciones), para un total de 6 cruzamientos. Las flores receptoras de polen sufrirán un proceso de emasculación con el fin de evitar la autopolinización, cuando se encuentren en el paso de botón floral a flor abierta, y recibir el polen de los cultivares masculinos. Después de realizada la polinización manual, las flores serán embolsadas para evitar la posterior recepción de polen, y se permitirá la formación de los frutos, los cuales corresponderán a una drupa.

Tanto los cuatro progenitores, como sus seis cruzamientos simples resultantes (F1), se establecerán bajo un diseño experimental completamente aleatorizado en condiciones de vivero. El manejo del experimento en general, se hará de acuerdo a las recomendaciones técnicas, derivadas a partir de visitas semanales.

Obtención y siembra de semillas

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12 Comprobación de la efectividad de los cruzamientos

Para comprobar la efectividad de los cruzamientos (segregación), serán evaluadas las progenies y sus progenitores mediante el uso de dos marcadores SSR previamente reportados por Marulanda et al. (2012), que tengan un alto contenido polimórfico.

Análisis genético

Se empleará el método III de Griffing (1956), para el análisis del cruzamiento dialélico, en el cual se estudiarán los seis cruzamientos directos (Cruz et al., 2004). El modelo permitirá realizar un análisis de la Aptitud Combinatoria General (APG) y de la Aptitud Combinatoria Específica (ACE) para la presencia / ausencia del aguijón. El análisis se realizará bajo el siguiente modelo genético estadístico (1):

𝑌𝑖𝑗𝑘 = 𝜇 + 𝐺𝑖 + 𝑆𝑖𝑗 + 𝑟𝑖𝑗 + 𝜀𝑖𝑗𝑘 (1)

Donde:

𝑌𝑖𝑗𝑘: Observación 𝑖𝑗𝑘 ésima.

𝜇: Media de la población.

𝐺𝑖: Efecto de la aptitud combinatoria general del 𝑖 - ésimo y 𝑗 - ésimo padre.

𝑆𝑖𝑗: Efecto de la aptitud combinatoria específica entre el 𝑖 - ésimo y 𝑗 - ésimo padre.

𝑟𝑖𝑗: Efecto recíproco que mide las diferencias proporcionadas por el progenitor 𝑖, o 𝑗, cuando es utilizado como progenitor masculino o femenino en el cruzamiento 𝑖𝑗.

𝜀𝑖𝑗𝑘: Error experimental.

La ACG servirá para definir el comportamiento promedio de una línea en combinaciones híbridas.

La ACE identificará las mejores combinaciones híbridas donde se designarán aquellos casos en los cuales ciertas combinaciones lo hacen relativamente mejor o peor de lo que podría esperarse.

Estrategias de divulgación

Los resultados de este proyecto esperan ser socializadas a través de publicaciones científicas en revistas indexadas y mediante ponencias en eventos científicos de carácter nacional.

4.5 Resultados esperados2

A continuación se relacionan los resultados a obtener por cada uno de los objetivos específicos:

Objetivo específico Resultado Tipo de resultado

Caracterizar cultivares promisorios de mora de castilla contrastantes para una característica morfológica,

Patrones de amplificación de al menos 10 cultivares promisorios de mora con

Generación de nuevo conocimiento.

(14)

13 mediante marcadores SNP (Single

Nucleotide Polymorphisms) obtenidos previamente, a partir de la evaluación del transcriptoma.

los marcadores SNP previamente desarrollados.

Caracterizar cultivares promisorios de mora de castilla contrastantes para una característica morfológica, mediante marcadores SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) obtenidos previamente, a partir de la evaluación del transcriptoma.

Asociación entre los datos morfoagronómicos

previamente obtenidos con posibles polimorfismos derivados de las caracterizaciones

moleculares.

Obtener por cruzamiento una población segregante de mora de castilla, correspondiente a la primera generación filial, a partir de progenitores previamente caracterizados y diferentes en al menos una característica de interés morfoagronómico.

Obtención de al menos una población segregante de mora de castilla a partir de progenitores previamente caracterizados.

Obtener por cruzamiento una población segregante de mora de castilla, correspondiente a la primera generación filial, a partir de progenitores previamente caracterizados y diferentes en al menos una característica de interés morfoagronómico.

