PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
EFECTO DEL USO DEL SUELO SOBRE COMUNIDADES MICROBIANAS DE
SISTEMAS DE PASTOREO Y CULTIVOS DE CAÑA DE AZUCAR DEL VALLE
DEL CAUCA
JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MAGÍSTER EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
DIRECTOR: ZIV ARBELI, Ph.D.
NOTA DE ADVERTENCIA
"La Universidad no se hace responsable por los conceptos
emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará
porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y porque las tesis no contengan ataques personales
contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justicia".
EFECTO DEL USO DEL SUELO SOBRE COMUNIDADES MICROBIANAS DE
SISTEMAS DE PASTOREO Y CULTIVOS DE CAÑA DE AZUCAR DEL VALLE
DEL CAUCA
JOHAN SEBASTIÁN SÁENZ MEDINA
APROBADO
________________________
Ziv Arbeli, Ph.D
Director
________________________ ______________________
Sandra Baena, Ph.D
Daniel Uribe, Ph.D
Jurado Jurado
__________________________
Wilson Teran, Ph.D
EFECTO DEL USO DEL SUELO SOBRE COMUNIDADES MICROBIANAS DE
SISTEMAS DE PASTOREO Y CULTIVOS DE CAÑA DE AZUCAR DEL VALLE
DEL CAUCA
JOHAN SEBASTIAN SÁENZ MEDINA
APROBADO
__________________________ __________________________
AGRADECIMIENTOS
TABLA DE CONTENIDOS
1. INTRODUCCIÓN ... 1
2. MARCO TEORICO ... 3
2.1. EFECTO DE LOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ADN Y LA PURIFICACIÓN SOBRE LA ESTIMACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS ... 3
2.1.1. Estudios de diversidad microbiana y sesgos de los métodos utilizados ... 3
2.1.2. Sesgos generados por el método de extracción de ADN de suelo ... 4
2.1.3. Uso del gen 16S ARNr para estudios de diversidad microbiana ... 4
2.1.4. Sobrestimación de la diversidad ... 5
2.1.5. Herramientas bioinformáticas ... 6
2.2. EFECTO DEL USO DE SUELO SOBRE LA DIVERSIDAD MICROBIANA EN SUELOS DEL VALLE DEL CAUCA ... 8
2.2.1. Efecto de la actividad agrícola sobre la calidad del suelo ... 8
2.2.2. Sistemas agroecológicos alternativos ... 9
2.2.3. Factores ambientales que afectan las comunidades bacterianas ... 9
2.2.4. Perturbaciones en los procesos ecosistémicos ... 11
2.2.5. Indicadores de la calidad del suelos ... 12
3. OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN ... 14
4. MATERIALES Y MÉTODOS ... 15
4.1. EFECTO DE LOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN, PURIFICACIÓN Y REPRODUCIBILIDAD DE LA PCR EN LA ESTIMACIÓN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA. ... 15
4.1.1. Obtención de las muestras ... 15
4.1.2. Diseño experimental ... 15
4.1.3. Extracción, cuantificación y purificación del ADN metagenómico ... 16
4.1.4. Amplificación y secuenciación de la región V4 del gen 16S ARNr ... 17
4.1.5. Ensamblaje y limpieza de las secuencias ... 18
4.1.6. Análisis de diversidad. ... 18
4.2. EFECTO DEL USO DEL SUELO SOBRE LA DIVERSIDAD MICROBIANA ... 19
4.2.1. Diseño experimental y muestreo de suelo con diferentes usos ... 19
4.2.2. Bosque seco tropical ... 21
4.2.3. Pastura convencional ... 21
4.2.4. Sistema silvopastoril intensivo ... 21
4.2.5. Caña de azúcar ... 22
4.2.6. Manejo de las muestras ... 23
4.2.7. Extracción, cuantificación y amplificación de la región V4 del ADN metagenómico de los diferentes usos de suelo ... 24
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 25
5.1. EFECTO DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL ADN. ... 25
5.1.1. Estandarización del protocolo de extracción ... 25
5.1.2. Concentración y pureza del ADN ... 25
5.1.3. Calidad ensamblaje y filtración de las librerías de la región V4 ... 28
5.1.4. Efecto de la extracción y purificación de ADN y la reproducibilidad de la PCR en la discriminación de comunidades ... 30
5.1.5. Efecto de la extracción y purificación sobre la estimación de la α y β diversidad . 32 5.1.6. Efecto del método de extracción sobre la abundancia de los Fila ... 36
5.2. EFECTO DEL USO DEL SUELO SOBRE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS DE SUELOS DEL VALLE DEL CAUCA. ... 42
5.2.1. Diferencias en las propiedades físico-químicas en los diferentes usos de suelo del Hatico y la Lucerna ... 42
5.2.2. Filtración y asignación de las de las secuencias ... 47
5.2.3. Variación de la alfa diversidad entre los usos de suelo ... 48
5.2.4. Variación de las comunidades microbianas entre los usos de suelo ... 51
5.2.5. Los usos de suelo y la diferencia entre las fincas afectan la abundancia de algunos Fila………. ... 54
5.3. Relación de las variables fisicoquímicas yla estructura de las comunidades microbianas del suelo ... 57
6. CONCLUSIONES ... 61
7. PERSPECTIVAS Y RECOMENDACIONES ... 63
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. . Factores ambientales que influyen sobre la estructura, composición y diversidad de las comunidades bacterianas edáficas en suelos nativos (bosque, pastizal, desierto) y en suelos con actividades agrícolas y agropecuarias (suelos con diferentes manejos)………11
Tabla 2. Indicadores físicos, químicos y biológicos que deben ser incluidos en un set de datos para
evaluar la calidad del suelo (Wienhold et al; 2004)………...13
Tabla 3. Muestras de diferentes usos de suelo recolectadas en el departamento del Valle del
Cauca………..22
Tabla 4. Métodos utilizados en el análisis de propiedades fisicoquímicas llevado a cabo en el
Instituto Geográfico Agustín Codazzi………23
Tabla 5. Concentración y pureza del ADN metagenomico extraído con dos métodos con o sin purificación de las muestras. Las letras representan la formación de grupos con diferencias
significativas (p<0,05)………27
Tabla 6. Índices de Riqueza expresada en número de OTUS únicos y diversidad obtenida de diferentes usos de suelo con dos métodos de extracción de ADN y efecto de la purificación de las muestras. Se muestra el promedio ±1ds. No se encontraron diferencias significativas entre los
valores……….32
Tabla 7. Significancia de las distancias entre las comunidades microbianas recuperadas con dos métodos de extracción de ADN y el efecto de la purificación sobre esta. Las comunidades fueron comparadas mediante pairwise-Unifrac de diferentes usos de suelo, y el valor p se calculó con la prueba no paramétrica de ANOSIM y el Test de Montecarlo (n=999, α=0,05)………34
Tabla 8. Parámetros fisicoquímicos de los usos de suelo muestreados en dos zonas del Valle del Cauca. Los usos de suelo son: bosque, sistema silvopastoril, pastura convencional, caña de azúcar con manejo convencional y agroecológico. Se presenta el promedio ± 1ds………..45
Tabla 9. Valores propios de la influencia de las variables fisicoquímicas evaluadas sobre la
separación de los usos de suelo en las fincas del Hatico y la Lucerna. Se presenta la el porcentaje de la varianza que explica el análisis y se resaltan los valores propios con mayor efecto en la
varianza………...46
Caña de azúcar convencional (CC), Sistemas Silvopastoriles (S) y Pastura convencional
(P)………...49
Tabla 11. Comparación de índices de riqueza y diversidad de cinco usos de suelo. Se muestra el
promedio r1ds………50
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Esquema general del flujo de trabajo de análisis de comunidades microbianas en QIIME. Tomado de Caporaso Et al; 2010 (1)………..7
Figura 2. Esquema general del diseño experimental para evaluar el efecto de los métodos de extracción, purificación y reproducibilidad de la PCR en la estimación de la diversidad
microbiana………..16
