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Aprovechamiento del Suero de Leche de Cabra como Sustrato
para el Desarrollo de un Producto Fermentado Probiótico con:
Bifidobacterium Bifidum y Lactobacillus Acidophilus
Title Aprovechamiento del Suero de Leche de Cabra como Sustrato para el Desarrollo de un Producto Fermentado Probiótico con: Bifidobacterium Bifidum y Lactobacillus Acidophilus
Authors Lomas de León, Yajaira G.
Issue Date 01/05/2005
Abstract La palabra probiótico proviene del griego y significa “Por la vida2 (Torres, 2002). El concepto de probiótico ha evolucionado probablemente desde la teoría propuesta por el científico ruso, Eli Metchnikoff, quien en 1908, atribuyo la extraordinaria longevidad de los pobladores de los Balcanes, al consumo de productos lácteos fermentados. El termino probiótico fue usado por primera vez por Lilly and Stillwell en 1965, quienes lo definieron como, sustancia secretada por un microorganismo, el cual estimula el crecimiento de otros (Fioramonti et. al., 2003). La definición de probióticos ha sido modificada en innumerables ocasiones (Fioramonti et. al., 2003), la Última definición fue publicada por Reid et. al. (2003), quien define a los probióticos como: “microorganismos vivos, los cuales al ser administrados en cantidad adecuada, confieren beneficios fisiológicos al hospedero. Esta
Discipline Ingeniería y Ciencias Aplicadas / Engineering & Applied Sciences
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Dra. Cecilia Rojas de Gante
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AGRADECIMIENTOS
Dra. Cecilia Rojas de Gante, autora intelectual del tema de tesis. Por su paciencia, apoyo y comprensión durante la investigación. Gracias por guiarme en esta etapa de mi vida.
FUNDACION PRODUCE DE NUEVO LEON, A.C., por el apoyo económico para la realización de esta investigación (Proyecto 165).
Dr. Sergio O. Serna Saldívar y Dr. Manuel Zertuche Guerra, por su participación como sinodales en la defensa de tesis.
A la Q.B.P. María Isabel García, M.C. Juan Gerardo Cantú y Q. Mireya Zavala, por el apoyo técnico y moral durante la investigación.
Antecedentes
Capitulo 1.- Antecedentes
1.1.
Probióticos.
La palabra probiótico proviene del griego y significa “Por la vida” (Torres, 2002). El concepto de probiótico ha evolucionado probablemente desde la teoría propuesta por el científico ruso, Eli Metchnikoff, quien en 1908, atribuyo la extraordinaria longevidad de los pobladores de los Balcanes, al consumo de productos lácteos fermentados. El termino probiótico fue usado por primera vez por Lilly and Stillwell en 1965, quienes lo definieron como, sustancia secretada por un microorganismo, el cual estimula el crecimiento de otros (Fioramonti et. al., 2003). La definición de probióticos ha sido modificada en innumerables ocasiones (Fioramonti et. al., 2003), la última definición fue publicada por Reid et. al. (2003), quien define a los probióticos como: “microorganismos vivos, los cuales al ser administrados en cantidad adecuada, confieren beneficios fisiológicos al hospedero”. Esta definición involucra tanto la dosis, la viabilidad de los microorganismos, así como los beneficios fisiológicos que confieren estos al hospedero.
Actualmente, herramientas y conocimientos científicos, han quedado disponibles para evaluar adecuadamente los efectos de los probióticos en la salud humana, así como, su potencial en la prevención y tratamiento de enfermedades.
1.2.
La Flora Intestinal Humana, Fuente de Probióticos.
Aproximadamente, 100 trillones de microorganismos colonizan el tracto gastrointestinal humano. Esa cantidad de microorganismos representa 10 veces más el número total de células en el cuerpo humano. Muchos de estos microorganismos, están localizados en la porción baja del intestino delgado y el colon. El estómago y la porción alta del intestino delgado, contienen ácido gástrico y sales biliares, además de estar en constante movimiento, lo que ocasiona que la flora se mantenga disminuida, alrededor de 103 microorganismos por mililitro.
Antecedentes
Se ha estimado que en la flora intestinal humana existen mas de 500 especies de microorganismos, que pertenecen principalmente a los géneros: Bacteroides, Lactobacillus, Clostridium, Fusobacterium, Bifidobacterium, Eubacterium, Escherichia y Veillonella (Isolauri et. al., 2002; Robinson et. al., 2000 y Rolfe, 2000).
La flora intestinal humana, actúa como una barrera para proteger al hospedero contra enfermedades. La interrelación entre la flora intestinal y el huésped se lleva a cabo mediante procesos simbióticos y antagonistas. Un desequilibrio en la flora intestinal, puede incrementar la susceptibilidad a enfermedades infecciosas, inmunoinflamatorias, entre otras (Rolfe, 2000).
Antes del nacimiento, el intestino humano es estéril. La colonización microbiana inicia inmediatamente después del nacimiento. La flora intestinal y vaginal materna, constituyen una fuente de colonización bacteriana para el recién nacido. La colonización microbiana también esta determinada, por el contacto del recién nacido con el medio ambiente (Robinson et. al., 2000 y Rolfe, 2000).
La alimentación, ejerce efectos en la composición y actividad de la microflora del intestino. En infantes alimentados con leche materna, predomina el género Bifidobacterium, mientras que infantes alimentados con leche de fórmula, presentan una composición bacteriana similar a los adultos, predominando los géneros: Enterobacterium, Lactobacillus, Bacteroides, Clostridium, Bifidobacterium y Streptococcus. En adultos sanos, la composición de la flora intestinal se mantiene casi invariable durante la vida.
Los géneros Bifidobacterium, Lactobacillus y Streptococcus, son microorganismos considerados como probióticos en humanos, su origen es el tracto gastrointestinal humano.
1.3.
Microorganismos Probióticos
Actualmente, los probióticos más estudiados son las Bacterias Ácido Lácticas (BAL), particularmente,
Antecedentes
Debido a esta capacidad, las BAL se han utilizado ampliamente en la producción de leche y otros productos lácteos fermentados. Se reconocen en todo el mundo más de 20 especies diferentes de microorganismos probióticos en humanos (Torres, 2002) (Tabla 1).
Tabla 1. Especies de microorganismos usados como probióticos en humanos Microorganismos usados como probióticos en humanos
Lactobacillus acidophilus Lactobacillus plantarum Lactobacillus casei
Lactobacillus casei spp. rhamosus Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus Lactobacillus fermentum
Lactobacillus reuteri Saccharomyces boulardii Lactococcus lactis spp. lactis
Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium infantis Bifidobacterium adolescentes Bifidobacterium longum Bifidobacterium breve
Streptococcus salivarius spp. thermophilus Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Lactococcus lactis spp. cremoris
Fuente: Torres, 2002.
En general, las BAL, se caracterizan por producir importantes cantidades de ácido láctico; son bacterias gram positivas, inmóviles, no forman esporas, oxidasa negativo, catalasa negativo, generalmente nitrato reductasa negativo y anaerobias facultativas. Requieren una mezcla compleja de aminoácidos y factores de crecimiento., especialmente Vitaminas del complejo B (Leveau y Bouix, 2000).
Antecedentes
[image:8.595.208.432.217.431.2]Los microorganismos que siguen la vía heterofermentativa, degradan la lactosa por la ruta de Warburrg Dickens o pentosa fosfato. Los principales productos del metabolismo son ácido láctico, etanol y otros ácidos orgánicos de cadena corta como ácido acético, propiónico y succínico. Esta vía heterofermentativa es utilizada por el género Bifidobacterium (Walstra et. al., 2001; Leveau y Bouix, 2000 y Law, 1997).
Figura 1. Rutas metabólicas utilizadas por las Bacterias Ácido Lácticas para la degradación de la lactosa.
En la tabla 2, se presentan las características diferenciales entre géneros considerados como probióticos empleados para consumo humano. Se puede observar la morfología celular, temperatura óptima de crecimiento, tipo de respiración, ruta metabólica para degradación de lactosa y los productos del metabolismo de la lactosa.
Tabla 2. Características diferenciales entre géneros considerados como probióticos en humanos.