Determinación de la Aptitud Combinatoria Específica (APE) y la Aptitud Combinatoria General (APG)

Todos Formación de un doctorado

en Ciencias Agrarias

Fortalecimiento de la comunidad científica colombiana

Todos Sometimiento a

publicación de al menos un artículo científico en revista indexada nacional o internacional

Apropiación

social/pública del conocimiento

Todos Participación como

ponente, en al menos un evento científico de carácter nacional

Apropiación

social/pública del conocimiento

(15)

14 Impactos durante la ejecución del proyecto:

Los procesos de laboratorio serán desarrollados en laboratorios especializados, con protocolos de manejo de residuos peligrosos estandarizados, con el fin de minimizar los efectos negativos sobre el ambiente y la salud humana, que puedan tener la ejecución de actividades propias del desarrollo del proyecto.

Impactos a largo plazo sobre la cadena productiva:

Se espera que en los próximos 10 años, mediante la aplicación de marcadores tipo SNPs, resultados de ésta investigación, se fortalezca la competitividad de la cadena mediante la selección temprana de materiales promisorios para siembra para mora de castilla (Rubus glaucus Benth).

4.7 Cronograma de actividades:

A continuación se discriminan las actividades a desarrollar para un periodo de 2.5 años (30 meses), descritas por TRIMESTRE:

Actividad 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Selección de cultivares promisorios de R. glaucus

X

Extracción de ADN para evaluación de marcadores SNP previamente

desarrollados

X

Estandarización y amplificación con marcadores SNP previamente desarrollados

X X

Validación de marcadores que presenten polimorfismos con características

morfoagronómicas previamente evaluadas

X X X

Disposición de progenitores en condiciones de vivero

X

Cruzamientos entre progenitores X X

Obtención de semillas X

Siembra de semillas X

Evaluaciones morfológicas en la F1 X

Análisis de resultados X

(16)

15 5. Compromisos

Al finalizar la ejecución del proyecto doctoral se espera:

 Someter a publicación al menos un artículo científico en revista indexada nacional o internacional.

 Participar como ponente, en al menos un evento científico de carácter nacional

6. Bibliografía

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(20)

19 7. Presupuesto

PRESUPUESTO

RUBROS*

FUENTES

TOTAL UNIVERSIDAD FINANCIACIÓN EXTERNA

RECURRENTE3 _V.I.P. _RECURRENTE RECURSOS

FRESCOS 1. SERVICIOS

PERSONALES 1.1 Investigadores

$ 48.600.000 $ 48.600.000

1.2 Auxiliares $ 7.200.000 $ 7.200.000

1.3 Consultores

1.4 Asesores $ 36.000.000 $

36.000.000

2. GASTOS GENERALES

2.1 Servicios técnicos

2.1.1 Exámenes

2.1.2 Pruebas

$ 30.000.000 $

30.000.000 2.2 Materiales e insumos

2.2.1 De campo 2.2.2 De oficina (papel,

tinta, fotocopias) $ 500.000 $ 500.000

2.2.3 De laboratorio

$ 10.000.000 $

10.000.000 2.3 Apoyo económico

para gastos de viaje y transporte 2.3.1 Tiquetes aéreos

2.3.2 Pasaje terrestres $ 1.440.000 $ 1.440.000

2.3.3 Gastos de viaje (Gasolina y Peaje) 2.3.4 Auxilio para viaje 2.3.5 Apoyo económico para alojamiento y alimentación4

$ 1.500.000 $ 1.500.000

2.5 Equipos

2.5.1 Alquiler 3. INVERSIÓN 3.1 Equipo requerido

3.1.1 Para comprar $ 66.584.000 $

66.584.000

3.1.2 Propio $ 28.000.000 $

28.000.000

3 Costos recurrentes son los rubros existentes en cada institución o empresa

(21)

20 RUBROS*

FUENTES

TOTAL UNIVERSIDAD FINANCIACIÓN EXTERNA

RECURRENTE3 _V.I.P. _RECURRENTE RECURSOS

FRESCOS 3.2 Planta física

3.2.1 Adecuación 3.2.2 Alquiler

3.4 Material bibliográfico 3.4.1 Para comprar 3.5 Software 3.5.1 Para comprar 3.5.2 Propio

1. ADMINISTRACIÓN 20%

TOTAL $ 64.000.000 $ 165.824.000 $

229.824.000 PORCENTAJE DE

FUENTES

27.8 % 72.2 % 100 %

(22)