Figura 3. Diseño de los primers para la construcción de los amplicones de la región V4 del gen 16S ARNr: adaptadores (rojo), barcodes y zona de hibridación de los primers (Azul), zona de hibridación de los primers de secuenciación (Amarillo), linker (Blanco) y target de la región
conservada V4 (verde)………18
Figura 4. Ubicación geográfica de dos fincas agroecológicas del Valle del Cauca. Dentro de la Lucerna (Buga la grande, A) y en el Hatico (Palmira, B) fueron muestreados sistemas silvopastoriles y cañas de azúcar de manejo ecológico. Los demás sistemas, pasturas convencionales y caña de azúcar de manejo convencional fueron muestreadas en fincas cercanas de ambas zonas. Adicionalmente se muestreo un bosque nativo dentro del Hatico………...20
Figura 5. Tamaño de los amplicones de la región V4 del gen 16S ARNr evaluado mediante gel de agarosa (B) y BioAnalyzer (A)………...29
Figura 6. Distancias de las comunidades microbianas calculadas mediante Pairwise-Unifrac tanto en matrices de ausencia/presencia (A) y abundancia (B) visualizadas en una gráfica de componentes principales (PCoA), la varianza explicada se denota entre corchetes al lado de cada eje…………...31
Figura 7. Curvas de rarefacción de la riqueza de muestras de bosque (A), sistemas silvopastoriles (B) y pasturas convencionales (C) a partir de ADN extraído con diferentes métodos y sin o con purificación de las muestras. Las curvas fueron calculadas a una profundidad de 30.000 secuencias por muestra. Powersoil (Rojo), PowerSoil-purificado (Azul), Griffiths (Verde) y
Griffiths-purificado (Amarillo)………..33
Figura 8. Abundancia relativa de los 13 Fila más abundantes encontrados en tres diferentes usos de suelo con dos diferentes métodos de extracción y el efecto de la purificación de las muestras…37
Figura 9. Análisis de componentes principales (PCoA) de muestras de bosque (A), sistema silvopastoril (B) y pasturas convencionales (C), con dos métodos de extracción de ADN y efecto de la purificación de las muestras basados en las distancias calculadas mediante UniFrac. Los ordenamientos de la izquierda fueron elaborados con matrices de distancia ausencia/presencia (Unweighted) y las de la derecha con matrices de abundancia (Weighted)………...38
Figura 10. Correlación de la abundancia relativa de los Fila, expresada en el porcentaje del número de secuencias, obtenida con diferentes métodos de extracción de ADN y purificación en muestras de bosque (A), sistemas silvopatoriles (B) y pasturas convencionales (C)……….39
Figura 12. Análisis de componentes principales (PCA) relacionando las propiedades fisicoquímicas del suelo y los usos de suelo en el Hatico. Abreviaciones: A: porcentaje de arena, Ar: porcentaje de arcilla, L: porcentaje de limo, CO: carbón orgánico, N: nitrógeno total, Cl: cloro, Ca: calcio, Mg: magnesio, K: potasio, Na: sodio, BT: bases totales, NH4: amonio, NO3: nitrato y P: fosforo...44
Figura 13. Rangos de abundancia-especie donde se presenta la acumulación de secuencias por los OTUS encontrados con una similitud de 97% con la base de datos de greengenes………...49
Figura 14. Distancias de las comunidades microbianas de 5 diferentes usos de suelo calculadas mediante Pairwise-Unifrac basado tanto en matrices de ausencia/presencia (A) y abundancia (B) visualizadas en una gráfica de componentes principales (PCoA), la varianza explicada se denota entre corchetes al lado de cada eje………..52
Figura 15. Boxplot de la comparación por pares de las distancias calculadas mediante Unifrac entre los cinco distintos usos de suelo. Los datos se encuentran organizados de izquierda a derecha
de menor a mayor distancia………54
Figura 16. Comparación por pares de la abundancia de los Fila significativamente diferentes entre el bosque (verde), sistema silvopastoril (azul oscuro), pasturas convencionales (rojo), caña de azúcar de manejo ecológico (azul claro) y caña de azúcar de manejo convencional (amarillo). La significancia se determinó mediante la prueba t-test paramétrica corregida por Benjamin-FDR…..56
Figura 17. Comparación por pares de la abundancia de los Fila significativamente diferentes entre la finca de la Lucerna (morado) y el Hatico (negro)……….57
INDICE DE ANEXOS
ANEXO A. Parámetros fisicoquímicos en los usos de suelo seleccionados para evaluar el efecto de
los métodos de purificación y extracción del ADN. Se presenta el promedio ± 1ds de los dos eventos de muestreo más las diferencias fisicoquímicas evaluadas por Tukey.
ANEXO B. Estandarización de a extracción de ADN metagenómico de suelo del protocolo reportado por Griffiths y colaboradores. Se evaluó 1) 5% CTAB -5% PEG, 2) 5% CTAB -20% PEG, 3) 10% CTAB -5% PEG y 4) 10% CTAB -20% PEG. Se encontraron diferencias significativas en la recuperación de A) ADN (P=0,007) pero no en la B) purificación (p>0,05).
ANEXO C. Representación gráfica de la calidad de las secuencias, de 250 pb, obtenida de 72 librerías secuenciadas en la plataforma Miseq de Illumina para la evaluación del efecto de los métodos. El parámetro de calidad se presenta en un intervalo de 0-40 graficado en el eje Y. Se muestran las secuencias en sentido A) forward, B) reverse y después de ser C) ensambladas.
ANEXO D. Diagrama de flujo y parámetros por defecto para filtrar los datos crudos (secuencias)
en la herramienta bioinformática QIIME.
ANEXO E. Resumen de los resultados del número de secuencias conservado por cada muestra después de filtrarlas por los parámetros de calidad.
ANEXO F. Representación gráfica de la calidad de las secuencias, de 250 pb, obtenidas de 27 librerías secuenciadas en la plataforma Miseq de Illumina para la evaluación del efecto de los usos de suelo. El parámetro de calidad se presenta en un intervalo de 0-40 graficado en el eje Y. Se muestran las secuencias en sentido A) forward, B) reverse.
ANEXO G. Resumen de los resultados del número de secuencias conservado por cada muestra después de filtrarlas por los parámetros de calidad. El número inicial de secuencias era 11.910.693.
ANEXO H. Establecimiento del número mínimo de secuencias que debe contener un OTU para ser considerado OTU único A) Sin filtro, B) 10, C) 30, D) 50 y E) 100. Las comparaciones se realizaron con las secuencias de las muestras de la comunidad artificial (12 OTUS esperados - Rojo), Cepa pura T30B (1 OTU esperado - Naranja) y Cepa pura T30A (1 OTU esperado - Azul).
ANEXO I. Comparación de índices de riqueza y diversidad de cinco usos de suelo muestreados en
RESUMEN
ABSTRACT
1 1. INTRODUCCIÓN
La conversión de bosques en sistemas agronómicos convencionales es una de las principales causas de deterioro del ambiente en Latinoamérica (2). En Colombia, la transformación de áreas naturales con objetivos agropecuarios y el uso inadecuado de los suelos ha generado que el 12,6% (137.340 ha) del área total del país se encuentre degradada (baja calidad del suelo) en un nivel leve (2,78%, 31.669 ha), moderado (5,29%, 60.287 ha) y de manera severa (3,98%, 45.384 ha) (2). La intervención humana conlleva a diferentes procesos de degradación del suelo. Estos procesos son la perdida de materia orgánica, erosión, inundaciones, salinización, deslizamientos, compactación y contaminación (3). Estos procesos se presentan en el manejo agronómico convencional del suelo ya que involucran arado, manual o con maquinaria pesada, y aplicación de agroquímicos, lo que conduce a la degradación física, química y biológica de los suelos, afectando su fertilidad y sostenibilidad a largo plazo, lo que va en contravía de la “Calidad del suelo” y “Salud del suelo” (4–6)(7).