Fuente: (Walstra et. al., 2001; Leveau y Bouix, 2000 y Law, 1997).
Característica
Microorganismo probiótico
Morfología celular Temperatura de
crecimiento Tipo de respiración Ruta metabólica
Producto del metabolismo de
carbohidratos
Bifidobacterium spp. Bacilos bifurcados Termófilos 35 – 45 ºC
Anaerobio Ruta de Warburrg Dickens ó pentosa fosfato
Ácido láctico, acético, propiónico, succínico, etanol.
Lactobacillus spp. Bacilos Termófilos
35 – 45 ºC
Anaerobio Ruta de Embden-Meyerhof-Parnas ó hexosas difosfato
Ácido láctico
Lactococcus spp. Células en forma ovoide en pares o cadenas
Mesófilos 20 – 30 ºC
Anaerobio facultativos Ruta de Embden-Meyerhof-Parnas ó hexosas difosfato
Ácido láctico
Streptococcus spp. Cocos en cadena Termófilos 35 – 45 ºC
Anaerobio Ruta de Embden-Meyerhof-Parnas ó hexosas difosfato
Antecedentes
1.4.
Criterios para la Selección de un Microorganismo Probiótico
En la actualidad existen o se utilizan criterios de selección muy estrictos para obtener cepas funcionales de probióticos. Los criterios de selección de los microorganismos probióticos utilizados en humanos, son los siguientes (Robinson et. al., 2000):
• Las cepas deberán ser de origen humano. • Cepas no patogénicas.
• Cepas no toxigénicas.
• Estabilidad de las cepas en ácido gástrico y bilis.
• Antagonismo contra bacterias patógenas y carcinogénicas. • Producción de sustancias antibacteriales.
• Capacidad de adherirse a células intestinales humanas. • Capacidad de colonizar en tracto intestinal humano. • Excelente crecimiento in vitro.
• Cepas seguras para su uso clínico y en alimentos.
1.5.
Dosis Efectiva de Microorganismo Probióticos.
Se han realizados estudios para establecer la dosis mínima efectiva de los probióticos, para que ejerzan beneficios fisiológicos en el hospedero. Se ha establecido que el consumo de una dosis diaria de 1 x 108-10 bacterias viables/mL, es necesario para que ejerzan adecuadamente su función. Actualmente, se recomienda que los microorganismos probióticos vayan estabilizados en la matriz del alimento o encapsulados, como en el caso del producto comercial Yoplus de la marca comercial Yoplait®, con la finalidad de aumentar su sobrevivencia al paso por el tracto gastrointestinal (Reid et. al., 2003).
1.6.
Efectos Benéficos de los Microorganismos Probióticos.
Los efectos benéficos que un determinado microorganismo probiótico puede conferir al huésped, se resumen a continuación (Torres, 2002):
• Mejoramiento a la resistencia contra patógenos. • Estimulación del sistema inmunológico.
Antecedentes
• Mantener en equilibrio la flora intestinal y urogenital. • Prevención y reducción de la diarrea.
• Reducción de los niveles de enzimas fecales relacionadas con el cáncer. • Reducción del síndrome de colon irritable.
• Reducción del colesterol sérico.
Innumerables estudios e investigaciones se han realizado con la finalidad de comprobar los efectos benéficos que proporcionan los microorganismos probióticos.
Artículos prometedores presentan la evidencia de la modulación inmunológica en el hombre, después de la ingesta de probióticos. Diversos grupos científicos, coinciden en que el consumo de productos lácteos fermentados con bacterias probióticas, principalmente Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus, aumenta la actividad inmune fagocítica no específica de granulocitos circulantes en sangre periférica, lo que ocasiona un aumento en la concentración de inmunoglobulina IgA sérica (Yan, 2002; Roberfroid, 2000; Rolfe, 2000 y Roos y Katan, 1999).
La intolerancia a la lactosa es un problema que afecta a más del 70% de la población mundial. Los pacientes que presentan este problema, tienen baja cantidad de β-galactosidasa, enzima que permite la digestión de lactosa (Roberfroid, 2000). Montes et. al. (1995), demostraron que la ingesta de productos lácteos fermentados con bacterias probióticas, disminuían los síntomas de la intolerancia a la lactosa.
La diarrea es causa de muerte y enfermedad, principalmente en niños. En México, la diarrea ocupa el primer lugar como causa de mortalidad en niños en edad preescolar. Un estudio realizado en niños hospitalizados, que presentaban diarrea causada por rotavirus, demostró que, los niños que consumieron un producto lácteo fermentado con probióticos, presentaron un aumento en la concentración sérica de anticuerpos IgA contra rotavirus, además de disminuir el tiempo de duración del período de la diarrea de 3.5 a 2.5 días, en comparación con los niños que consumieron un placebo (Roos y Katan, 1999; Donnet – Hughes et. al., 1998).
Antecedentes
Los efectos benéficos de los probióticos en la reducción de colesterol sérico, aún causa controversia. Xiao
et. al. (2003) demostraron la reducción de colesterol sérico en adultos sanos. A dos grupos se les administraron productos lácteos fermentados. Al grupo uno, se les administró un producto lácteo fermentado con bacterias del yogurt y al grupo dos, se les administró un producto lácteo fermentado con
B. longum. Al grupo que recibió el producto lácteo fermentado con bífidobacterias, presentaron reducciones marcadas en los niveles séricos de colesterol, en comparación con el grupo dos, quienes mantuvieron invariables los niveles de colesterol sérico (Anderson y Guilliland, 1999).
1.7.
Mecanismos de Acción de Microorganismos Probióticos.
Los mecanismo de acción por los cuales los microorganismos probióticos protegen al hospedero de desordenes intestinales, son cambios que producen las bacterias probióticas en el sitio de colonización. Los mecanismos pueden ser (Rolfe, 2000 y Torres, 2002):
• Producción de sustancias antimicrobiana. Las bacterias probióticas producen una gran variedad de sustancias antimicrobianas, que tienen la capacidad de inhibir el crecimiento tanto de bacterias gram positivas como gram negativas. Estas sustancias inhibitorias incluyen ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno y bacteriocinas.
• Competencia por receptores de adhesión. Las bacterias probióticas mantienen una inhibición competitiva con bacterias patógenas, por sitios de adhesión a células epiteliales del intestino humano.
• Competencia por nutrientes. La competencia por nutrientes se ha propuesto como mecanismo de acción de probióticos. Los probióticos pueden consumir los nutrientes utilizados por bacterianas patógenas.
Antecedentes
1.8.
Vehículos Utilizados para Consumo Humano de Probióticos.
Las bacterias probióticas han atraído un gran interés tanto en el ámbito científico como en el comercial. Los productos lácteos fermentados han sido el principal vehículo utilizado para el consumo humano de probióticos (Torres, 2002). Actualmente, se comercializan productos probióticos, utilizando diferentes vehículos como: cápsulas, polvos, leche en polvo para lactantes adicionadas con probióticos, quesos, helados, preparaciones grado farmacéutico, entre otros (Roos y Katan, 1999 y Law, 1997).
1.9.
Productos Probióticos.
Como ya se había mencionado, los productos lácteos fermentados han sido utilizados tradicionalmente como vehículo para el consumo de bacterias con características probióticas en humanos.
A partir de la década pasada, hubo un marcado incremento de los productos probióticos en el mercado Europeo, América del Norte y muchos otros países. Estos productos contienen principalmente bacterias del género Bifidobacterium spp. y Lactobacillus spp. (Law, 1997) y garantizan cierta cantidad de bacterias viables por mililitro de producto. En la Tabla 3, se presenta los principales productos lácteos fermentados con bacterias probióticas, comercializados en Europa.
Tabla 3. Productos fermentados probióticos comercializados en Europa.
Producto Microorganismos Bacterias viables (ufc/mL) Cultura AB ®, Biomild ®, Diphilus ®
y Lunebest ®
B. bifidum, L. acidophilus 108
Acidophilus bifidus yogurth B. bifidum, B. longum, S. thermophilus,
L. delbrueckii y L. acidophilus. 10
8
Acidophilus milk® L. acidophilus. >108
Bifidus Milk B. bifidum, B. longum, 108 – 109
Bifidus yogurth, Mil-mil E ® o Biobest ®
B. bifidum, B. longum, S. thermophilus, L. delbrueckii
108 – 109
Bifigurth ® B. longum, L. delbrueckii 107
Biogarde ® o ABT B. bifidum, L. delbrueckii y L. acidophilus.