21 TABLAS DE ANEXO AL PRESUPUESTO

Descripción de los gastos de personal Nombre del

Investigador / Experto/ Auxiliar/estudiante

Formación Académica

Función dentro en del

proyecto

Institución o Empresa

Tipo de vinculación

DEDICACIÓN Horas/semana

Fuentes

Total Recursos de esta

convocatoria Especie

Carlos Felipe Barrera Ingeniero agrónomo Ph.D

Asesorar actividades científicas

conducentes al logro de los objetivos del proyecto

Universidad

de Caldas Docente ocasional 5 $ 36.000.000 $ 36.000.000

Ana María López Gutiérrrez Ingeniera agrónoma M.Sc

Coordinar y ejecutar actividades científicas conducentes al logro de los objetivos del proyecto

UTP Contrato 20 $ 48.600.000 $ 48.600.000

Paola Andrea López Mora Bióloga

Apoyar la realización de pruebas de laboratorio

UTP Contrato 10 $ 7.200.000 $ 7.200.000

(23)

22 Descripción de equipos a adquirir

Equipos Justificación

Fuentes Otras fuentes

Total Recursos de esta

convocatoria Sistema de documentación y

análisis de geles GELDOC XR

Documentación de geles con colorantes

fluorescentes y visibles $ 36.540.000 $ 36.540.000

Termociclador c1000 Touch Biorad con bloque de 96 pozos.

Se requiere para los protocolos de

extracción de ADN $ 27.492.000 $ 27.492.000

MacBook Pro 13"

Análisis bioinformático que requiere análisis computacional de alto rendimiento

$ 2.552.000 $ 2.552.000

Totales $ 66.584.000

Descripción de software a adquirir

Software Justificación

Fuentes Otras fuentes

Total Recursos de esta

convocatoria

Descripción y justificación de viajes

(24)

23 Universidad de Caldas

(Manizales)

Asesoría en análisis de información y afinamiento de procesos de laboratorio y / o campo.

$ 20.000 $ 20.000 72 $ 2.880.000

Totales $ 2.880.000

Valoración de salidas de campo (complete un cuadro por salida o pondere el total de las salidas) Lugar de la Salida :

Justificación:

Concepto $ / día No. de Días TOTAL

Alimentación Alojamiento Transporte

TOTAL

Material Bibliográfico (en miles de $)

Ítem Justificación Valor

(25)

24 Anexo 1. Primers para detectar secuencias SNP (Secuencias NO PUBLICADAS, pertenecientes al Grupo de Investigación en Biodiversidad y Biotecnología)

Primer Secuencia 5’ – 3’

Unigene11151 F TATGTGGGGGTGAAGAAAGC

Unigene11151 R ACAGGACCCAATCATCCAAC

Unigene11157 F CCAAGGAAACTTGCTCCAAC

Unigene11157 R AGCCTTAAACTTGCCAGCAC

Unigene11255 F TGATGGCGCAGATAAGAAGA

Unigene11255 R AGACTCAACAGCGCCAACTT

Unigene11861 F TGTTGCAGTGGGGTTTGATA

Unigene11861 R AAGAACCAAGCCTCTCACCA

Unigene12343 F TGGATCCAGATGAGTCCAGA

Unigene12343 R CGGACGTTTTCCCAAATCTA

Unigene12346 F CCTGTATGGCCAAAGGATTC

Unigene12346 R CAGGATCTTTCCGAGGATCA

Unigene12652 F GGGATCGTTAAATCCCGAGT

Unigene12652 R TCTGTTTTGCATGCTCCTCTT

Unigene12924 F GGACCAATTCCTTGTGTGCT

Unigene12924 R TGCCGTGACTGTATCCTTGA

Unigene13090 F GGCTCAGAACTGTGGGGTTA

Unigene13090 R CACATTGTAGGCATCCCAGA

Unigene13465 F CATTGCGCTTGTTAGTGAGG

Unigene13465 R ACATGCTGCCTCGGTACTTC

Unigene1465 F TCGTCTGTTTTGGCTCTTGA

Unigene1465 R TACTCCCCTTGCTTGAGTCG

Unigene14681 F ATCAGGAATGGGCTGAGCTA

Unigene14681 R AGCAGCCTTCAAACTCTCCA

Unigene14822 F TACTGGATCGCTCAGCTCCT

Unigene14822 R TGTGTACACCAACCCGAATG

Unigene14951 F ATGGCAGTACCCAAATCAGC

Unigene14951 R TGGGTAATTGATGGTGGTGA

Unigene15095 F TTCCTGCTGATGAATGCAGA

Unigene15095 R GAACCTGTCCTTGGAGCTTG

(26)