2 El rápido desarrollo de las tecnologías de secuenciación masiva de ADN ha permitido la generación de un volumen de secuencias sin precedentes, desde el análisis de unos pocos clones a millones de secuencias, con múltiples ventajas relacionadas con los costos, rapidez, profundidad, cobertura y la posibilidad de procesar múltiples muestras al mismo tiempo (14, 15). Además, se ha impulsado el diseño de herramientas bioinformáticas que permiten procesar millones de secuencias desde su filtración hasta la asignación taxonómica de esta información (1, 16). De ahí que, dichas tecnologías han sido aprovechadas en estudios como los del Human Microbiome Project, Earth Microbiome Project, TerraGenome Project y del Marine Microbial Genome Sequencing Project (17, 18). Estos buscan ayudar entender el rol de los microorganismos en los diferentes hábitats desde el propio cuerpo humano hasta todo el planeta. Específicamente, se busca la integración de la información de miles de muestras incluyendo variables temporales y espaciales para revelar patrones a gran escala acerca del comportamiento de las comunidades microbianas.
3 2. MARCO TEORICO
2.1. Efecto de los métodos de extracción de ADN y la purificación sobre la estimación de
la estructura de las comunidades microbianas
2.1.1. Estudios de diversidad microbiana y sesgos de los métodos utilizados
Las bacterias constituyen un gran componente de la biomasa y de la diversidad en la Tierra y de igual forma se reconoce su importante papel para el mantenimiento de la vida y los ciclos biogeoquímicos (22, 23). Sin embargo, no se conocen todos los factores que alteran la diversidad, la composición y la estructura de la comunidad microbiana (24). Aunque se ha escrito mucho sobre la revolución que ha generado la introducción de métodos moleculares a los estudios de ecología microbiana, se reconoce que estos métodos tienen diversos sesgos. La complejidad de estudiar la diversidad microbiana se debe primero a factores objetivos como la heterogeneidad espacial, alta diversidad y clasificación taxonómica y segundo a factores metodológicos como la dificultad de cultivar microorganismos (25). Dentro de estas limitaciones se encuentra la heterogeneidad con la que se distribuyen las comunidades en el suelo, lo que conlleva a la necesidad de un buen diseño de muestreo. Estos muestreos deben cubrir los micro hábitats o “hotspots” donde se encuentran diferentes organismos (26). Una de las mayores limitantes hace referencia a la ambigüedad taxonómica, ya que la plasticidad genética de las bacterias permite que el ADN sea intercambiado por varios mecanismos, dificultando la definición de especie (25). Además, los primeros estudios de diversidad se realizaron con técnicas dependientes de cultivo pero al conocerse que solo aproximadamente el 1% de los microorganismos son cultivables se debieron explorar otras técnicas como las moleculares. Sin embargo, estas técnicas moleculares dependen de varios procedimientos de los cuales se conocen múltiples sesgos.
4 2.1.2. Sesgos generados por el método de extracción de ADN de suelo
Debido a la heterogeneidad de los suelos donde se ubican los microorganismos y de los microorganismos es necesario utilizar métodos capaces de romper estas microestructuras. Existen dos aproximaciones, extracción directa donde la células se rompen en el suelo e indirecta donde se retiran las células del suelo y se rompen (30). Los métodos de extracción directa son más usados, sin embargo cada uno tiene sus ventajas y desventajas. Los métodos de extracción directa son más rápidos y pueden extraer entre 10-100 veces más ADN (31). Mientras que los métodos de extracción indirecta obtiene ADN de mejor calidad en términos de tamaño y pureza.
Dentro de los métodos de extracción directa, son usados tratamientos físicos como disrupción mecánica con perlas, el cual es considerado el mejor para la extracción de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas a diferencia de congelar/descongelar, calentamiento en microondas o maceración con nitrógeno (32–34). Para obtener mayor eficiencia en la extracción los métodos físicos han sido combinados con métodos enzimáticos. Se considera que el 90% de las bacterias del suelo pueden ser lisadas (27), posterior a la liberación de ADN este interactúa fuertemente con las partículas del suelo, mediado por los iones divalentes causando que en menos de 20 minutos 80% de este se ha adsorbido, factor que es más relevante en suelos ricos en arcilla. Por esta razón altas concentraciones de sal son utilizadas en los buffer para promover la desorción del ADN de las partículas del suelo (35). Además, la extracción de contaminantes como los ácidos húmicos, inhibidores de la reacción de la polimerasa, obliga a la purificación del ADN por medio de varios procedimientos, como gel de agarosa, cromatografía, columnas con resinas y otros más. Sin embargo, del ADN total extraído, que corresponde al 60% de ADN que puede ser recuperado, se pierde el 30% por los posteriores procedimientos de purificación (36, 37). Por lo anterior es de gran interés estudiar como todas estas limitantes en la extracción del ADN de suelo afectan la estimación de la estructura de las comunidades microbianas ya que ha sido poco estudiado.
2.1.3. Uso del gen 16S ARNr para estudios de diversidad microbiana
5 regiones variables del gen 16S ARNr. La precisión de la clasificación taxonómica de los organismos utilizando el gen 16S ARNr depende de dos aspectos: la universalidad de los primers y que tan informativa es la región específica seleccionada (40). Se ha observado que independientemente de la tecnología de secuenciación (pirosecuenciación o Illumina) la precisión es más alta si flanquean las regiones en tándem V3/V4 y V4/V5, pero por otro lado la longitud de las lecturas afecta drásticamente la precisión de las mismas. Sin embargo las regiones variables en tándem V1/V2, V2/V3, V3/V4, V4/V5, V5/V6, V6/V7, V7/V8 clasificadas a diferentes niveles taxonómicos pueden generar alta variabilidad, más específicamente a niveles de similitud del 97 % o de género. Se ha demostrado que la precisión, de cada una de las regiones en tándem, se mantiene cuando los organismos son clasificados en Filum, Clase, Orden y Familia pero disminuye drásticamente en género. Igualmente, se ha propuesto que las regiones hipervariables V3, V4 y V5 tienen una precisión muy similar a las regiones en tándem y que las regiones V1 y V9 presentan los resultados más pobres seguidos por la V7 y V8 con respecto a clasificación taxonómica de las secuencias (40). Otros estudios sugieren que la región V6 contiene información suficiente para identificar afinidad filogenética utilizando secuencias de longitud corta (41, 42).
Así mismo, se ha demostrado que la selección de los primers tiene influencia directa sobre la estimación de la estructura y composición de las comunidades microbianas. Específicamente el Filum Verrucomicrobia ha sido considerado poco abundante en los suelos. Sin embargo, la comparación entre la abundancia obtenida con set de primers diferentes, 27F/337R (0,9%) y 515F/806R (14,9%), demostró que esto se debe a la subestimación provocada por la región hipervariable seleccionada (43). Por lo tanto la selección de los primers debe estar acompañada de varios análisis, como son la cobertura y temperatura óptima. Otro de los problemas de la amplificación de las regiones hipervariables del gen 16S ARNr es la formación de artefactos. Estos han sido clasificados en heteroduplex (duplex y homoduplex), quimeras y errores de la polimerasa (21). Se ha encontrado que los errores de la polimerasa tienen el mayor efecto sobre la estimación de las comunidades microbianas, ya que una PCR de 35 ciclos aumenta en un 30% el número de secuencias únicas con respecto a una de 15 ciclos (44), conllevando a una inflación de la diversidad.
2.1.4. Sobrestimación de la diversidad
6 información descubrió que existen una gran cantidad de organismos en una baja abundancia
denominados la “biosfera rara” (45), concluyendo que la biosfera rara es dos órdenes de magnitud más grande y más diversa de lo que se creía (41). Aun así, estos estudios han sido altamente discutidos, ya que se ha encontrado que las tecnologías de secuenciación de nueva generación sobreestiman la diversidad de los filotipos raros por un error intrínseco (29). Esta sobre estimación se ha reportado mediante la secuenciación de la región V1-V2 del gen 16S ARNr de la cepa E. coli MG1655 ya que de uno y cinco OTUS teóricos se han obtenido 643 y 16 a una similitud de 100 y 97% respectivamente (46). Igualmente la secuenciación de la región V6 del gen 16S ARNr de una cepa de E. coli puede representar entre 775 y 15000 OTUS a un 100% de similitud (47). Basándose en análisis bioinformático es posible depurar las lecturas obtenidas durante la secuenciación, eliminando aquellas que puedan causar una sobre estimación en la diversidad (46). Se considera que es importante eliminar aquellas secuencias únicas (singletons) producto de los errores intrínsecos de la secuenciación (29, 46). Del mismo modo se ha propuesto conservar aquellas secuencias que estén representadas por más del 0,005% en la abundancia total de las secuencias (48). Por lo anterior se ha llegado a la conclusión que existen algunos parámetros bioinformaticos para filtrar las lecturas. Estos parámetros son la calidad de cada base, el número de bases consecutivas consideradas de buena calidad, bases sin resolver (N), errores en los adaptadores o códigos de barras y lecturas de tamaños irregulares y eliminación de artefactos.