107 - 108
Ofilus nature ® B. bifidum, S. thermophilus, L. acidophilus.
>108
Progurth ® B. longum, Lac. lactis sub
diacetalylactis, Lac. lactis suc cremoris.
108
Yakult® L. paracasei >108
Antecedentes
En México está iniciándose un importante auge en el consumo de productos fermentados con probióticos. Comparativamente con los productos comercializados en Europa, en el mercado mexicano, existen pocos productos probióticos. Se fabrica industrialmente el Yakult, el yogurt y las leches fermentadas con probióticos. El Yakult, es uno de los productos probióticos más antiguos y con más éxito en nuestro país, contiene Lactobacillus casei shirota, 106 ufc por mililitro de producto.
En la Tabla 4, se presentan los principales productos probióticos comercializados en México. Los productos probióticos Europeos garantizan la cantidad de bacterias viables por mililitro de producto, en comparación con los productos mexicanos, los cuales no garantizan la cantidad de bacterias viables requeridas para considerar a un producto como probiótico, pero si indican en la etiqueta es el género bacteriano y que las bacterias que contiene el producto, están viables. El género más empleado en los productos probióticos mexicanos, es Lactobacillus spp. Solo tres productos emplean el género
Bifidobacterium spp.
Tabla 4. Productos probióticos disponibles en el mercado mexicano.
Nombre del Producto Marca Tipo de Producto Bacteria
Activia Danone® Yogurt Bifidus essencis ®
Actimel Danone ® Bebida fermentada L. casei ®
Bio4 Lala ® Bebida fermentada L. casei ®
LC1 Nestle ® Yogurt L. johnsonii ®
Sofúl Yakult ® Gelatina de yogurt L. casei shirota ®
Vivendi Alpura® Yogurt L.acidophilus, S. thermophilus,
L. delbruecki y Bifidobacterias ® Yakult Yakult ® Bebida fermentada L. casei shirota ®
Yoplus Yoplait® Yogurt Bificapsulas ®
Antecedentes
Otro de los vehículos muy recurrido para el consumo de probióticos en humanos, son los productos farmacéuticos. A nivel mundial se comercializan una gran cantidad de productos probióticos en cápsulas o comprimidos. Las bacterias probióticas más utilizadas son los géneros Bifidobacterium spp. y Lactobacillus spp. En la Tabla 5, se muestran los productos farmacéuticos comercializados en países como Alemania, Estados Unidos, Francia, Japón, Reino Unido, Suiza y Yugoslavia (Law, 1997). En México, se comercializan dos productos farmacéuticos, Sinuberase® y Bioflora®. El producto farmacéutico Sinuberase® contiene >106 UFC de L. acidophilus por comprimido. Bioflora® son comprimidos masticables que garantizan 1 billón (1x109) de Lactobacillus (L. acidophilus, L. rhamanosus y B. longum) por comprimido.
Tabla 5. Productos farmacéuticos probióticos comercializados a nivel mundial
País Producto farmacéutico Microorganismo
Eugalan® y Lactopriv® Bifidobacterium spp. Alemania
Omniflora® B. longum, L. acidophilus, E.coli. Life Start two® B. bifidum
Lactinex® L. acidophilus y L. delbrueckii Estados Unidos
Megadophilus® L. acidophilus
Bifidogene® Bifidobacterium spp. Francia
Synerlac® B. bifidum y L. acidophilus
Japón Bifider® B. bifidum
Reino Unido Enpac® y Laccinilla® L. acidophilus
Infloran Berna® B. bifidum y L. acidophilus Suiza
Ribolac® L. acidophilus
Yugoslavia Liobif® B. bifidum
Fuente: Law, 1997.
1.10.
Bacterias Probióticas Utilizadas en esta Investigación
Antecedentes
1.10.1. Bifidobacterium bifidum
Fue descubierta por Tissier en 1900, a partir de heces de recién nacidos. Su nombre se deriva de las formas con dos ramas en Y o en V que pueden presentar bajo ciertas condiciones de cultivo. Las características mas importantes de esta bacteria son: bacilos gram-positivos, de forma curva o bifurcada, inmóviles, no esporulados, anaerobios estrictos, temperatura óptima de crecimiento de 37 – 41ºC, pH óptimo de crecimiento de 6.6 – 7 (Leveau y Bouix, 2000).
Son bacterias heterofermentativas, degradan la lactosa por la ruta de Warburrg Dickens ó pentosa fosfato hasta ácido acético, láctico, propiónico, succínico, etanol y CO2. Las bífidobacterias utilizan la glucosa por la vía de la fructosa-6-fosfato, es una vía completamente original de degradación de las hexosas. La glucosa se convierte en fructosa-6-fosfato bajo la acción de la hexoquinasa y de la glucosa-6-fosfato isomerasa. La fructosa-6-fosfato se transforma en eritrosa-6-fosfato con la fructosa-6-fosfato cetolasa como catalizador, la reacción prosigue a fosfato. La transformación del gliceraldehído-3-fosfato en piruvato y posteriormente a ácido láctico, se realiza por la Ruta de Embden-Meyerhof-Parnas ó hexosas difosfato. (Walstra et. al., 2001; Leveau y Bouix, 2000; Robinson et. al., 2000 y Law, 1997). En estas condiciones, la fermentación de lactosa sigue esta reacción:
Lactosa + 2H3PO4 + 2ADP ⇒ 2 Ácido láctico + 3 Ácido acético + 2CO2 + 2ATP + 2H2O + 2H
El equilibrio de la fermentación esta desplazado a favor de la producción de ácido acético. B. bifidum
Antecedentes
Figura 2. Reacciones que sufre el ácido pirúvico durante una fermentación heterofermentativa.
Al nacimiento, B. bifidum es uno de los primeros microorganismos que se establecen en el tracto gastrointestinal. En recién nacidos alimentados con leche materna se han encontrado niveles de 1010-1011 bacterias/gr de heces, en contraste con recién nacidos alimentados con leche de fórmula, en los que se ha observado un log10 menos, esto es debido a que la leche materna contiene factores de crecimiento indispensables para el desarrollo de las bífidobacterias. Algunos autores aseguran que este factor de crecimiento es un carbohidrato como la N-acetil-D-glucosamina o una glucoproteína (Robinson et. al., 2000; Badui, 1999).
Las bífidobacterias, tienen la capacidad de sobrevivir el paso por el trato digestivo, gracias a su resistencia a condiciones ácidas, enzimas proteolíticas y sales biliares, e implantarse en el intestino, debido a los ácidos orgánicos que produce, los cuales disminuyen el pH del intestino, permitiendo que bacterias patógenas no resistan medios ácidos y permitan la adhesión de las bífidas a las células del intestino (Robinson et. al., 2000).
Los principales beneficios que confiere B. bifidum al hospedero son (Robinson et. al., 2000): • Estabilización de la flora normal.
• Resistencia a patógenos.
• Mejora de tolerancia a la lactosa.
Glucosa C6H12O6
Ácido acético Ácido succínico + Ácido fórmico HOOCCH2CH2COOH CH3COOH + HCOOH
Ácido pirúvico
CH3COCOOH H2 + CO2
Ácido propiónico
CH3CH2COOH + CO2 Acetaldehído
CH3CHO + CO2
Ácido Láctico CH3CHOHCOOH
Antecedentes
• Prevención y/o tratamiento de diarrea. • Prevención de constipación.
• Disminución de los niveles de colesterol sérico. • Disminución de enzimas procancerígenas. • Inducción de inmunidad mediada por células.
Tabla 6. Características de Bifidobacterium bifidum.
Bacteria
Característica Bifidobacterium bifidum
Origen Tracto intestinal de lactantes
Generalidades Bacilos gram positivos, inmóviles y no esporulados, catalasa negativos, no produce CO2
Morfología Su morfología es muy variable: pequeña y regular, larga con una protuberancia distal, curvada.