25

Unigene15115 R AAGCTTTCCCAATTGCCTCT

Unigene15294 F GCCAGGAGTTTGCTGAGTTC

Unigene15294 R ATGGGCAAGTAGCTCTCCAA

Unigene15456 F ACAAGCTTCTGGTGGAAGGA

Unigene15456 R AAGAAGAGCCCCGTCAAACT

Unigene15499 F TGCACCAACAGACCATAAGC

Unigene15499 R ATAATTCCCACAGGCTGTCC

Unigene15574 F CCTGCTGAGGTGGAATCAGT

Unigene15574 R CGATCCAACAAACATGCCTA

Unigene16239 F AGAGGGAGGATCAAGGAGGA

Unigene16239 R GGGCATTGTATCATGTACGG

Unigene16323 F AAAGACGGTGGAGAGGAACC

Unigene16323 R TTTATGTAGGAGGCCGCAAG

Unigene16368 F GGTTGCCAAGATCAAAGAGG

Unigene16368 R CCGGTGTGCTTAGTTCCTTG

Unigene16415 F GCGGGTGCAGATAAGAAAAG

Unigene16415 R TTCTTCTTGCGCTCCATAGC

Unigene16433 F AGCAGGAGAGGAAACTCCAA

Unigene16433 R TGGCATAAAGCTCAAGATGC

Unigene16551 F CTTGTTTCCCCTTCATCCAA

Unigene16551 R TTGCAGCATTTCCCTCTCTT

Unigene16658_F TATCCTTATCCCCACGAGCA

Unigene16658_ R AACCCAGCAAACAGGCATAC

Unigene16701 F TTATGGAGCTTCGCACACTG

Unigene16701 R TGCTTGGTTTACCACATCCA

Unigene17423 F AGAGGGTCGTCGTACGTGAA

Unigene17423 R CGACGCTCTTCCCTTGATAG

Unigene1754 F TGTCGAATTAATGGCCAAGAC

Unigene1754 R CCCGAAATCTGATTGTGCTT

Unigene1903 F AGTCGACCCCTCAAACAATG

Unigene1903 R TCTAGGATGCTGCTGCTGTG

Unigene1968 F GTTGACCCATTGCAACACTG

Unigene1968 R TCATATGCTGTGAGCCTGGA

Unigene2064 F AGTACACGGATGCCTTGCTT

(27)

26

Unigene2247 F GTGTCCGGAGATCAAGCAAC

Unigene2247 R CTTTGATAGCCTGCCCAATC

Unigene2361 F AGCAGTTGCTGCACTTTCAA

Unigene2361 R AACGCCTGTTCACTTTTTGC

Unigene2373 F TGGCCTCACCAACACTTGTA

Unigene2373 R GAGTCGCCACAGCGATAGAT

Unigene2387 F GACACCATCGGAGACCTGAA

Unigene2387 R GTAGAGCTCGAGACCCATGC

Unigene242 F GGAGAAGAAGCTGCTGGAGA

Unigene242 R TCGCTCTTGACCCTCTCAAT

Unigene2512 F AAGTGGCAGCGAACAAGAAA

Unigene2512 R GAATCTCCCCACAAACAGGA

Unigene31842 F CTGGCCAGAAGAAGGATTGA

Unigene31842 R TCTCCAAGAAGAATGTTTGAAGG

Unigene33255 F TGATGGCTTGAAGCTTTTGA

Unigene33255 R AGCGCTTGAAACAAATTTCC

Unigene33871 F CAACGTGGGGAGGTATTTGA

Unigene33871 R GCTCAACGTGATTTGCATGT

Unigene34846 F GTCAGGACCTCAGTGCTGCT

Unigene34846 R GGTGGGTGAGTACCAAATATGTC

Unigene34996 F ATCAGTGCTGGGGTGAATG

Unigene34996 R CTCCCCTGATGCGATCTTAG

Unigene351 F TTGCTGATGACACGAATGGT

Unigene351 R TTGTTGGCAAATGTCCGATA

Unigene3573 F GCACCAACATCATCAAATGC

Unigene3573 R TTCGTTGTACGCCTCAATGT

Unigene36231 F AAGGGAGATGTGGTGTTGGA

Unigene36231 R TAAAACCAACACCCCCAAGA

Unigene3673 F GGGCTGCACCTCTTTGTATC

Unigene3673 R ACATGCTCCCACAAACGAAT

Unigene37334 F GTCCACAAGGCTTCCTTCAG

Unigene37334 R GATTCTGTTGCCCTTGCACT

Unigene3877 F ATCGGAAGTGGCTATGGTGA

Unigene3877 R GCCTGAGCACTGCTATACCC

(28)