2.1.5. Herramientas bioinformáticas
7 filogenéticos, además de algunos análisis estadísticos y visualización gráfica de los resultados (Figura 1). Otro gran avance aplicado en esta herramienta ha sido la construcción de tablas de
[image:21.612.86.524.314.606.2]formato BIOM (The Biological Observation Matrix) (55) con la finalidad de representar de forma sencilla y estandarizada las muestras biológicas con sus respectivas observaciones en tablas de contingencia. Además, dentro de la herramienta se incluye el método UniFrac (56) diseñado para calcular las distancias entre comunidades microbianas basado en la información filogenética. Unifrac puede ser usado para determinar las diferencias significativas, teniendo en cuenta la ausencia/presencia (Unweighted) o abundancia (Weighted) de los OTUS, de múltiples comunidades microbianas usando métodos de ordenamiento o agrupamiento (57). El desarrollo e implementación de estas herramientas computacionales permite el análisis de millones de secuencias de alta calidad obtenidas en la nueva era de la secuenciación masiva.
8 2.2. Efecto del uso de suelo sobre la diversidad microbiana en suelos del Valle del Cauca
2.2.1. Efecto de la actividad agrícola sobre la calidad del suelo
La actividad agrícola puede conllevar a procesos de degradación del suelo. Dentro de estos procesos se encuentra la perdida de materia orgánica, erosión, inundaciones, salinización, deslizamientos, compactación y contaminación (3). Estos procesos se presentan en el manejo convencional del suelo ya que involucran arado, manual o con maquinaria pesada, y aplicación de agroquímicos, lo que conduce a la degradación física, química y biológica de los suelos, afectando su fertilidad y sostenibilidad a largo plazo (4–6). Debido al establecimiento de cultivos, se reduce la entrada de materiales orgánicos (p.e., hojarasca, ramas, raíces) provenientes de árboles o arbustos, disminuyendo el ingreso de nutrientes al suelo y consecuentemente se generará una pérdida del contenido de carbono orgánico y nitrógeno total (9, 10). Así mismo, las prácticas de arado generan disminución del contenido de carbono orgánico del suelo, por lo cual se genera una alta dependencia de fertilizantes orgánicos e inorgánicos, lo que aumenta los costos para la producción (5). La pérdida del carbono orgánico, sumado a una menor cobertura de las raíces, profundidad de las mismas y presión física por el pisoteo constante del ganado, en sistemas de ganadería, produce cambios en la estructura del suelo; generando compactación, disminución en la estabilidad de los agregados, en la porosidad total del suelo, la aireación, la capacidad de infiltración, lo que acelera los procesos de erosión deteriorando la calidad y fertilidad del suelo (11, 12).
9 2.2.2. Sistemas agroecológicos alternativos
Los sistemas silvopastoriles intensivos, desarrollo colombo-mexicano (8), combinan árboles, arbustos y pasturas que tienen beneficios importantes tanto en la conservación del suelo, reciclaje de nutrientes, aumento de la biodiversidad y ofrecen beneficios económicos adicionales. La introducción de árboles en las zonas de pastoreo mejoran la productividad de las pasturas, ya que los árboles extraen agua y nutrientes desde los horizontes del suelo inaccesibles para los pastos (9). El aumento de la biomasa incrementa la fijación de carbono y la biomasa vegetal que se reintroduce al suelo. La ausencia de labranza, mejora la estructura y la porosidad del suelo aumentando la aeración e infiltración de agua. La disminución del número de cabezas de ganado por ha disminuye el efecto del pisoteo. Los árboles también pueden proporcionar beneficios directos, económicos, en forma de productos como frutas, leña, forraje y madera. Finalmente los árboles brindan sombra y diversifican los alimentos para el ganado (p.e. mayor proteínas) lo que puede mejorar la productividad, especialmente de la leche y carne (61). Este tipo de sistemas son considerados por la FAO de gran importancia para la mitigación del cambio climático y aprovechamiento de los beneficios ambientales (62).
Por otro lado el manejo ecológico de los cultivos de caña de azúcar implica la no quema y reciclaje de los residuos, los cuales pueden ser utilizados como fertilizante y el corte manual de las cañas evitando la compactación por el peso de la maquinaria (63, 64).
2.2.3. Factores ambientales que afectan las comunidades bacterianas
10 Por ejemplo, estudios intercontinentales, realizados con 98 muestras de suelo con alta variabilidad fisicoquímica han sugerido que aquellos suelos con propiedades ambientales similares presentan comunidades bacterianas parecidas, sin importar la distancia geográfica. Además que, el pH resalta como un factor de gran importancia que influye la composición y asentamiento de las comunidades bacterianas (65–71). Así mismo, la saturación y disponibilidad de agua ha sido asociada a una disminución en la abundancia de hongos y bacterias Gram negativas y al aumento de bacterias Gram-positivas, sulfato reductoras y bacterias anaerobias (72). De igual manera, la actividad agropecuaria como la adición de fertilizantes nitrogenados tiene un mayor efecto sobre aquellas poblaciones bacterianas nitrificantes y desnitrificantes, o poblaciones que crecen rápidamente en presencia de altas concentraciones de fuentes de nitrógeno inorgánicas (73). Sin embargo se ha demostrado que la concentración de nitrógeno tiene mayor influencia sobre las comunidades en la superficie del suelo, mientras que el carbono la tiene en suelo más profundo (74) . También, se ha encontrado que las bacterias anaerobias, reductoras de sulfato, sulfuro y metales pertenecientes a Firmicutes y Proteobacteria están altamente asociados a la textura y compactación (75, 76). Es más se ha identificado que cambios en la cobertura vegetal, bosques a pasturas convencionales, producen discriminación en el tipo de comunidades microbianas que allí se establecen (71, 77–79).
11 Tabla 1. Factores ambientales que influyen sobre la estructura, composición y diversidad de las comunidades bacterianas edáficas en suelos nativos (bosque, pastizal, desierto) y en suelos con actividades agrícolas y agropecuarias (suelos con diferentes manejos).
Factor ambiental Referencias
Textura del suelo (68, 77, 80)
pH
(65–71)
Tipo de vegetación (71, 77–79)
Carbono, Nitrógeno (65, 71, 81, 82)
Humedad (72, 83–85)
Temperatura y precipitaciones
(85–87)
Agregación del suelo (88)
Nutrientes (P, Ca, Mg) (82, 89, 90) *Tomada de Cubillo; 2012.
2.2.4. Perturbaciones en los procesos ecosistémicos
12 intensidad del pastoreo y la fijación de nitrógeno por la carga animal de ese tipo de sistemas (86). Además, estos cambios fueron acompañados por perturbaciones a las comunidades microbianas más específicamente la de los hongos. Más aun, Horz y colaboradores (97) demostraron que las bacterias nitrificantes se ven afectadas por cambios en el CO2 atmosférico, fijación de nitrógeno, precipitaciones y temperatura lo que conlleva a alteraciones en el ciclo del nitrógeno.
Es más, se ha demostrado que el crecimiento de los árboles, está asociado al flujo de metano lo que influencia directamente la abundancia de grupos específicos como las bacterias metanotroficas (93). Esto cobra importancia debido a la conversión de bosques en sistemas de pasturas convencionales. En contraste, otro estudio relacionado con la diversidad microbiana involucradas en el ciclo del carbono no ha demostrado que perturbaciones en la comunidad impliquen cambios en el ecosistema (21). Lo anterior se puede explicar debido a que la degradación de materia orgánica es una función altamente redundante entre los microorganismos mientras que la nitrificación es más específica. Por lo anterior se considera que perturbaciones en las comunidades bacterianas afectaran las funciones del suelo específicas y no aquellas globales. Lo anterior se debe a la capacidad de la redundancia funcional para mantener la estabilidad y resiliencia de las comunidades microbianas en el suelo después de una perturbación, lo que contribuye al mantenimiento de los ciclos biogeoquímicos (98).