Temperatura óptima 37 – 41ºC
pH óptimo 6.6 – 7
Tipo de respiración Anaerobia estricta
Ruta Metabólica Ruta de Warburrg Dickens ó pentosa fosfato Productos de Metabolismo Ácido acético, láctico, propiónico y succínico, etanol y CO2.
Relación ácido acético láctico es de 3:2.
1.10.2. Lactobacillus acidophilus
Fue aislado por Moro en 1900 a partir de heces de infantes alimentados con leche de fórmula. Históricamente, L. acidophilus es la especie del género Lactobacillus, que con mayor frecuencia ha sido clasificada como microorganismo probiótico, gracias a la teoría propuesta por el científico ruso Metchnikoff en 1908, en la que atribuía la extraordinaria longevidad de los pobladores de los Balcanes, al consumo de productos lácteos fermentados tipo yogurt que contenían L. acidophilus, ya que esta especie era capaz de soportar el paso por el tracto digestivo (Robinson et. al., 2000).
Antecedentes
Son bacterias homofermentativas, es decir, degradan la lactosa por la ruta de Embden-Meyerhoff-Parnas o hexosas difosfato, hasta ácido láctico. La glucosa se transforma en fosfatos de hexosa mediante la acción de las enzimas hexoquinasa, fosfohexosa isomerasa y fosfofrutoquinasa. Los fosfatos de hexosa se convierten a gliceraldehído-3-fosfato mediante la acción de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. La conversión de gliceraldehído-3-fosfato a piruvato se realiza principalmente por la acción de la piruvato quinasa. Una molécula de lactosa, rinde dos moléculas de glucosa. A partir de una molécula de hexosa, se forman dos moléculas de gliceraldehído-3-fosfato. En estas condiciones, la fermentación de la lactosa sigue esta reacción (Walstra et. al., 2001; Robinson et. al., 2000 y Law, 1997):
Lactosa + 4H3PO4 + 4ADP ⇒ 4Ácido láctico + 4ATP + 4H2O + 2(2H)
A parte del ácido láctico, L. acidophilus produce otras sustancias antimicrobianas como: peróxido de hidrógeno y una variedad de bacteriocinas (Lactacina B, acidocina A, acidocina B y acidophilucina A). En algunos estudios, la bacteriocina acidocina B, mostró actividad contra Listeria monocytogenes, Clostridium sporogenes y Bronchothrix thermosphacta pero no contra otros lactobacilos (Walstra et. al., 2001; Leveau y Bouix, 2000; Robinson et. al., 2000).
L. acidophilus se establece en el tracto intestinal del infante en los primeros meses posteriores al nacimiento y persiste en los adultos. En niños alimentados con leche de fórmula, se han encontrado una cantidad de 106 - 108 bacterias/gr de heces (Robinson et. al., 2000).
Los principales beneficios que confiere L. acidophilus al hospedero son (Robinson et. al., 2000): • Estabilización de la flora normal.
• Resistencia a patógenos.
• Mejora de tolerancia a la lactosa. • Prevención de diarrea.
Antecedentes
Tabla 7. Características de Lactobacillusacidophilus.
Bacteria
Característica Lactobacillus acidophilus Origen Tracto intestinal de lactantes
Generalidades Bacilo gram positivo, no esporulado, catalasa negativo, ácido tolerante.
Morfología Células en forma de bastoncillos, a menudo agrupadas en cadenas.
Temperatura óptima 37- 45 ºC
pH óptimo 5.4 – 5.8
Tipo de respiración Anaerobios facultativos
Ruta Metabólica Ruta de Embden-Meyerhoff-Parnas o hexosas difosfato. Productos de Metabolismo Ácido láctico
1.11.
Importancia de la Leche de Cabra y sus Subproductos como Sustrato para las
Bacterias Probióticas.
La leche es el líquido segregado por las hembras de los mamíferos a través de las glándulas mamarias, cuya finalidad es alimentar a su cría durante un determinado tiempo. Su importancia se basa en su valor nutritivo, ya que sus componentes se encuentran en la forma y proporciones adecuadas, de tal manera que la leche representa el alimento más balanceado y propio para sus correspondientes crías. La leche esta compuesta por agua, grasa, proteínas, azucares, vitaminas y minerales (Badui, 1999).
En general, la designación comercial de leche, se refiere al producto procedente de la vaca; la leche derivada de otras especies va siempre seguida con la consignación de la hembra productora: “Leche de cabra”, “Leche de oveja”, etc. En la tabla 8, se muestran la composición promedio de la leche de diversos mamíferos.
Tabla 8. Porcentaje promedio de la composición de la leche de diversos mamíferos.
Especie Agua (%) Grasa (%) Proteína (%) Lactosa (%) Minerales (%)
Humana 87.43 3.75 1.63 6.98 0.21
Vaca 87.20 3.70 3.50 4.90 0.70
Cabra 87.00 4.25 3.52 4.27 0.86
Oveja 80.71 7.90 5.23 4.81 0.90
Búfalo 82.76 7.38 3.60 5.48 0.78
Camello 87.61 5.38 2.98 3.26 0.70
Caballo 89.04 1.59 2.69 6.14 0.51
Llama 86.55 3.15 3.90 5.60 0.80
Antecedentes
La leche de vaca, es ampliamente conocida y aceptada, sin embargo, la leche de cabra constituye una alternativa a la leche de vaca muy benéfica en ciertos aspectos de la alimentación humana. A diferencia de la leche de vaca, la de cabra tiene mayor cantidad de grasa y menos lactosa.
La grasa de la leche de cabra se compone de ácidos grasos de cadena corta como el butírico, cáprico, caprílico y capróico (responsables del aroma característico de la leche de cabra); estos ácidos de cadena corta producen glóbulos de grasa pequeños (comparados con los de la leche de vaca), los cuales no requieren sales biliares para su digestión y absorción, esto beneficia al consumidor ya que se metabolizan rápidamente, produciendo energía de forma inmediata, evitando que se acumulen y aumenten los niveles de colesterol.
La proteína de cabra es más fina y delicada. La proporción de caseínas-proteínas del suero es diferente entre la leche de cabra y vaca. En la leche de vaca es de 80:20 y en la leche de cabra es de 75:25, esto afecta el rendimiento quesero durante su fabricación, lo que se refleja en costos elevados del queso de cabra en el mercado.
En cuanto a la lactosa, la leche de cabra contiene 0.6% menos que la leche de vaca, esta diferencia es mínima en cuanto a aporte nutricional, sin embargo este porcentaje puede favorecer su consumo por personas intolerantes a la lactosa (Scholz, 1997).
A partir de leche fresca de cabra se elaboran diversos productos (derivados) ampliamente aceptados en la mayoría de la población. Algunos de los derivados lácteos de cabra son: quesos, cajeta, helados, yogurt, mantequilla, leches en polvo, dulces de leche, entre otros. Durante la elaboración de los derivados lácteos de cabra, se obtienen subproductos lácteos, como el suero de leche de cabra, suero de mantequilla, entre otros (Badui, 1999).
Antecedentes
1.11.1. Problemática de la Caprinocultura en Nuevo León.
Las cabras son una explotación tradicional en el campo mexicano, la cabra se puede adaptar a terrenos áridos y semiáridos, pudiendo aprovechar una enorme variedad de arbustos, matorrales, hierbas y zacates, que otros tipos de ganado no pueden utilizar. En el estado de Nuevo León las zonas áridas abarcan 17,377 km2, representando el 29% de la superficie total del Estado. El 82% de las zonas áridas se dedican al subsector pecuario, el 8% al subsector agrícola, el 6% la forman bosques y el 4% son áreas improductivas. La vegetación que predomina en estas áreas es la palma, el maguey, el nopal, la lechuguilla, la candelilla, la jojóba, el mezquite y las especies animales que se explotan son primordialmente la especie caprina, seguida por la porcina y bovina en grado de subsistencia (Cervantes, 2002).