27

Unigene42870 R AGGTCCATCTTGCTGGGTAG

Unigene44108 F GGGCAGCAAGCAAAATAGAG

Unigene44108 R TTCTTGCTGCGTTGTATTGC

Unigene44250 F AGCAAGAGAGCCAGGAAGTG

Unigene44250 R CAGACAGGCCAAAACTACGC

Unigene44376 F AGAATGAGGGCGCTGATAAA

Unigene44376 R AAGCTTCCGGACCTTTTCTG

Unigene4592 F TGGGGATATGGAAAAATTGAA

Unigene4592 R TTTTTGAAACCCATCCAGGT

Unigene47613 F TTGTTTCTGGGATTGCCATT

Unigene47613 R CTCCACACTCTGCACACTCC

Unigene47941 F GAAGGAGAGAAGAAAGGCAGTG

Unigene47941 R TGACTGAAGTTGGTGGGTCA

Unigene49539 F ACTGTGGAGAAGGCTGCTTG

Unigene49539 R TGTGATTCAACCTCCCACAA

Unigene49785 F AATTGGTGAAGCTGGTGGAG

Unigene49785 R AAACCTTTTGCCTCCTTGCT

Unigene49943 F GCTCCCATGCCAAGTTTCTA

Unigene49943 R AAGACATGTCCCACCACCTT

Unigene5064 F AAAGGTCGTCCTCCCACCT

Unigene5064 R TTTGCAAGAGAGCACTCCAA

Unigene5209 F TCAGTTCAATCGGAGCACAC

Unigene5209 R ATGCAGCCCATGACTGATAA

Unigene5601 F ATCTTCGAGAAGCTCGCTCA

Unigene5601 R TGACAGCCTTAGTCCCCTCA

Unigene6238 F GGCTCTGGACTCGAACAATC

Unigene6238 R AGCCTCCTCCTTGAAGAACA

Unigene6936 F GCACGAGAGGATGATGACAG

Unigene6936 R TCCACTATCAGGCTGTGCTG

Unigene7103 F CAAAGGTCCCAAATCCTGAA

Unigene7103 R TTTTCTACCCGGAACAAAGG

Unigene7104 F AGCATTCGACTCATCACCAA

Unigene7104 R GGTGGAGGGTAGAGGATTGA

Unigene7201 F TGAGCATATCACTCCCATGC

(29)

28

Unigene7352 F GTACAGAGCCACCCAAAGGA

Unigene7352 R GAGCTGATGGCTCGACTTTC

Unigene743 F ATGGCCTTCCAGGAGAAACT

Unigene743 R GTATGATCTCGCGCTCTCG

Unigene7441 F ATGGGTCAACAACAGGCATT

Unigene7441 R CGCAGTCATCCTCATTTTCA

Unigene7535 F AAACCATTTGCCTGAGAAGC

Unigene7535 R CCTGGCTTTCCACTCTCAAG

Unigene8092 F GATCAGAGACCCGTGGAAGA

Unigene8092 R GAGGGAGAGATCTGCTCTGG

Unigene8275 F TTTCGAATGTCCGTGTTGAA

Unigene8275 R GACTCTGGCCCAACAAAATC

Unigene8299 F TTTGCAAGGCACTGAGTGAG

Unigene8299 R CCAAGAGCTCCACATCATCA

Unigene8320 F GCCTTCCTTGATTTTCAGCA

Unigene8320 R TTGGACAGCATCCAGGTTCT

Unigene9045 F CGCAAATCCCTCACTACCAT

Unigene9045 R CACAACATCCCCAGAGTCAC

Unigene9227 F AGCCTTGGTGTGGTTTATGG

Unigene9227 R CAGCAAGGGCATCAGTGTAA

Unigene9370 F TGCTTACCATCAACCTGGTG