2.2.5. Indicadores de la calidad del suelos
La mala administración del suelo ha resultado en la erosión, salinización e inundación de aproximadamente 10 millones de ha por año. Por lo tanto se ha introducido el concepto “Calidad
del suelo” y “Salud del suelo” para diagnosticar el estado de este, con respecto a diferentes
factores. La calidad del suelo puede ser definida como la capacidad de funcionar como un sistema vivo y vital en un ecosistema o uso de suelo específico y la salud del suelo de ser capaz de mantener o aumentar la productividad biológica, promover la calidad del agua y del aire y mantener la salud vegetal, animal y humana (7, 91). Adicionalmente, se ha propuesto que un suelo con buena calidad deberá tener una alta diversidad y actividad biológica, un ciclaje de nutrientes adecuado y presentar resiliencia ante la aparición de un disturbio ambiental determinado que pueden ser producidos por el mismo uso de suelo (99). Sin embargo, un suelo puede tener calidad para un único uso de suelo, pero no para todos, por lo tanto la calidad del suelo se puede reducir a
13 comparación entre dos sistemas, sin embargo se ha destacado que colección de datos en diferentes periodos de tiempo permite el análisis de las dinámicas de los usos de suelo. Estas dinámicas permiten determinar la dirección y magnitud de los cambios producidos por el manejo (7). Las dinámicas de la calidad del suelo pueden ser medidas en agradación (aumento de la calidad), sostenibilidad (mantenimiento de la calidad) y degradación (disminución de la calidad) (7). Uno de los mayores avances en la determinación de la calidad del suelo ha sido la conversión de los parámetros físicos, químicos y biológicos en índices que pueden ser comparados. Estos índices están basados en la normalización de parámetros dinámicos o inherentes en escalas de valores. De ahí que, el concepto de la calidad del suelo se haya unificado para evaluar los tipos de manejo que se le dan los usos de suelo y se puedan proponer prácticas alternativas, con la finalidad de enfrentar los retos en el deterioro del ambiente.
Tabla 2. Indicadores físicos, químicos y biológicos que deben ser incluidos en un set de datos para
evaluar la calidad del suelo (Wienhold et al; 2004).
Físicas Químicas Biológicas
Textura Carbón orgánico Biomasa microbiana
Profundidad Nitrógeno total N potencialmente mineralizable
Infiltración pH Respiración del suelo
14 3. OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN
Objetivo general
Evaluar el efecto del uso del suelo sobre comunidades microbianas de sistemas de pastoreo y cultivos de caña de azúcar del Valle del Cauca.
Objetivos específicos
x Evaluar el efecto del protocolo de extracción y la pureza del ADN, sobre la estimación de la comunidad bacteriana.
15 4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Efecto de los métodos de extracción, purificación y reproducibilidad de la PCR en la
estimación de la diversidad microbiana.
4.1.1. Obtención de las muestras
Para evaluar el efecto del método de extracción, purificación y reproducibilidad de la PCR se utilizaron suelos provenientes de la reserva natural de carácter privado “El Hatico” (Valle del Cauca) con tres diferentes usos; bosque seco tropical (> 100 años de edad), sistema silvopastoril intensivo y pasturas convencionales (>30 años de establecimiento) (100). La muestra del sistemas silvopastoril correspondía a la parcela burras, 10 años de establecimiento, que fue considerada de edad intermedia en estudios anteriores (10, 11). Las muestras fueron recolectadas en el tercer evento de muestreo realizado por Cubillos (100) durante la época de lluvia de septiembre de 2010. En cada uso de suelo se estableció un cuadrante de 2.5 m x 2.5 m, a partir de los cuales se tomaron al azar 20 submuestras a 10 cm de profundidad aproximadamente, mediante el uso de barrenos. Las muestras de cada cuadrante fueron mezcladas y homogenizadas para obtener muestras compuestas de aproximadamente 500g, las cuales se depositaron en bolsas y fueron transportadas al laboratorio en neveras con hielo. De estas muestras compuestas, aproximadamente 30g fueron congelados a -80ºC para posteriores análisis. Las muestras de los usos de suelo presentaron diferente clases texturales. Además se encontraron diferencias significativas en el contenido de arcilla, arena, limo, carbono orgánico, en la densidad aparente, resistencia a la penetración y pH (Anexo A).
4.1.2. Diseño experimental
El diseño experimental se presenta en la Figura 2. De cada uno de los 3 suelos, se tomaron 12 muestras (0.25 g) para la extracción de ADN (en total, 36 muestras), seis utilizando un kit comercial
16 4.1.3. Extracción, cuantificación y purificación del ADN metagenómico
La extracción con el kit se realizó siguiendo las recomendaciones de la casa comercial
(PowerSoil™ ADN Isolation Kit MoBio), mientras que el protocolo de Griffiths se modificó en la etapa de la precipitación del ADN. En este caso el ADN fue precipitado con una concentración de 5 % de Polietilenglicol en vez de 20 %. Esta modificación se realizó de acuerdo a Arbeli & Fuentes (101) y después de la estandarización con 6 distintos suelos (Anexo B). La mitad de las muestras procesadas con cada método fueron purificadas utilizando columnas de Sefarosa 2B y Polivinil Polipropioide (101). Arbeli & Fuentes (101) utilizaron Sefarosa 4B, sin embargo, esta se modificó por 2B ya que se reportó un mejor rendimiento en la eliminación de contaminantes (36). El ADN metagenomico fue cuantificando utilizando el método fluorometrico QUBIT (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany). Otros parámetros de pureza del ADN fueron medidos mediante método espectrofotométrico (NanoDrop). Las diferencias estadísticas entre los parámetros evaluados se
comprobaron mediante una prueba de ANOVA (D =0,05) y el respectivo posthoc Tukey. Aquellos datos sin homogeneidad de varianzas se evaluaron mediante Kruskal-Wallis.
[image:30.612.91.527.387.632.2]17 4.1.4. Amplificación y secuenciación de la región V4 del gen 16S ARNr
La región V4 ha sido descrita como una buena herramienta para clasificación taxonómica, ya que presenta buena cobertura de los taxones bacterianos con pocos errores utilizando secuencias cortas como las que produce la secuenciación por Illumina (43, 102). La amplificación de la región V4 se realizó utilizando los primers 515F (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC
TATGGTAATT GT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA ‘3) y 806R
(3’CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT XXXXXXXXXXXX AGTCAGTCAG CC
GGACTACHVGGGTWTCTAAT ‘5) (39). El primer 515F contenía un adaptador para la
plataforma de Illumina, una región complementaria para el primer de secuenciación, un linker y una secuencia diana complementaria de la región conservada. El primer 806R contenía un adaptador para la plataforma de Illumina, un barcode de 12 pares de bases, una región complementaria para el primer de secuenciación un linker y una secuencia diana complementaria de la región conservada (Figura 3). Cada uno de los extractos, de los tratamientos evaluados, fue
amplificado tres veces en un volumen final de 30 μL que contenía: 10 ng ADN molde, 1X buffer, 0,2 mM de cada dNTP, 2 mM MgSO4, 0,05 μM de cada primer y 0,02 U/μL de polimerasa (Platinum Taq ADN Polimerasa High Fidelity–Hot Start, INVITROGEN). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: denaturación inicial 94°C por 3 minutos; 30 ciclos que consistieron de denaturación a 94°C por 45 segundos, anillamiento a 50°C por 60 segundos y extensión a 72°C por 90 segundos; y un ciclo de extensión final a 72°C por 10 minutos. El tamaño de los productos (350 pb) se verifico en gel de agarosa al 1,5 % P/V. Las tres amplificaciones de cada extracto fueron unificadas en un solo tubo y purificadas utilizando el kit UltraClean™ PCR Clean-up. Adicionalmente, se realizó una amplificación de cada extracto con una única reacción para evaluar el efecto de la reproducibilidad de la PCR y no la del método de extracción de ADN,
18
Forward primer
5’ AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC TATGGTAATT GT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA ‘3
Reverse primer
3’ CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT TCCCTTGTCTCC AGTCAGTCAG CC GGACTACHVGGGTWTCTAAT ‘5
Figura 3. Diseño de los primers para la construcción de los amplicones de la región V4 del gen 16S ARNr: adaptadores (rojo), barcodes y zona de hibridación de los primers (Azul), zona de hibridación de los primers de secuenciación (Amarillo), linker (Blanco) y target de la región conservada V4 (verde). Caporaso et al, 2012.