Los caprinocultores del Estado son en su mayoría ejidatarios, con una condición económica familiar muy precaria y en su mayor parte no están afiliados a ninguna asociación u organización; Al ser productores independientes no tienen la oportunidad de eficientizar su sistema de producción por la nula gestión para adquisición de insumos y venta de sus productos. Los caprinocultores se dedican preferentemente a la explotación con doble propósito con venta de leche y cabrito. La problemática de la caprinocultura radica principalmente en (Cervantes, 2002):
• Organización.La nula organización y la participación concurrente de factores detrimentales como la mínima alfabetización de los productores, la falta de asistencia técnica o capacitación y los deficientes canales de comercialización.
• Sanidad. Aun con campañas de aplicación de vacunas, la problemática persiste debido a la compleja concurrencia de factores como la comercialización del ganado, las deficientes prácticas de manejo y la nula presencia de instalaciones para el ganado, que promueven que la infección permanezca y se transmita continuamente entre los animales y hacia los humanos, principalmente por la ingestión de queso fresco procedente de leche sin pasteurizar.
Antecedentes
A partir de datos obtenidos en un estudio sobre la recolección de información e identificación de cadenas productivas prioritarias, en el estado de Nuevo León; se dio a conocer que las cadenas productivas de caprinos resultó ser una cadena de alta prioridad estratégica, expresando alta importancia socioeconómica y de competitividad, tanto para el sistema agroalimentario (matriz primaria), como para el sistema agroindustrial (matriz secundaria) (Poledo et al. 2002).
La producción nacional de leche de cabra en el 2003 fue de 150.3 millones de litros. Mientras que Nuevo León, contribuyo hacia el 2001, con una producción de 5.6 millones de litros, con un crecimiento de 1995 al 2001, de un 150.85% (Tabla 9) (SAGARPA, 2004).
Si bien, el volumen de producción de la leche de cabra en el estado de Nuevo León ha aumentado en los últimos años, su aprovechamiento para el procesamiento y comercialización todavía no esta muy difundido. Este producto es muy importante para la economía estatal, ya que su producción impacta el Producto Interno Bruto (PIB) (Poledo et al., 2002).
En conclusión, debido al incremento en la producción de leche de cabra en el estado y su respectiva repercusión económica, se plantea incorporar alternativas para el consumo de leche de cabra, sus derivados y subproductos, elaborando productos lácteos fermentados con probióticos. En esta investigación se propone utilizar el suero de leche de cabra como sustrato para el desarrollo de un producto fermentado probiótico con Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus.
Tabla 9. Producción anual de leche de cabra a nivel nacional y en el Estado de Nuevo León.
Año
Producción Nacional de leche de cabra (millones de litros)
Producción de leche de cabra en el estado de Nuevo
León (millones de litros)
1995 139.1 2.0
1996 122.9 0.6
1997 120.5 3.7 1998 127.7 5.0 1999 131.0 5.5 2000 131.2 5.5 2001 139.9 5.6 2002 146.5 N.R. 2003 150.3 N.R. Fuente: Sistema de información y estadística agroalimentaria y pesquera (SIAP), Sagarpa 2004.
Antecedentes
1.12.
Suero de Leche de Cabra
El suero de leche de cabra, es el líquido resultante de la coagulación de la leche de cabra durante la elaboración del queso. Se obtiene tras la separación del coágulo (compuesto principalmente por caseínas y grasa). Contiene la mayor parte de los compuestos hidrosolubles de la leche como, proteínas del suero (lactoalbúmina y lactoglobulina), lactosa, minerales y vitaminas. (García Garibay et. al., 2002; Badui; 1999).
Debido a que no se encontró información reportada sobre características, producción nacional o estatal de derivados y subproducto lácteos de cabra, la información y análisis que se presentan están enfocados a los derivados y subproducto de leche de vaca.
Durante la elaboración de queso se producen 9 litros de suero de leche por kilogramos de queso, partiendo de 10 litros de leche (García Garibay et. al., 2002; Badui; 1999). El suero de leche o lactosuero, se divide en tres tipos, según su acidez (Badui, 1999; Madrid, 1990):
• Suero dulce, con pH mayor a 5.8
• Suero medio ácido con pH entre 5.8 a 5.0 • Suero ácido con pH menor a 5.0
En México, el suero de leche que se produce es principalmente dulce y medio ácido (García Garibay et. al., 2002).
El suero de leche es uno de los materiales más contaminantes que existen en la industria alimentaria. Cada 1,000 litros de lactosuero generan cerca de 35 kg de demanda biológica de oxígeno (DBO) y cerca de 68 kg de demanda química de oxígeno (DQO). Esta fuerza contaminante es equivalente a la de las aguas negras producidas en un día por 450 personas (Inda, 2000).
Antecedentes
Los mismos 1,000 litros de lactosuero a los que nos referimos arriba contienen más de 9 kg de proteína de alto valor biológico, 50 kg de lactosa y 3 kg de grasa de leche. Esto es equivalente a los requerimientos diarios de proteína de cerca de 130 personas y a los requerimientos diarios de energía de más de 100 personas (Inda, 2000).
No existen estadísticas que den a conocer la producción nacional de lactosuero, pero se podría estimar, ya que sabemos que la producción de suero de leche durante la elaboración de queso, corresponde al 90% del volumen de la misma que entra al proceso. La producción de queso fresco en México durante el 2001 fue de 140,000 toneladas, por lo tanto, la producción de suero se estimaría en 1,260,000 toneladas en el 2001 (Castro, 2003). En México se estima que alrededor del 10% de la producción de suero se utiliza en alguna tecnología que permita la transformación de los componentes de este, en productos de mayor valor agregado (García Garibay et. al., 2002).
Por lo tanto, es importante que la industria quesera, cuente con diferentes opciones para emplear el suero de leche como base de alimentos, preferentemente para el consumo humano, con el fin adicional de no contaminar el medio ambiente y de recuperar, el valor monetario del lactosuero.
1.12.1 Composición del Suero de Leche de Cabra
La composición del suero de leche varia dependiendo de la leche y tipo de queso de que provenga. En general, el suero de leche esta compuesto por: agua, lactosa, proteínas, grasa y sales minerales (Madrid, 1990; Badui, 1999). En la literatura con la que se contaba no se encontraron reportes sobre la composición del suero de leche de cabra, pero si del suero de leche de vaca. En la tabla 10, se presenta la composición del suero de leche de vaca. Entre los compuestos que constituyen el lactosuero, sobresalen las proteínas solubles y la lactosa, ya que tanto la grasa como las caseínas de la leche, se separan al cuajarse la leche durante la elaboración del queso.
Tabla 10. Composición del suero de leche de vaca.
Componente Suero de leche de vaca
Humedad (%) 93 – 94
Proteínas (%) 0.8 – 1.0
Grasa (%) 0.2 – 0.7
Lactosa (%) 4.5 – 5.0
Antecedentes
[image:25.595.183.443.229.300.2]La lactosa es el principal carbohidrato de la leche, en donde se encuentra en dispersión molecular. Es un disacárido, integrado por la condensación de una molécula de galactosa y otra de glucosa mediante un enlace glucosídico β (1,4) (Badui, 1999; Keating, 1986) (Figura 3).
Figura 3. Estructura química de la lactosa
Molécula de β-D-galactosa unida a una molécula de β-D-glucosa mediante un enlace glucosídico β (1,4) para formar la molécula de lactosa.
La lactosa, es fermentada por BAL produciendo ácido láctico principalmente. Por lo tanto, la lactosa, es el sustrato necesario para el desarrollo de BAL, ya que toman este disacárido como fuente de carbono (Badui, 1999; Keating, 1986).
Las proteínas séricas de la leche son las α-lactoalbúmina, β-lactoalbúmina y lactoglobulínas. Sus características principales son: proteínas compactas, globulares, con un peso molecular que varía entre 14,000-1,000,000 daltons, son solubles en un intervalo de pH muy amplio y muy sensibles a altas temperaturas (>70ºC) (Badui, 1999; Keating, 1986).
En la leche de cabra estas proteínas séricas, se encuentran en mayor proporción que en leche de vaca. En la leche de vaca la relación de caseínas y proteínas séricas, es de 80:20, mientras que en la leche de cabra, la relación es de 75:25 (Scholz, 1997).