4.1.5. Ensamblaje y limpieza de las secuencias
Las 250 pares de bases de los paired-end reads (Secuencias) fueron ensambladas en su totalidad utilizando la herramienta Fast Length Adjusment of Short Reads to improve Genome Assemblies (FLASH) (103). El ensamblaje se realizó con parámetros conservativos. Durante el ensamblaje se estableció un sobrelapamiento mínimo de 240 pb y un máximo de 255 pb y un porcentaje de error de coincidencia (mismatch) inferior a 3%, permitiendo la eliminación de información de baja calidad. Las secuencias ensambladas de forma exitosa fueron filtradas según sus puntajes de calidad (q) utilizando la herramienta QIIME 1.7 (1) según los siguientes parámetros: el 90% de las bases de las secuencias debían ser de alta calidad (q>30), si se encuentran 3 bases consecutivas de baja calidad (q<30) se trunca la secuencia (r = 3) y no se permitió ninguna base ambigua (N) (n = 0) (48). De igual manera, no se permitió ningún error en las secuencias de los barcodes y se incluyeron en el análisis solo aquellos OTUS con mínimo 10 secuencias (ver siguiente numeral). Las secuencias que no cumplieron con estos parámetros fueron descartadas para posteriores análisis.
4.1.6. Análisis de diversidad.
19 calculado con UCLUST (52) utilizando la base de datos de referencia de 16S ARNr de Greengenes (105), 3) selección de una secuencia representativa de cada OTU y asignación taxonómica mediante RDP, 4) alineamiento de las secuencias mediante PyNast y construcción de un árbol filogenético usando Fastree y 5) construcción de tablas de OTU en formato BIOM (55). Los OTUS con una frecuencia menor de 10 considerando todas las muestras fueron descartados ya que pueden representar los errores intrínsecos de la secuenciación (c = 10). Las tablas fueron re muestreadas a una profundidad de 30000 secuencias por cada muestra, con la finalidad de normalizar el número de secuencias que sería utilizado para los análisis de diversidad Alfa y Beta de las muestras. Este valor se seleccionó teniendo en cuenta el mínimo número de secuencias encontrado en una muestra.
La diversidad-α se visualizó mediante curvas de rarefacción de las cuales se obtuvieron algunos índices de diversidad como riqueza, Shannon y distancia filogenética. Los índices fueron comparados mediante una prueba de t-test no paramétrica utilizando Test de Montearlo (número de
permutaciones =999 y α=0,05). Por otro lado la diversidad beta se analizó con matrices de distancias calculadas con el método de UniFrac teniendo en cuenta la ausencia/presencia y la abundancia de los OTUS (56). Las diferencias entre las comunidades microbianas se evaluaron
mediante el test no paramétrico ANOSIM (número de permutaciones =999 y α=0,05), utilizando las
matrices de distancia. Adicionalmente las diferencias estadísticas de la abundancia de los Fila se evaluó mediante ANOVA y un t-test paramétrico (corregido mediante Bonferroni y α=0,05), utilizando la herramienta STAMP 2.01.
4.2. Efecto del uso del suelo sobre la diversidad microbiana
4.2.1. Diseño experimental y muestreo de suelo con diferentes usos
20 A partir de cada uno de los sistemas se tomaron 30 submuestras a una profundidad de a 10-15 cm. Las muestras se recolectaron en septiembre de 2012 durante la época seca del año. El muestreo en
el municipio del Cerrito se llevó a cabo dentro y a los alrededores de la reserva natural “El Hatico”
(N 3° 38' 39'', W 76° 19' 12''), la cual presenta una extensión de 288 ha y se encuentra a una altitud de 1000 msnm. La zona presenta precipitaciones que alcanzan valores medios anuales de 850 mm, distribuidas en forma bimodal (marzo a mayo y octubre a noviembre). La temperatura promedio es de 24°C y presenta una humedad relativa del 75% (100). El muestreo en el municipio de Buga la grande se realizó dentro y a los alrededores de la finca agroecológica “La Lucerna” (N 4° 14' 54'', W 76° 8' 40''), la cual se encuentra a 941 msnm, un promedio anual de precipitaciones de 1.166 mm y una temperatura media anual de 23 °C. Según la clasificación de Holdridge, las fincas del Hatico y la Lucerna están localizadas en la zona biogeografía de bosque seco tropical, lo que indica la transformación que allí se ha llevado a cabo.
[image:34.612.168.434.322.559.2]21 4.2.2. Bosque seco tropical
El bosque seco tropical de más de más de 80 años de edad, ocupa 14 ha en la finca el Hatico ubicada en El Cerrito. Las plantas dominantes que allí se encuentran son: Anacardium excelsum, Xylopia ligustrifolia, Ficus sp., Cecropia sp., Bombacopsis sp., Myrcia popayanensis y Ceiba pentandra. El bosque fue dividió en tres franjas, desde la zona sur hasta la zona norte, para así obtener tres muestras como en los demás sistemas. Sin embargo, se debe aclarar que estas replicas no se encontraban separadas físicamente puesto que no se contaban con tres sistemas de bosques diferentes.
4.2.3. Pastura convencional
Las pasturas convencionales muestreadas en El Cerrito y Buga la grande están compuestas de monocultivos de pastos los cuales en época de lluvia reciben adiciones de fertilizantes del tipo NPK combinado con estiércol y se aplican herbicidas como Picloran para controlar malezas. Las pasturas se encontraban en descanso del pastoreó de toro de Lidia (El Cerrito) y ganado lechero (Buga la Grande). Las muestras fueron tomadas fuera del dosel de los arboles presentes en el terreno en baja densidad recorriendo el terreno en zigzag y muestreando cada 10 metros.
4.2.4. Sistema silvopastoril intensivo
22 Tabla 3. Muestras de diferentes usos de suelo recolectadas en el departamento del Valle
del Cauca.
Municipio Uso de suelo Nombre Coordenadas
Cerrito Sistema Silvopastoril Eles N 3° 38' 51'', W 76° 19' 23'' Cerrito Sistema Silvopastoril Burras 3 N 3° 38' 44'', W 76° 19' 20'' Cerrito Sistema Silvopastoril Palmas 3,4 N 3° 38' 49'', W 76° 19' 9'' Cerrito Pastura convencional Trejito 4 N 3° 39' 49'', W 76° 19' 42'' Cerrito Pastura convencional Trejito 6 N 3° 39' 47'', W 76° 19' 39'' Cerrito Pastura convencional Trejito 2 N 3° 39' 48'', W 76° 19' 47''
Cerrito Bosque Bosque N 3° 38' 40'', W 76° 19' 32''
Cerrito Bosque Bosque N 3° 38' 40'', W 76° 19' 32''
Cerrito Bosque Bosque N 3° 38' 40'', W 76° 19' 32''
Cerrito Caña agroecológica 756-2 N 3° 38' 44'', W 76° 20' 6'' Cerrito Caña agroecológica 756-3 N 3° 38' 49'', W 76° 20' 8'' Cerrito Caña agroecológica 756-4 N 3° 38' 46'', W 76° 20' 11'' Cerrito Caña convencional Santa Rosa L3 N 3° 39' 23'', W 76° 20' 31'' Cerrito Caña convencional Santa Rosa Lote L4N N 3° 39' 22'', W 76° 20' 29'' Cerrito Caña convencional Santa Rosa Lote L4S N 3° 39' 17'', W 76° 20' 29'' Buga Sistema Silvopastoril B11 N 4° 14' 44'', W 76° 8' 44'' Buga Sistema Silvopastoril B12 N 4° 14' 54'', W 76° 8' 40'' Buga Sistema Silvopastoril B2 N 4° 14' 54'', W 76° 8' 30'' Buga Pastura convencional La Isabella 7 N 4° 13' 41'', W 76° 9' 17'' Buga Pastura convencional La Isabella 8 N 4° 13' 41'', W 76° 9' 17'' Buga Pastura convencional La Isabella 4 N 4° 13' 41'', W 76° 9' 17'' Buga Caña agroecológica Suerte 27 - Tablón 1 N 4° 14' 47'', W 76° 8' 58'' Buga Caña agroecológica Suerte 26 - Tablón 1 N 4° 14' 56'', W 76° 9' 1'' Buga Caña agroecológica Suerte 25- Tablón 1 N 4° 14' 56'', W 76° 9' 5'' Buga Caña convencional Tablón Oeste N 4° 14' 37'', W 76° 8' 44'' Buga Caña convencional Tablón Este N 4° 14' 40'', W 76° 8' 40''
4.2.5. Caña de azúcar
23 cultivos. Además, los residuos cortados en el manejo agronómico convencional son quemados. Las submuestras fueron tomadas en las calles del cultivo y en el caso de la caña con manejo agroecológico únicamente en las calles que no contenían los residuos de cortes anteriores. La toma de muestras se realizó desde dos de las esquinas del cultivo avanzando diez pasos por las calles y avanzando cinco surcos para cada una de las submuestras.