Antecedentes
1.12.2. Usos del Lactosuero.
El suero tiene un alto valor nutritivo, por lo que a nivel mundial se han realizado considerables esfuerzos dirigidos a su aprovechamiento, tanto a nivel de investigación tecnológica como a políticas gubernamentales que alienten o presionen a los industriales a hacer uso de este subproducto evitando que sea vertido en mantos acuíferos donde resulta altamente perjudicial.
En México, no existen cifras respecto a la utilización del suero, pero algunos cálculos estiman que es alrededor del 10%, respecto al total obtenido en la industria.
[image:26.595.155.439.403.552.2]A nivel mundial, existe una gran variedad de tecnologías para la utilización del suero de leche, sin embargo, recientemente la biotecnología ha abierto alternativas interesantes para ello, fundamentalmente porque permite la transformación de la lactosa, sólido más abundante en el suero, en productos de mayor valor agregado (Tabla 11).
Tabla 11. Usos del lactosuero.
Usos del lactosuero
1) Productos tradicionalmente obtenidos a partir de suero. 2) El suero como medio de cultivo
3) Propagación de inóculo en las queserías 4) Producción de ácidos orgánicos 5) Producción de alcohol 6) Bebidas fermentadas 7) Producción de enzimas 8) Jarabes de suero.
9) Producción de biopelículas a partir proteínas del suero. 10) Producción de probióticos y bacteriocinas.
Estas alternativas se discuten a continuación (Pastrana et. al., 2004; Balagtas et. al., 2003; García Garibay
et. al., 2002; Madrid, 1990):
1) Productos tradicionalmente obtenidos a partir de suero. Los productos que tradicionalmente se han obtenido a partir del lactosuero, han sido:
• Suero en polvo, a base de concentrar los sólidos por evaporación y secado.
Antecedentes
• Lactosa, obtenida por concentración, cristalización y separación. • Concentrados protéicos, obtenidos por ultrafiltración del suero.
Estos productos se utilizan principalmente en confitería, alimentos infantiles, concentrados de proteína, productos farmacéuticos, entre otros; en donde contribuyen al sabor, color, olor, textura, valor nutritivo y costos de producción.
2) Suero como medio de cultivo. Es un excelente medio de cultivo, es por que se utiliza como sustrato para la obtención de un buen número de productos obtenidos a través de fermentación. Al ser la lactosa, la principal fuente de carbono, parecería que solamente puede emplearse microorganismos capaces de utilizar este disacárido; pero también se puede hidrolizar la lactosa en sus componentes galactosa y glucosa, o mediante una hidrólisis ácida, de esta manera las perspectivas son infinitas.
3) Propagación de inóculo en las queserías. Es práctica común en las cremerías e industrias afines, utilizar suero para la conservación y propagación de cultivos de BAL pertenecientes a los géneros Lactococcus spp., Lactobacillus spp., Streptococcus spp. y Leuconostoc spp. El suero también se utiliza como base para medios inhibidores de fagos, los cuales contienen sistemas amortiguadores del pH y compuestos que ligan calcio para evitar la infección por los bacteriófagos a las BAL.
4) Producción de ácidos orgánicos. Un uso industrial importante e implementado hace años, es la obtención de ácido láctico a partir de suero a través de una fermentación con BAL. Las especies más importantes para esta fermentación son Lactobacillus delbrueckii ss. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii ss. delbrueckii y Lactobacillus helveticus. Normalmente entre 85-90% de la lactosa, es convertida a ácido láctico en 24 hrs. También se obtienen, ácido acético y propiónico, pero con rendimientos bajos.
Antecedentes
La principal limitante de este proceso es la baja concentración de etanol que se obtiene por la intolerancia de algunas cepas y la baja concentración de lactosa, genera como máximo entre 2-3% de etanol al final de la fermentación.
6) Bebidas fermentadas. Cabe la posibilidad de obtener bebidas alcohólicas a partir del suero, principalmente cerveza y vino. Otras bebidas fermentadas con bacterias lácticas o mezclas de estas con levaduras han sido desarrolladas en varios países, las cuales generalmente se mezclan con jugos de frutas u otros saborizantes. Una compañía finlandesa llamada Valio, puso en el mercado una bebida con el nombre de “Gefilus” elaborada con suero, lactosa hidrolizada y fermentada con una bacteria denominada “Lactobacillus GG”, la cual tiene propiedades probióticas.
7) Producción de enzimas. Varias enzimas microbianas pueden obtenerse al utilizar el suero como sustrato. La más importante de todas, es la β-galactosidasa, cuya producción es un proceso altamente rentable para el aprovechamiento del mismo. También ha sido estudiada la posibilidad de producir enzimas pectinolíticas de los hongos Sclerotinia sclerotiorum y Aspergillus awamori
utilizando suero como sustrato.
8) Jarabes de suero. Cuando se hidroliza la lactosa del suero y el hidrolizado se concentra en 60% a 70% de sólidos, se obtiene lo que se conoce como jarabe de suero o jarabes dulces de suero. Estos han adquirido una gran importancia comercial en la última década, y en virtud de que tienen un poder edulcorante considerable pueden utilizarse como sustitutos parciales de sólidos de leche y azúcar en helados, confitería, productos lácteos endulzados, aderezos, productos de panadería, yogurt y bebidas refrescantes de alto valor nutritivo, donde además las proteínas del suero pueden sustituir parcialmente a las proteínas del huevo que se utilizan en algunos de estos alimentos.
9) Producción de biopelículas a partir proteínas del suero. Las nuevas aplicaciones de los aislados y concentrados de proteínas del lactosuero, es la producción de biopelículas y coberturas en superficies de objetos. Actualmente, se exploran varias aplicaciones:
Antecedentes
• Capas que proporcionen brillo a productos de panificación. Se propone utilizar estas biopelículas en productos de panificación a base de chocolate.
• Capas protectoras contra la permeabilidad al oxigeno en plásticos. Muchos plásticos son buenas barreras contra la humedad pero, no contra el oxígeno. Los plásticos son revestidos con estas biopelículas, con la finalidad de obtener una buena barrera contra el oxígeno.
• Capas protectoras contra la permeabilidad al oxígeno en alimentos. Se propone recubrir los alimentos con estas biopelículas, con la finalidad de evitar la oxidación del producto y prolongar su vida útil. Estas biopelículas se podrían ingerir junto con el alimento y de esta manera eliminar el uso de plásticos sintéticos para estas aplicaciones.
• Capas protectoras contra la humedad en alimentos. Estas biopelículas pueden ser usadas para prevenir la transferencia de humedad de un componente a otro, prevenir condensación de la humedad, reacciones químicas indeseables y crecimiento microbiano, de esta manera extender la vida útil del producto.
• Capas antimicrobianas en queso. Las biopelículas también pueden ser usadas para recubrir los quesos y retener los compuestos antimicrobianos en la superficie, esto podría reducir la cantidad de compuestos antimicrobianos usados.
10) Producción de probióticos y bacteriocinas. Los microorganismos probióticos, producen bacteriocinas, familia de péptidos extracelulares con actividad bacteriostática o bactericida. En estudios recientes, Pastrana et al. (2004), demostró con bastante éxito, que el suero de leche podría utilizarse para producir probióticos y adicionalmente bacteriocinas.
1.13.
Fermentaciones Ácido Lácticas.
Una fermentación ácido láctica se define como una oxidación parcial de los átomos de carbono de un azúcar, acoplada a la reducción de un compuesto orgánico generado, ácido láctico principalmente, a partir del catabolismo del sustrato inicial por las enzimas de un microorganismo (Quintero, 1981).
Antecedentes
Los microorganismos involucrados pueden provenir de cultivos mixtos o puros. Un cultivo mixto, está constituido por una mezcla indefinida de cepas de distintos tipos de bacterias. La composición de estos cultivos se basa en un equilibrio dinámico entre las diferentes bacterias del cultivo. Un cultivo puro, está constituido por una única cepa (Walstra et. al., 2001).
La transformación bioquímica de los componentes de la leche de cabra, sus derivados y subproductos, por las BAL produce importantes cambios en los productos fermentados. Estos cambios dependen de las bacterias del cultivo y del tipo de producto elaborado. Las principales consecuencias del desarrollo de las BAL en la leche de cabra y sus subproductos, son (Walstra et. al., 2001; Varnam, 1995):
• Producción de ácido a partir de la lactosa. El ácido formado interviene en:
a. La conservación del producto. El ácido producido (especialmente el ácido láctico), en combinación con el bajo pH, es un factor esencial en la vida útil y en la seguridad de todos los productos lácteos fermentados.
b. La textura del producto. El pH modifica considerablemente las propiedades reológicas. c. El sabor del producto.
• Formación de otros compuestos durante la fermentación de la lactosa y el metabolismo del ácido cítrico.
a. Componentes del sabor.
b. Dióxido de carbono.
c. Exapolisacáridos bacterianos.
Las transformaciones que llevan a cabo las BAL, determinan la vida útil, seguridad, consistencia y desarrollo de sabor y textura de los productos lácteos fermentados.
Antecedentes
El éxito de las fermentaciones ácido lácticas depende de las tecnologías de proceso utilizadas, pero es la correcta selección, conservación, manejo, resiembra y propagación de los cultivos iniciadores o también denominados inóculos de trabajo, lo que permite estandarizar y mantener una calidad uniforme del producto final. Los cultivos microbianos se conservan en pequeñas cantidades conocidas como cultivos de reserva. Cuando estos cultivos se reactivan para su utilización en la industria láctea, se recurre a sistemas de resiembra a gran escala con objeto de obtener el volumen necesario de inóculo. Las etapas del proceso de siembra hasta la obtención del inóculo se llevan a cabo a nivel laboratorio, partiendo de un inoculo del 5%, son:
Cultivo Reserva 5% Tubo 5% Matraz 5% Cultivo Madre 5% Inoculo de trabajo
1mL de medio 20mL de medio 100mL de medio 500mL de sustrato 5% de cultivo de cultivo de cultivo a fermentar 10,000mL
(leche) de sustrato a fermentar (leche)
Fermentador nivel laboratorio o industrial
El cultivo madre debe reunir las siguientes características (Tamime y Robinson, 1991): • Contener un máximo de bacterias viables en un volumen mayor al del cultivo de reserva, • Estar libre de contaminantes, como coliformes, mohos o levaduras,
• Debe presentar actividad en las condiciones de procesado, además,
• Estar sembrados en el sustrato de trabajo estéril, en este caso leche, productos o subproductos lácteos,
• Mantener su actividad a bajas temperaturas (refrigeración) esto ayuda reducir o controlar la actividad metabólica de los microorganismos, lo cual es aplicable solamente en periodos de almacenamiento cortos, permitiendo la viabilidad de los cultivos durante una semana.
El inoculo de trabajo, es la fracción del cultivo madre con el cual se siembra el biorreactor, debe reunir las siguientes características para que no exista inhibición por sustrato (Varnam, 1995; Tamime y Robinson, 1991):
• Contener un número de células viables conocido (≥ 107 UFC/mL) • Estar libre de contaminantes
Antecedentes
Un factor clave en las fermentaciones ácido lácticas es la preparación de cultivos activos, es decir, el cultivo madre debe estar constituido por un gran numero de células viables para que al añadirlo al sustrato, el proceso de fermentación comience lo antes posible. Durante el cultivo de los microorganismos, las células se dividen, aumentando el número total hasta cierto nivel y, posteriormente comienzan a morir. Se puede suponer con seguridad que existe una relación directa entre la actividad de los cultivos madre y su edad. Un cultivo activo se encuentra en la curva de crecimiento entre la región superior de la fase logarítmica y el comienzo de la fase estacionaria. Por lo tanto, el tipo más activo de iniciador son los cultivos caracterizados por una fase de latencia breve o inexistente seguida de una tasa de producción de ácido láctico. En términos medios el tamaño de inóculo puede ser de un 3-10% y debe contener más de 107 microorganismos viables por mililitro. Una fase de latencia larga incrementa el tiempo de proceso, lo cual disminuye el atractivo para las grandes industrias (Robinson et. al., 2000; Tamime y Robinson, 1991; Quintero, R.R., 1981).
En el caso particular de fermentaciones ácido lácticas con bacterias probióticas, tanto del género
Bifidobacterium spp. como L. acidophilus, para conseguir que el producto final contenga la concentración mínima terapéutica, se debe cumplir lo siguiente para una fermentación a nivel industrial:
• Tamaño de inóculo del 10-20%
• Mantener el valor final de pH por arriba de 4.6, se puede optar por utilizar soluciones buffer en el producto de fermentación o finalizar la incubación a un pH de 4.9-5.0 (Varnam, 1995).
1.14.
Trabajos Previos
En la literatura con la que se contaba no se encontraron trabajos previos reportados en los que se utilice el suero de leche de cabra como sustrato para la producción de probióticos. Los trabajos encontrados se enfocan al aprovechamiento del suero de leche de vaca, a la producción de probióticos en suero de leche de vaca, producto probiótico en suero de leche de vaca y el trabajo de nuestro grupo de investigación de probióticos en leche de cabra.
¾ Aprovechamiento del suero de leche de vaca.
Antecedentes
Se utilizaron dos tipos de suero de leche, suero de leche obtenido en la elaboración de queso panela y obtenido en la elaboración de queso asadero. Se mezclaron en proporción 0, 25, 75 y 100% suero de leche con leche de cabra. Se elaboraron los dulces de leche con estas mezclas, se determinaron los sólidos totales. Ramírez Saldívar (1994) encontró que, el tipo de suero utilizado en la producción de la pasta de dulce no influye en su rendimiento de elaboración; al incrementar el contenido de suero en la mezcla para la elaboración de la pasta de dulce el rendimiento se redujo y que el uso de una mezcla 25% suero y 75% leche de cabra, independientemente del tipo de suero, es la mezcla más adecuada para la producción de dulce de leche, sin afectar su valor nutritivo y rendimiento.
En el trabajo de González Moreno (1992) se buscaba aprovechar el suero de leche en productos alimenticios. Se desarrollaron algunos productos cuyo ingrediente principal fuera el suero de leche, que fueran nutritivos, de buen sabor y de bajo costo. Los productos que se desarrollaron fueron: bebidas de chocolate, bebida fermentada y helado. Se realizaron evaluaciones sensoriales. Las formulas alimenticias desarrolladas tuvieron una buena aceptación, lo que demostró la gran posibilidad de explotación del suero de leche.
Aunque por varios años se han estado buscando formas de aprovechamiento del suero de leche de vaca, no se ha probado el suero de leche de cabra en diferentes productos como bebidas, helados, dulces, etc. Se ha investigado la factibilidad de producir bebidas fermentadas a base de suero de leche de vaca, pero no se ha probado la obtención de bebidas fermentadas y/o probióticas, a base de suero de leche de cabra.
¾ Producción de probióticos a partir de suero de leche de vaca.
En estudios recientes, Pastrana et al. (2004), demostró con bastante éxito, que el suero de leche de vaca, podría utilizarse como medio de cultivo para producir probióticos y adicionalmente bacteriocinas. Utilizaron suero de leche de vaca concentrado y diluido; y dos bacterias probióticas Lactococcus lactis y
Antecedentes
Aunque la producción de probióticos en suero de leche de cabra, no fue la esperada, si se logro el desarrollo de las cepas empleadas y la producción de las bacteriocinas.
Desde este punto, se tiene un área de oportunidad que se puede aprovechar, ya que no se ha evaluado el desarrollo de microorganismos probióticos en suero de leche de cabra.
¾ Producto probiótico en suero de leche de vaca.
Como ya se había mencionado, existe en el mercado una bebida elaborada con suero llamada “Gefilus” la cual tiene propiedades de probiótico (García Garibay et. al. 2002). En el mercado mexicano no se comercializan actualmente productos probióticos en suero de leche de cabra, desde este punto, se tiene un área de oportunidad que se puede aprovechar.
¾ Trabajo de nuestro grupo de investigación de probióticos en leche de cabra.