4.2.6. Manejo de las muestras
Las 30 submuestras de cada uno de los suelos fueron mezcladas para obtener una muestra compuesta. A partir de la muestra compuesta se realizaron algunos análisis fisicoquímicos en el laboratorio de suelos del Instituto Geográfico Agustín Codazzi (Tabla 4). Adicionalmente, 45 g de cada una de las muestras compuestas fueron mezclados con 5 mL de agua estéril y homogenizados hasta obtener una consistencia lodosa. Dichas muestras se almacenaron a -80 °C para posteriormente realizar la extracción de ADN para los análisis de las comunidades microbianas.
Tabla 4. Métodos utilizados en el análisis de propiedades fisicoquímicas llevado a cabo en el
Instituto Geográfico Agustín Codazzi.
Análisis Método
Textura Bouyoucos
Acidez intercambiable KCl
Conductividad eléctrica Extracto de saturación
Carbón orgánico Walkley-Black
Fosforo disponible Bray II
Capacidad de intercambio cationico Acetato de amonio 1N y neutro
Nitrógeno total Kjeldahl
Nitratos y Amonio KCl 2N
[image:37.612.90.529.449.700.2]24 4.2.7. Extracción, cuantificación y amplificación de la región V4 del ADN
metagenómico de los diferentes usos de suelo
La extracción de ADN de cada uno de los usos de suelo se realizó utilizando el kit comercial
PowerSoil™ ADN Isolation Kit de MoBio según las recomendaciones del fabricante. El ADN metagenomico fue cuantificando utilizando el método fluorometrico QUBIT (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) y su integridad se visualizó en gel de agarosa al 1.5% p/v. La amplificación y secuenciación de los amplicones de la región V4 se realizó siguiendo la misma metodología utilizada en la evaluación de los métodos de extracción y purificación (ver numeral 4.1.4).
4.2.8. Análisis bioinformatico y de diversidad.
25 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Efecto del método de extracción y purificación del ADN.
5.1.1. Estandarización del protocolo de extracción
La modificación del protocolo de Griffiths permitió una mayor recuperación de ADN pero no una diferencia en la eliminación de contaminantes (Anexo B). Griffiths y colaboradores reportaron en su estudio que el protocolo utilizado permitía la obtención de ADN y ARN con la calidad suficiente para ser amplificados por PCR y utilizados en análisis de huellas moleculares (106). Sin embargo, otros autores determinaron que concentraciones menores de 10% de polietilenglicol disminuían la coextracción de ácidos húmicos con los ácidos nucleicos (101). En tal caso Arbeli y Fuentes propusieron que 5% de Polietilenglico disminuye la concentración de ácidos húmicos pero no aumenta la de ADN. Al contrario en el presente estudio si se observó mayor extracción de ADN, con 5% de polietilenglicol, pero no diferencias en la extracción de los contaminantes. Aun así, los valores de absorbancia a 340nm de los extractos finales, fueron bajos encontrándose entre 0,043 y 0,158. En esta longitud de onda no absorbe el ADN pero si algunos otros contaminantes como los ácidos húmicos. Es importante destacar que, a diferencia de Arbeli y Fuentes, los extractos obtenidos mediante el método de Griffiths antes de la precipitación eran totalmente transparentes, y son prueba de la efectividad de este método en la eliminación de contaminantes.
5.1.2.Concentración y pureza del ADN
26 del ADN. El kit de Power Soil permitió la extracción, en promedio, de 25% de ADN más que el método de Griffiths, pero ambos presentaron valores similares en los parámetros de calidad del ADN. Esta diferencia en el rendimiento puede deberse a que el método de disrupción física de Power Soil, fue estandarizado para separar las partículas del suelo, disolver los ácidos húmicos y proteger los ácidos nucleicos de la degradación. Igualmente, el protocolo de Griffiths fue estandarizado para la rápida coextacción de ADN y ARN para análisis de comunidades microbianas (106). Además, los dos protocolos utilizan diferentes materiales y tamaños de perlas para el tratamiento físico, siendo de mayor tamaño las de Power Soil con respecto a las utilizadas en el método de Griffiths.
En la literatura no se encuentra una clara ventaja de los métodos comerciales con respecto a los caseros ya que en múltiples comparaciones algunas veces unos u otros son considerados mejores (19, 107–109). El protocolo de MoBio cuenta con la patente Inhibitor Removal Technology® la cual consiste en la mejora de la remoción de ácidos húmicos, proteínas y otros contaminantes que pueden inhibir la reacción de la polimerasa (108). La efectividad de esta tecnología se ha comprobado al comparar diferentes métodos comerciales, dando como resultado que el kit Power Soil obtiene los mejores parámetros de calidad del ADN con diferentes tipos de suelo (110). Además, es utilizado en proyectos a nivel mundial como el Earth Microbiome Project donde colaboran múltiples grupos de investigación (111). Por el contrario, el método de Griffiths utiliza reactivos comúnmente utilizados en muchos protocolos de extracción de ADN como Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB), Fenol-Cloroformo-Isoamilalcohol y Cloroformo-Isoamil-Alcohol (19, 112, 113). Estos reactivos son utilizados para eliminar las proteínas, polisacáridos, contaminantes orgánicos y ácidos húmicos. Los dos métodos de extracción permitieron la amplificación de 250 pb de la región V4 del gen 16S ARNr de todos los extractos de cada uno de los suelos sin necesidad de una purificación adicional, lo que confirma la efectividad en la eliminación de algunos contaminantes inhibidores de la polimerasa.
27 absorbancia a 260 nm. Además, con respecto a la relación 260nm/280nm se observó que los dos métodos de extracción tienen valores cercanos a dos, sin diferencias significativas (p>0,05) lo que indica que hay baja concentración de proteínas con respecto a la de ADN (Tabla 5). Tanto las muestras purificadas como sin purificar presentaron las características adecuadas para la posterior amplificación de los fragmentos de la región V4.