Solís, N. (2004), investigo nuevas formas de aprovechamiento de la leche de cabra, desarrollando productos probióticos. Su trabajo consistió en determinar que la leche de cabra es un sustrato favorable para el desarrollo de Bifidobacterium infantis, Lactobacillus delbrueckii y Streptococcus thermophilus bajo condiciones de anaerobiosis utilizando CO2, adicionalmente implementó una técnica mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la identificación de Bifidobacterium infantis.
ii
DEDICATORIA
A Dios por permitirme vivir estos momentos.
A mi madre:
Aún las más bellas palabras que hoy escribiera, nunca podrían traducir mis sentimientos hacia ti. Por el amor y apoyo incondicional que me has dado a cada paso que doy. Por todo lo que hiciste y dejaste de vivir por mí. Todo lo que soy hasta el día de hoy, es por ti.
A Raúl por entender mi profesión, por estar conmigo en los momentos difíciles cuando el trabajo y los estudios me
angustiaban, por mostrarme el mundo que hay afuera de mis cuatro paredes, por amarme.
A mis hermanas, Magaly por ser pilar en mi vida y Judith por venir a dar la mayor alegría a nuestra pequeña familia; las
quiero mucho.
A mi hermana de profesión, Araní Casillas Ramírez, por animarme cada vez que mis alas han querido dejar de aletear,
por estar conmigo en los momentos más difíciles y felices de mi vida, por su amistad incondicional.
A mi tía Marina, por enseñarme indirectamente, que hacer lo que a uno le apasiona te da satisfacciones personales,
superiores a cualquier otra cosa. A mi tía Elida, por su apoyo y comprensión en cada etapa de mi vida. Las quiero
mucho.
A la Dra. Paula Cordero Pérez, por sembrar en mí la semilla de la investigación.
A Verónica Díaz Avilés, por ser mi cómplice en esta aventura, brindarme su amistad incondicional y hacer esta etapa
inolvidable.
A mis amigas, Irma, Gloria y Mine, por su amistad y apoyo. Por esperar y comprenderme cuando no he podido estar con
ustedes. Con todo mi corazón.
A todas mis compañeras de la Maestría, Judith, Ana, Gaby, Irasema, María José, Marisol, Verónica, Yadhira y Citlali, por
iii
ABREVIATURAS
AOAC Association of Official Analytical Chemist ATCC American Type Culture Collection BAL Bacterias Ácido Lácticas CAE Campo Agrícola Experimental CBA Columbia Base Agar
DBO Demanda Biológica de Oxígeno
DEQ Desarrollo de Especialidades Químicas, S.A. de C.V. DIA División de Ingeniería y Arquitectura
DO Densidad óptica
DQO Demanda Química de Oxígeno
FAO Organización de las Naciones Unidad para la Agricultura y la Alimentación
gr Gramo
HA Hipótesis alterna
H0 Hipótesis nula
hrs Horas
IgA Inmunoglobulina A
INEGI Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática ITESM Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey kg kilogramos
km2 kilometros cuadrados
L Litro
ln logaritmo natural
Log10 logaritmo base 10
log logarítmica
min Minutos
mL Mililitro MRS Man Rogose Sharpe
NADH Dinucleotido de nicotinamín adenina nm Nanómetros
NMP Número más probable NOM Norma Oficial Mexicana
No. Número
NR No reportado PIB Producto Interno Bruto rpm Revoluciones por minuto
SAGARPA Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación SIAP Sistema de Información y Estadística Agroalimentaria y Pesquera
SSA Secretaría de Salubridad y Asistencia t Tiempo
td Tiempo de duplicación ufc Unidades formadoras de colonia UV Ultravioleta
α Nivel de significancia
°C Grados Celsius
µ Promedio o media
µL Microlitro
µ Velocidad específica de crecimiento % Porciento
Objetivos
Capitulo 2.- Objetivos
2.1. Objetivo General.
2.1.1. Evaluar la calidad del suero de leche de cabra obtenido de queserías a nivel laboratorio, como sustrato potencial para el desarrollo de Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus, en una fermentación ácido láctica y demostrar que es un producto probiótico.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1. Estandarizar un proceso a nivel laboratorio para obtener suero de leche de cabra, proveniente de la elaboración de un queso fresco.
2.2.2. Caracterizar la composición del suero de leche de cabra como sustrato, en relación a la cantidad de lactosa disponible, grasa y proteínas residuales.
2.2.3. Evaluar si el suero de leche de cabra obtenido de queserías, es un sustrato adecuado para el crecimiento de Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus, mediante la realización de fermentaciones ácido lácticas con ambas bacterias o en fermentaciones con una de ellas separadamente y evaluando las cinéticas de crecimiento de Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus, consumo de lactosa, desarrollo de acidez titulable y pH.
Hipótesis
Hipótesis
Para alcanzar los objetivos anteriores, se plantearon las siguientes hipótesis:
H1 El suero de leche de cabra proveniente de la elaboración de queso fresco, es un adecuado sustrato para la obtención de un producto probiótico con Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus.
H2 En una fermentación mixta utilizando suero de leche de cabra como sustrato y dos bacterias probióticas (Bifidobacterium bifidum y Lactobacillus acidophilus), se obtiene una mayor cantidad de unidades formadoras de colonia de cada bacteria, que en una fermentación simple utilizando suero de leche de cabra como sustrato y una de las dos bacterias probióticas anteriores.
Estrategia Experimental
Capitulo 3.- Estrategia Experimental
Para probar las hipótesis planteadas, se propuso una estrategia experimental basada en la fermentación de suero de leche de cabra con Bifidobacterium bifidum y/o Lactobacillus acidophilus. La estrategia experimental se dividió en 4 etapas:
1. Obtención y caracterización del suero de leche de cabra.
A partir de leche de cabra adquirida en el CAE del ITESM, se elaboró queso fresco, para obtener el suero de leche de cabra. Tanto la leche como el suero, recibieron tratamiento térmico para eliminar posibles riesgos de contaminación microbiana, antes de su empleo en las fermentaciones ácido lácticas. Se caracterizó la composición del suero de leche de cabra como sustrato, en relación a la cantidad de lactosa disponible, grasa y proteínas residuales. En la figura 4, se presenta el diagrama de flujo de la estrategia experimental 1, para la obtención del suero de leche de cabra.
2. Preparación del inóculo de trabajo.
Las bacterias probióticas utilizadas en esta investigación, se adaptaron al suero de leche de cabra para la obtención de los inóculos de trabajo. Previo a esto, se determinaron los parámetros cinéticos (td y µ) de ambas bacterias, tras repiques sucesivos de las mismas en medio MRS. En la figura 5, se presenta el diagrama de flujo de la estrategia experimental 2, para la preparación de los inóculos de trabajo.
3. Fermentaciones de suero de leche de cabra con B. bifidum y/o L. acidophilus.
Estrategia Experimental
4. Caracterización del suero de leche de cabra fermentado por microorganismos probióticos.
Estrategia Experimental
Figura 4. Estrategia Experimental Etapa 1: Obtención y caracterización del suero de leche de cabra.
Recepción de Leche de Cabra CAE del ITESM
Pruebas de plataforma
pH (Método Potenciométrico) Acidez titulable (A.O.A.C. 947.05)
Leche Aceptada
Corte de la cuajada
Variable: Tiempo de coagulación
Leche Rechazada
Esterilización
98ºC ± 1ºC / 4 min.
Coagulación
Variable:
Temperatura de coagulación
Desuerado del coágulo Moldeado del queso Salado Prensado
Análisis Microbiológicos NOM-112-SSA1-1994 Resultados Positivos Leche Rechazada Resultados Negativos Leche Aceptada
Proceso de obtención de queso fresco
Calentamiento
Variable: Temperatura
Recuperación del
Suero de leche de cabra Caracterización del suero de leche de cabra pH Potenciométrico
Acidez 947.05 A.O.A.C. Proteínas 930.29 A.O.A.C. Grasa NOM -F-387-1982 Lactosa 984.15 A.O.A.C. Rendimiento del suero
Pasteurización del suero de leche de cabra 70ºC ± 2ºC / 30 min.
Adición de cuajo microbiano Variable:
Cantidad de cuajo
Envasado