Tabla 5 Concentración y pureza del ADN metagenomico extraído con dos métodos con o sin purificación de las muestras. Las letras representan la formación de grupos con diferencias significativas (p<0,05)
Muestra Método Purificado ADN (ng/uL) A260nm/280nm A340nm
Bosque
Power Soil
No 45,63 (± 1,21)a 2,02 (± 0,01) 0,075 (± 0,23 )
Si 21,57 (± 2,06)b 1,77 (± 0,43) 0,044 (± 0,04 )
Griffiths
No 25,57 (± 3,01)b 2,03 (± 0,05) 0,091 (± 0,03 )
Si 16,70 (± 1,18)c 2,17 (± 0,21) 0,098 (± 0,08 )
Sistema
silvopastoril
Power Soil
No 31,36 (± 3,96 )a 1,99 (± 0,05) 0,158 (± 0,11 )
Si 19,20 (± 0,87)b 2,34 (± 0,39) 0,050 (± 0,02 )
Griffiths
No 36,17 (± 5,41)a 1,93 (±0,15) 0,115 (± 0,03 )
Si 18,21 (± 1,72)b 2,38 (±0,21) 0,043 (± 0,17 )
Pastura
convencional
Power Soil
No 46,06 (± 6,01)a 1,98 (± 0,05) 0,074 (± 0,02)
Si 28,50 (± 1,15)b 2,28 (± 0,23) 0,053 (± 0,02 )
Griffiths
No 30,43 (± 2,21)b 1,93 (±0,04) 0,076 (± 0,01 )
Si 19,07 (± 1,97)c 2,19 (±0,16) 0,054 (± 0,01)
28 tiempo de elución de los ácidos nucleicos y aumenta el de los ácidos húmicos con respecto a la Sefarosa 4B Y 6B (36). En este estudio se perdió aproximadamente 10% del ADN y se eliminó 90% de los ácidos húmicos. Se esperaba que esta nueva mezcla de Sefarosa 2B y PVPP permitiera un mayor rendimiento en la eliminación de los contaminantes, sin embargo esto no pudo ser observado probablemente por la eficiencia de los métodos de extracción de ADN ya que la máxima absrobancia a 340 nm fue de 0,150.
5.1.3. Calidad ensamblaje y filtración de las librerías de la región V4
Se prepararon 72 librerías de la región V4 del gen 16S ARNr que correspondían a muestras de sistemas silvopastoriles, pasturas convencionales y bosque extraídas con dos métodos diferentes y con y sin purificacion. La mitad de esta librería correspondía a las réplicas para la evaluación del efecto de la PCR. Se determinó que la mezcla de las librerías contenía 29,9 ng/uL de ADN con un pico de tamaño aproximado de 300-500 pb determinado mediante el BioAnalyzer mientras que en el gel de agarosa se observó que el tamaño de las librerías era de alrededor 400 pb. Mediante ambos métodos se confirmó que el tamaño de los amplicones (aproximado de 400 pb) es cercano al valor teórico esperado (419 pb). Además, se observó que las muestras contenían, en menor concentración, ADN de tamaño aproximado a 35 pb y a 10380pb. Estos picos corresponde probablemente a los primers y ADN metagenomico, respectivamente (Figura 5).
29 p = 0.9 r = 3 y n = 0) se eliminaron las siguientes cantidades de secuencias: 3900 que no contenían barcodes, 791.795 que excedían los errores permitidos en los barcodes, 160.192 que eran muy cortas (<220) después de ser truncadas debido a que más de 3 bases presentaban baja calidad y 73 que contenían bases no resueltas (N). Finalmente, se obtuvieron 7.232.405 secuencias de alta calidad de las cuales el 99% tenían una longitud de 249 pb (valor teórico esperado) mientras que el porcentaje restante una longitud entre 259 y 229 pb.
Figura 5. Tamaño de los amplicones de la región V4 del gen 16S ARNr evaluado mediante gel de agarosa (B) y BioAnalyzer (A).
30 que se recomienda que este sea laxo si los parámetros previos no lo fueron. Este parámetro permitió la eliminación de 15.649 OTU que correspondían a secuencias únicas (singletons) que pueden ser producto de errores en la secuenciación como han sido reportado en otros estudios (46) (41), o parte
de la “biosfera rara” (29). Finalmente se mantuvo un set de 30.000 secuencias por muestra, mayor numero que en otros estudios utilizando Pirosecuenciación, corresponde al número mínimo de secuencias en una muestra. Este valor depende totalmente de los parámetros de la corrida de secuenciación, como son el número de muestras y la influencia de la química de la tecnología. Este número de secuencias permitió una buena cobertura ya que en las curvas de rarefacción se observa el inicio de la formación del plató o saturación de la curva. En otros estudios se han utilizado desde 16.000 hasta 141.000 secuencias por muestra lo que indica que este valor es único por estudio (116, 117).
Con relación a los métodos de secuenciación se debe destacar que la plataforma MiSeq de Illumina utilizada en el presente estudio tiene una mayor profundidad comparada con la Pirosecuenciacion, ~25 millones de secuencias por corrida comparado con ~1 millón de secuencias respectivamente (14, 15). Igualmente, la plataforma de mayor profundidad existente hasta el momento pertenece a Illumina, Hiseq2500, la cual produce ~2 billones de secuencias por corrida. Es importante destacar, que la baja profundidad de las plataformas de Roche, comparadas con las de Illumina, se ve balanceada por la longitud de sus secuencias. Pirosecuenciación produce lecturas de ~1000 pb mientras que las plataformas de Miseq Illumina <300pb y Hiseq ~100 pb (última actualización, 2014). En nuestro parecer, la plataforma de Miseq es una herramientas adecuada para la secuenciación de amplicones ya que permiten la obtención de una alta profundidad, el ensamblaje del amplicon, una buena clasificación taxonómica y el aumentando de la confianza en los datos
5.1.4. Efecto de la extracción y purificación de ADN y la reproducibilidad de la PCR en la discriminación de comunidades
31 sobre la detección de OTUS específicos. Por otro lado, este mismo análisis con matrices basadas en la abundancia de los OTUS, que explica 77,3% de la varianza (Weighted Unifrac), no permite diferenciar claramente entre los sistemas ya que las muestras se separan dependiendo del método de extracción, pero no de la purificación. Dentro de estos análisis se incluyeron las muestras amplificadas con el protocolo alternativo y se observó que no se ve una separación de la misma ni alta variabilidad tanto con las matrices de ausencia/presencia y de abundancia, indicando que la amplificación de PCR es reproducible.
Figura 6. Distancias de las comunidades microbianas calculadas mediante Pairwise-Unifrac tanto
en matrices de ausencia/presencia (A) y abundancia (B) visualizadas en una gráfica de componentes principales (PCoA), la varianza explicada se denota entre corchetes al lado de cada eje.
Adicionalmente en la (Figura 6) se incluyen las réplicas de la PCR que fueron amplificadas una vez sin ser mezcladas. Esta figura permite deducir que la reproducibilidad de la PCR no tiene efecto sobre la estimación de la diversidad microbiana. Se observa que las muestras se agrupan dependiendo del uso del suelo. A pesar, de que algunos reportes indican que los errores de la PCR como formación de artefactos heteroduplex y quimeras (21, 44) son comunes, estos no influyen en la diferenciación de comunidades provenientes de diferentes usos de suelo. Sin embargo, la
32 preparación de las librerías para secuenciación masiva de ADN aconseja la mezcla de tres reacciones por muestra para evitar este tipo de errores.
Tabla 6. Índices de riqueza expresada en número de OTUS únicos y diversidad obtenida de diferentes usos de suelo con dos métodos de extracción de ADN y efecto de la purificación de las muestras. Se muestra el promedio ±1ds. No se encontraron diferencias significativas entre los valores.
Índice Método
Muestras
Bosque Sistema Pastura
Silvopastoril convencional
OTUS Únicos (97% similitud)
Power Soil 2.936 (± 45) 3.767 (± 113) 2.599 (± 27) Power Soil - purificado 2.846 (± 129) 3.688 (± 155) 2.610 (± 22) Griffiths 2.484 (± 45) 3.569 (± 90) 2.358 (± 53) Griffiths - purificado 2.465 (± 64) 3.653 (± 108) 2.365 (± 13)
Shannon
Power Soil 9,827 (± 0,041) 9,269 (± 0,177) 9,269 (± 0,066) Power Soil - purificado 9,76 (± 0,031) 9,058 (± 0,216) 9,058 (± 0,064) Griffiths 9,231 (± 0,042) 9,633 (± 0,060) 9,633 (± 0,042) Griffiths - purificado 9,193 (± 0,069) 9,602 (± 0,127) 9,602 (± 0,037)
5.1.5. Efecto de la extracción y purificación sobre la estimación de la diversidad
Ș y ș
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